JP2011505012A - 血液中の循環黒色腫細胞の自動計数及び特徴付け - Google Patents

Abstract

セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは、血液中の循環黒色腫細胞を計数するシステムを提供する。このシステムは、免疫磁気的に上皮細胞を濃縮し、蛍光的に細胞を標識し、循環黒色腫細胞を識別し定量化する。腫瘍を有する場合に末梢血に検出される循環黒色腫細胞の絶対数は、部分的に、生存率の予測、病状進行の時間、及び治療に対する反応における因子である。黒色腫の診断及び監視は、循環黒色腫細胞を監視できないために制限されてきた。本発明は、血液検体の循環黒色腫細胞を計数する方法を提供する。結果として、本技術は、黒色腫をもつ患者の疾患進行を監視するための手段及び装置を提供する。

Description

開示の内容

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許仮出願第６１／００４，３４５号（２００７年１１月２７日出願）に対する優先権を主張する非仮出願である。上記の出願は、参照により全文が本明細書に組み込まれる。

〔背景〕
〔発明の分野〕
本発明は概して、形態学的に完全な形状の、血液中の循環黒色腫細胞（ＣＭＣ）の存在に基づき、癌患者の疾患進行を監視及び評価することに関する。より具体的には、患者において循環黒色腫細胞の評価を行うための方法、試薬及び装置について記述される。循環黒色腫細胞は、約５〜５０ｍＬの抹消血内の１つ又は２つの循環腫瘍細胞を分離及び画像化するために確立された感度の高い方法によって測定される。腫瘍細胞数のレベル及び腫瘍細胞数の増加が、転移性黒色腫をもつ患者の監視手段を提供する。

〔背景技術〕
進行した黒色腫の治療は、その異質組織病理学、及び腫瘍進行中に蓄積される構成の変化によって複雑なものとなっている。転移性乳癌又は結腸直腸癌の患者の循環腫瘍細胞の計数及び特徴付けは、臨床的に重要性の高い独立した予後及び予測情報を提供することが示されており、患者管理の監視に使用することができる。

循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発癌（治癒が可能な疾患段階）と転移性疾患（多くの悪性腫瘍において死亡の主要因であり続けている）との間の重要な関連を示してきた。臨床研究により、ＣＴＣは転移性乳癌において予後及び予測の強力なバイオマーカーであることが示されており、前立腺癌及び結腸直腸癌においても同様の結果が報告されている。これらのデータは、ＣＴＣが、潜在する生物学的促進性転移性癌を表わすことを示しており、これらの細胞を更に細胞分析及び分子分析することにより、転移の分子調節及び治療に対する反応について、新しい洞察を明らかにできることを示唆している。

転移におけるＣＴＣの役割に関する研究、並びに薬物動態学的及び薬力学的研究におけるバイオマーカーとしてのそれらの利用拡大は、薬剤開発の臨床試験段階に限定されてきた。多くの癌患者は、原発腫瘍によって死亡するのではなく、転移によって死亡することが広く認識されており、広がった複数の腫瘍コロニーは、元の腫瘍から分離し、体内を（しばしば遠い部位まで）移動した悪性細胞によって形成される。癌において最も好結果が得られる治療戦略は、器官内に留まっているうちに、腫瘍を早期に発見し外科的に除去することである。癌の早期発見は、特に、子宮頸癌のパップスメア検査、乳癌のマンモグラフィー、及び前立腺癌の血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの適切な診断検査が存在する場合、一部の癌については実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期段階に発見された癌は、多くの場合、外科的切除の前に微小転移が起こっている。このように、癌の悪性潜在性を早期かつ正確に検出することが、適切な治療法を選択する際には重要である。

原発腫瘍が十分早期に発見されていれば、外科手術、放射線、若しくは化学療法又は幾つかのこれらの治療の組み合わせによって除去することが可能であることが多い。残念なことに、転移コロニーは発見及び除去が難しく、しばしば、すべてのコロニーを完全に治療することは不可能である。したがって、転移は癌の自然な進行において最終的な事象であると見なすことができる。更に、転移能力は、悪性腫瘍を固有に特徴付ける特性である。

ＨＥＲ−２／ｎｅｕの増加は、ホルモン治療に対する反応の低下をもたらし、これは、ホルモン受容体陽性の転移性乳癌に対する反応の予測において、顕著な予後因子である。このように、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍形成遺伝子生成物が関連する悪性腫瘍において、濃度増加に基づいて治療監視又はリスク評価を行う方法が記述されている（米国特許第５，８７６，７１２号）。しかしながら、緩解状態、又はたとえ健康な標準状態においても、基準濃度が比較的高く、患者に見出される濃度に重なり合うことがあるため、患者依存性の基準及びカットオフ濃度を確立するために複数の検査及び監視が必要となる。

前立腺癌においては、血清中のＰＳＡ濃度が早期発見に有用であることが証明されている。ＰＳＡ試験は、追跡健康診断及び生検と共に使用することにより、前立腺癌の早期段階（治療に最適）での発見を改善している。

血液中の無傷の腫瘍細胞を検出することにより、原発腫瘍の切除を受けた癌患者における転移性疾患の再発に対する直接的な関連性が提供される。残念ながら、悪性細胞の同じ広がりは、従来の腫瘍段階判別手順では依然として見逃される。最近の研究で、癌患者の骨髄内の１つの癌細胞の存在が、転移性再発の独立した予後因子であることが示されている（Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G.,Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis. J Clin Oncol,10:1534-1539,1992）。しかしながら、これらの侵襲的手法は、血中に散った上皮腫瘍細胞を検出するのに比べ、日常的処置又は複数回実施する臨床検査としては望ましくないか、又は受け入れられないと考えられる。

別のアプローチは、免疫磁気分離技術を取り入れ、無傷の循環癌細胞の明白な検出という点で、より大きな感度と特異性を提供している。記述されているように（米国特許第６，３６５，３６２号、同第６，５５１，８４３号、同第６，６２３，９８２号、同第６，６２０，６２７号、同第６，６４５，７３１号、国際特許第ＷＯ０２／０７７６０４号、同第ＷＯ０３／０６５０４２号、同第ＷＯ０３／０１９１４１号）、この単純ながら感度の高い診断ツールは、ＣＴＣを計数するための前臨床動物モデルを提供するために、本発明において使用されている。

この診断ツールを使用して、癌患者からの血液検体（国際特許第ＷＯ０３／０１８７５７号）は、上皮細胞表面抗原、例えばＥｐＣＡＭ、に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズと共にインキュベートされる。抗ＥｐＣＡＭコーティングされた磁気ナノ粒子で標識した後、磁気的に標識された細胞は、磁気分離器を使用して分離される。免疫磁気的に濃縮された画分は、下流の免疫細胞化学的分析又は画像サイトメトリー（例えば、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム（ヴェリデックス社（Veridex LLC）、ニュージャージー州））用に更に加工される。この磁気画分は、下流の免疫細胞化学的分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、フローサイトメトリー、又はその他のタイプの画像サイトメトリーに使用することもできる。

セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは、免疫磁気的な選択及び分離を利用し、全血検体に存在する任意の上皮細胞を高度に濃縮（enrich and concentrate）することができる。捕捉された細胞は、検出可能なように、白血球特異性マーカーと、１つ以上の腫瘍細胞特異性蛍光モノクローナル抗体とで標識され、これにより捕捉されたＣＴＣの識別及び計数が可能になり、機械的又は視覚的に明確に標的外細胞の混入と区別することができる。この検査により、腫瘍質量が少ない早期段階においても、腫瘍細胞の検出が可能になる。本発明の実施形態は、このセルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムに限定されるものではなく、匹敵する感度及び特異性を有する任意の分離及び画像プロトコルが含まれる。

現在使用可能な技術は、転移性黒色腫癌の進行評価の際に、ＣＭＣを繰り返し監視するための一貫して信頼性のある手段を実証していない。このように、黒色腫だけでなく、概して転移性癌における転移潜在性のある癌細胞の正確な検出に対する明らかなニーズが存在する。加えて、このニーズは所与の患者にとって最も有効な治療を選択するというニーズによって更に強調される。

黒色腫及びその他の癌のＣＭＣを繰り返し監視できないことが、採血から取得されたＣＭＣの分析を制限してきた。その結果、腫瘍進行中のＣＭＣにおける一時的な変化などの疾患進行の特徴の研究、及び関連した治療が確立されていない。しかしながら、ＣＴＣを検査するのにこの技術を使用すれば、ＣＴＣの評価を前臨床並びに臨床研究に組み込むことが可能になる。これらの細胞についての特異的分子マーカーの更なる特徴付けにより、標的を絞った治療のための「コンパニオン」となる診断用検査の早期開発が可能になり、これにより、新しい検査プロトコルを患者での臨床試験に、ひいては臨床診療に移行させるのが加速され得る。

〔発明の概要〕
本発明は、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムなどの臨床分析ツールを取り入れた、黒色腫をもつ患者の血液中の循環黒色種細胞（ＣＭＣ）の捕捉及び検出のための自動的方法を提供し、また転移性癌をもつ患者の循環上皮細胞の絶対数、変化、又はその両方の組み合わせに基づく。システムは、免疫磁気的に上皮細胞を濃縮し、細胞を蛍光標識し、黒色腫の陽性計数用にＣＭＣを識別し定量化する。

ヒト腫瘍細胞として捕捉された対象物を確認するのに使用されるセルトラックス（CellTracks）（登録商標）蛍光分析プロファイル。チェックマークは、合成画像に基づく陽性腫瘍細胞を意味する。合成画像は、上皮細胞マーカー（ＥＣ−ＰＥ）及び核染料（ＮＡＤＹＥ）の陽性の選択から得られる。白血球マーカー（Ｌ−ＡＰＣ）及び対照（ＣＮＴＬ）については陰性の選択も必要。

〔発明の詳細な説明〕
血液中のＣＴＣを分離、濃縮、及び分析するための、いかなる効果的なメカニズムも適切であるが、循環腫瘍細胞を採取するための１つの方法では、最初の血液採取の後、免疫磁気的濃縮技法、免疫蛍光標識技法を、適切な分析プラットフォームと組み合わせる。付随する検査は、全血の検体中のこれらの希少細胞を検出するため、並びに上皮由来の悪性腫瘍における疾患の臨床経過におけるこれら細胞の役割を調べるための、感度及び特異性を有していることが示されている。希少細胞は、動物モデルにおける疾患進行のモデリングにおいてそれらを採取及び使用することが可能になるような感度及び特異性をもって、全血の検体から検出される。

循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、検出可能な量で血液中に存在することが示されている。これにより、癌患者の末梢循環における上皮由来細胞の重要性を調べるためのツールが製作された（Racila E., Euhus D., Weiss A.J., Rao C., McConnell J., Terstappen L.W.M.M.and Uhr J.W.,Detection and characterization of carcinoma cells in the blood,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589-4594(1998)）。この研究では、これらの血液由来細胞が、癌の病理生理学において重要な役割を有している可能性が示された。患者血液５ｍＬあたり上皮細胞１つの検出感度を有するこの検査には、検体の迅速かつ感度の高い分析のために、免疫磁気検体濃縮及び蛍光モノクローナル抗体染色、続いてフローサイトメトリーが組み込まれた。

以前は、ヒト血液検体から循環上皮腫瘍細胞を分離及び計数するために、セルサーチ（CellSearch）（商標）システム（ヴェリデックス社（Veridex LLC）、ニュージャージー州））が使用されていた^２。これは、磁気ビーズに結合させた上皮細胞接着分子に対する抗体を用いて、上皮細胞を濃縮する自動システムである。次に、分離した細胞を蛍光核酸染料４，２−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色し、有核細胞を識別する。続いて、回収された細胞をＣＤ４５（ＡＰＣチャンネル）及びサイトケラチン８、１８、１９（ＰＥチャンネル）に対する蛍光で識別されたモノクローナル抗体で染色し、上皮細胞と白血球とを区別する。次に、有核上皮細胞を循環腫瘍細胞として定量化する。標準のセルサーチ（CellSearch）（商標）検査の一部ではないＦＩＴＣのための追加の蛍光チャンネルが存在し、これを腫瘍細胞の更なる特徴付けに使用することができる。

実施例に示されるように、この検査は、画像サイトメトリー分析のために更に構成され、これにより免疫磁気的に濃縮された検体が、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムによって分析される。これは、蛍光ベースの顕微鏡画像解析システムであり、フローサイトメトリー分析とは対照的に、事象の視覚化を可能にし、更に対象物を識別するために形態学的特徴の評価を行う。

ＣＤ１４６（ＭＵＣ１８、ＭＣＡＭ、Ｍｅｌ−ＣＡＭ及びＳ−Ｅｎｄｏ−１としても知られる）は、限定された組織分布を有する膜貫通糖蛋白質であり、内皮細胞、平滑筋細胞、濾胞樹状細胞、黒色腫細胞、及び活性化Ｔリンパ球の亜集団を含む。

Ｋｉ−６７（モノクローナル抗体Ｋｉ−６７又はＭＫ１６７によって識別される抗原としても知られる）は、増殖用の細胞マーカーであり、細胞増殖と関連している。間期中に、Ｋｉ−６７抗原は細胞核内に検出することができ、有糸分裂の場合はほとんどの蛋白質は染色体の表面に移動する。Ｋｉ−６７蛋白質は細胞周期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及び有糸分裂）の全ての活動期中に存在するが、静止細胞（Ｇｏ）には存在しない。これは、一般に細胞集団の増殖画分を決定するためのマーカーとして使用される。

セルトラックス（CellTracks）（登録商標）オートプレップ（登録商標）システム及びセルトラックス（CellTracks）（登録商標）アナライザＩＩが、ＣＭＣの捕捉と検出の完全自動化のために使用された。ＣＭＣ検査では、黒色腫細胞接着分子（ＣＤ１４６）に特異的な抗体に接合した磁気粒子が、７．５ｍＬの血液から黒色腫細胞を捕捉するために使用される。濃縮ＣＭＣはその後、核酸染料ＤＡＰＩで染色され、モノクローナル抗体は、高分子量黒色腫に関連した抗原に特異的なＰＥに接合している。検査はまた、ＡＰＣが接合した、ＣＤ４５及びＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を含有して、共精製された白血球及び循環内皮細胞をそれぞれ除外する。更に、ＦＩＴＣ識別された抗−Ｋｉ６７が追加されて、循環内の細胞周期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２又はＭ期）のＣＭＣの割合を測定した。濃縮及び染色されたＣＭＣは、磁気的にセルトラックス（CellTracks）カートリッジ内に取り付けられ、セルトラックス（CellTracks）アナライザＩＩを使用してスキャンされた。細胞の個々の画像は検査のためにオペレーターに提示され、蛍光及び細胞形態学に基づいてＣＭＣとして記録された。ＣＭＣ検査は、健常ドナーからの７．５ｍＬの血液にスパイクされたときに、細胞株ＳＫ−ＭＥＬ２８からの黒色腫細胞の６５％超を一貫して回収した。検査は、７．５ｍＬ（０．９９９のｒ^２、勾配０．７４、切片６．８）あたり１〜１２００の黒色腫細胞の試験範囲で線形であった。検査は、健常ドナー（ｎ＝６０）と転移性黒色腫（ｎ＝７１）をもつ患者の血液を使用して実証された。正常ドナーからの７．５ｍＬの血液中には、５７／６０（９５％）でゼロのＣＭＣが検出された。１つの細胞が３／６０（５％）の正常ドナーにおいてＣＭＣとして染色されたが、これらの細胞は通常、特徴的な内皮細胞形態を有し、Ｋｉ６７陰性であった。黒色腫の患者においては、ＣＭＣの範囲は７．５ｍＬの血液あたり０〜８０００であった。患者の３９％で１つ又はそれ以上のＣＭＣが検出され、２５％では２つ以上、８％では５つ以上、４％では１０以上及び３％では１００以上が検出された。驚くべきことに、ＣＭＣの３０〜１００％（平均８４％）がＫｉ６７陽性で、これは血液に流入した黒色腫細胞のかなりの割合が活発に分裂していることを示唆している。この自動ＣＭＣ検査は、転移性黒色腫をもつ患者にとっては有用な監視装置であり、予後を評価し、又はこの困難な侵攻性の高い疾患におけるバイオマーカー、標的及び潜在的治療を評価するためのツールとなり得る。

〔実施例〕
循環サイトケラチン陽性細胞の計数
セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムは、血液から分離された細胞の自動計数のための自動蛍光顕微鏡システムである。このシステムには、一体化したコンピュータ制御蛍光顕微鏡と、使い捨て検体カートリッジを保持する磁気ヨークアセンブリを備えた自動化ステージとが含まれる。磁気ヨークは、検体チャンバー内にある磁性流体標識された腫瘍細胞の候補を、顕微鏡観察のために検体カートリッジの上部観測表面に磁気的に集めることを可能にするよう設計されている。ソフトウェアは、サイトケラチンに対する抗体で標識され、かつ上皮由来である疑わしい癌細胞を、最終選択のためにオペレーターに提示する。

セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムのための腫瘍細胞の分離は、当該技術分野において既知である任意の方法によって達成することができるが、１つの実施形態では、生体の検体から腫瘍細胞を分離するために、免疫磁気的濃縮が使用される。上皮細胞特異性の磁気粒子を加え、２０分間インキュベートする。磁気的分離後、免疫磁気的に結合した抗体に結合した細胞は、試験管の壁に磁気的に保持される。結合していない検体を吸引除去し、等張液を加えて、検体を再懸濁させる。核酸染料、サイトケラチンに対するモノクローナル抗体（上皮細胞のマーカー）及びＣＤ４５（広域スペクトルの白血球マーカー）を検体と共にインキュベートする。磁気分離後、結合していない画分を再び吸引除去し、結合かつ標識された細胞を０．２ｍＬの等張液に再懸濁させる。検体は細胞観察チャンバー内で懸濁され、磁気装置内に配置され、この装置の磁場が、磁気的に標識された細胞を、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムでの蛍光顕微鏡検査のために位置付ける。細胞はセルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム内で自動的に識別され、循環腫瘍細胞の候補が、チェックリスト計数のためにオペレーターに提示される。計数チェックリストは、完全な細胞を構成する既定の形態学的基準からなる。

サイトケラチン陽性細胞は、ヒトから採取した全血の検体７．５ｍＬを使用して、免疫磁気的濃縮によって分離される。上皮細胞特異性の免疫磁性流体を加え、２０分間インキュベートする。２０分間の磁気的分離後、免疫磁気的に結合した抗体に結合した細胞は、試験管の壁に磁気的に保持される。結合していない検体を吸引除去し、等張液を加えて、検体を再懸濁させる。核酸染料、サイトケラチンに対するモノクローナル抗体（上皮細胞のマーカー）及びＣＤ４５（広域スペクトルの白血球マーカー）を検体と共に１５分間インキュベートする。磁気分離後、結合していない画分を再び吸引除去し、結合かつ標識された細胞を０．２ｍＬの等張液に再懸濁させる。検体は細胞観察チャンバー内で懸濁され、磁気装置内に配置され、この装置の磁場が、磁気的に標識された細胞を、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システムで蛍光顕微鏡検査のために位置付ける。細胞は、セルトラックス（CellTracks）（登録商標）システム内で自動的に識別され、対照細胞がシステムによって計数され、循環腫瘍細胞候補はオペレーターに提示され、オペレーターは、図１に示すチェックリストを使用して計数を行う。

本発明の好ましい実施形態の特定のものは、上記の記述で具体的に例示されているが、本発明がこれらの実施形態に限定されることを意図するものではない。本発明の趣旨から逸脱することなく、さまざまな修正をこれに行うことが可能であり、この改良の全範囲が、以下の請求項に明確に記述されている。

〔実施の態様〕
（１） 転移性黒色腫疾患をもつ患者の循環黒色腫細胞の分析方法において、
ａ）転移性黒色腫をもつ患者から１００μＬの血液検体を取得することであって、前記検体は前記黒色腫細胞を含有すると疑われる混合細胞集団を含む、ことと、
ｂ）前記試料の画分を濃縮することであって、前記画分が前記黒色腫細胞を含有する、ことと、
ｃ）前記希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
ｄ）前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析が疾患進行に相関する、ことと、
を含む、方法。
（２） 前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子ＣＤ１４６である、実施態様２に記載の方法。
（４） 前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって判断される、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記構造的完全性が、核酸染料、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、実施態様５に記載の方法。
（７） 前記特異的抗体がＣＤ４５及びＣＤ３４である、実施態様６に記載の方法。
（８） ＣＤ４５及びＣＤ３４を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、実施態様５に記載の方法。
（９） ＦＩＴＣ標識された抗−Ｋｉ６７が追加されて、循環内の活性細胞周期のＣＭＣの割合を測定する、実施態様１に記載の方法。
（１０） 前記試料に存在する前記無傷の黒色腫細胞の数の増加が、疾患の進行に対応する、実施態様１に記載の方法。

Claims (10)

1. 転移性黒色腫疾患をもつ患者の循環黒色腫細胞の分析方法において、
   ａ）転移性黒色腫をもつ患者から１００μＬの血液検体を取得することであって、前記検体は前記黒色腫細胞を含有すると疑われる混合細胞集団を含む、ことと、
   ｂ）前記試料の画分を濃縮することであって、前記画分が前記黒色腫細胞を含有する、ことと、
   ｃ）前記希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
   ｄ）前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析が疾患進行に相関する、ことと、
   を含む、方法。
2. 前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子ＣＤ１４６である、請求項２に記載の方法。
4. 前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、ＦＩＳＨ手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって判断される、請求項１に記載の方法。
5. 前記構造的完全性が、核酸染料、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、請求項１に記載の方法。
6. 前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、請求項５に記載の方法。
7. 前記特異的抗体がＣＤ４５及びＣＤ３４である、請求項６に記載の方法。
8. ＣＤ４５及びＣＤ３４を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、請求項５に記載の方法。
9. ＦＩＴＣ標識された抗−Ｋｉ６７が追加されて、循環内の活性細胞周期のＣＭＣの割合を測定する、請求項１に記載の方法。
10. 前記試料に存在する前記無傷の黒色腫細胞の数の増加が、疾患の進行に対応する、請求項１に記載の方法。

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