JP2014521958A - 胸腔内液若しくは漿液と関連する腫瘍細胞の特徴づけによる癌の診断方法 - Google Patents

胸腔内液若しくは漿液と関連する腫瘍細胞の特徴づけによる癌の診断方法 Download PDF

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Abstract

哺乳動物被験体の胸腔内液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の診断若しくは鑑別診断方法であって、該方法は、被験体の胸腔内液のサンプルを、癌細胞上の決定子に結合するがしかし胸腔内液中の他の細胞および細胞以外の成分にベースライン閾値より上で結合しないリガンドに結合されたコロイド状磁性粒子と接触させること;胸腔内液と磁性粒子の混合物を磁場に曝し、胸腔内液中に存在する場合はリガンドに結合された磁性粒子が結合された癌細胞が濃縮された細胞画分を生じること;ならびに胸腔内液中の癌細胞の数について該濃縮された画分を分析することを含んでなる。ある局面において、本方法は例えば処理されない胸腔内液の希釈により上で示された方法段階のため胸腔内液を調製することを必要とする。ある局面において、胸腔内液は被験体からの抜き出しの24時間以内に該診断方法にかけられる。本方法は悪性胸水を同定するための現在の診断手順に対する利点を有する。胸腔内液中に存在する腫瘍細胞は、予後および予測因子を決定するための細胞および分子マーカーで特徴づけることができる。
【選択図】図1A

Description

正常な胸腔内液は、臓側および壁側胸膜の間に位置する、少数の白血球、多様なタンパク質および水を含有する漿液の薄膜(すなわち肺および胸腔若しくは胸膜腔を内張する膜)である。胸水は胸膜腔中の液体の異常な蓄積であり、米国で毎年およそ130万人に発生している。胸水の多くの原因が存在する(例えば非特許文献1を参照されたい)。例えば、心不全若しくは肝硬変は血管内の圧と血液中のタンパク質の量の間の不均衡を引き起こし得、液体例えば漏出液の蓄積をもたらす。胸膜の傷害若しくは炎症は液体例えば浸出液の異常な収集を引き起こしうる。浸出液の原因は、感染性疾患、出血性障害若しくは外傷、炎症性肺疾患(例えば石綿症)、サルコイドーシス若しくは自己免疫疾患、癌、心バイパス手術、心若しくは肺移植および膵炎を包含する。しかしながら、胸水の3つの最も一般的な原因は感染症、心不全および悪性病変である。
とりわけ肺癌例えば非小細胞肺癌(NSCLC)若しくは小細胞肺癌(SCLC)に加え、胸水は、リンパ腫、中皮腫、および他器官で発する転移癌の症状であり得る。事実上いかなる悪性病変も胸膜腔に転移し得るが、しかし悪性胸水の最も一般的な供給源は肺癌、乳癌、卵巣癌、消化器癌、リンパ腫および中皮腫である。
現在、胸腔内液分析は患者が症状の組合せを有する場合に起こるが、とは言えいくつかの胸水は無症候性である。漏出液は通常物理的特徴、例えば澄明な液体、低下されたタンパク質若しくはアルブミンレベル、および非常に低い細胞数により同定される。一旦漏出液と同定されればさらなる検査は行われず;経過観察のみが実施される。こうした胸水が悪性病変によることはそう多くないためである。浸出液は通常物理的特徴、例えば、リンパ球の関与の存在、微生物の存在、または白血球若しくは赤血球の数の増加による乳様、濁った若しくは帯赤色の外観により同定される。漏出液を浸出液と区別するための最も重要な検査は高い総タンパク質レベルおよび高いLDHレベルである(非特許文献2)。また、乳酸、アミラーゼ、トリグリセリドおよび腫瘍マーカーの検査も潜在的に有用である。
典型的に、悪性胸水(MPE)の診断は下に要約されるとおり行われる(双方とも上に引用される非特許文献2および非特許文献1(引用することにより本明細書に組み込まれる)もまた参照されたい)。胸水を得、そして評価のため細胞学検査施設に送る。検査施設で、試料の代表的部分を遠心分離しかつ多数の細胞学的プレパラート(可能な場合はセルブロックを包含する)を創製し、そして診断評価のため染色する。数千個の細胞を含有するこれらのスライドを顕微鏡で評価する。細胞病理学者は悪性病変に特徴的な特異的特徴(すなわち大きい大きさ、異常な核の特徴など)を探す。これらの異常な特徴をもつ十分な細胞が見られる場合、悪性病変の診断がなされる。ときに免疫細胞化学的染色を使用する。
細胞学に基づく確定診断の感度は細胞型および基礎悪性病変の病期とともに異なり、そして約60%と推定される(例えば上で引用される非特許文献1を参照されたい)。実質的な数の症例で、確定的細胞学的および症候学的診断は胸水についてなされ得ない。確定診断に対する障害は、比較的「個性のない」核の特徴、反応性の中皮細胞の重なる形態学的特徴、若しくは検査の時点で胸腔内液中に存在する腫瘍細胞の少ない数を伴う腫瘍を包含する。一般に、免疫細胞化学的染色は、検出できない数の腫瘍細胞若しくは腫瘍細胞の見逃された細胞学的同定により実施されないことがある。ある種の腫瘍マーカーを用いる免疫細胞化学的染色(例えば電気化学発光アッセイ)は診断上有用であることが判明していない(上で引用される非特許文献1;および非特許文献3)。
胸水の多数の可能な原因が存在するため、細胞学が陰性である場合、患者は一般に症状の進行について臨床的に追跡される。細胞学が悪性病変の高い臨床的疑い、例えば高いタンパク質およびLDHレベルを伴う診断されない浸出液(浸出性浸出液)、を伴い陰性である場合、患者は追跡されうるか、あるいは、反復胸腔穿刺、次いで後の時点で反復細胞学的および免疫細胞化学的分析、または胸膜針生検、胸膜鏡的胸膜生検、若しくは外科的胸膜生検にかけられうる。
これらの診断選択肢のそれぞれが、診断されていない進行性疾患の危険および/若しくは生検処置の欠点に患者を従わせる。直接可視化(胸膜鏡検査)下の胸膜生検は95〜100%の診断の感度および正確性を有する一方、それは全身麻酔の必要性、若干の病的状態(すなわち感染症および疼痛)ならびに死亡の危険性、ならびに高い費用を包含する欠点により随伴される。
Hooper,Cら、2010 Thorax、Vol.65(Suppl 2):ii4−ii17 Light,RW、2002 N.Engl.J.Med.、Vol.346(25):1971−1977 Porcelら、2004 Chest、126:1757−63
[発明の要約]
本明細書に記述される方法は、胸腔内液のような過剰の漿液に関連する状態の現在の診断方法に対する有利な一代替を提供する。これらの方法は胸水中の悪性細胞を同定し得、そして従って現在の標準治療の診断の感度および正確性を増大させ得る。それは、臨床上関連する細胞および分子マーカーを使用する個別化された腫瘍のin vitro増殖および/若しくは特徴づけのための供給源材料への到達手段もまた提供し得る。
一局面において、哺乳動物被験体の胸腔内液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の診断若しくは鑑別診断方法が提供される。一局面において、該方法は、Veridex LLCのCellSearch(R)技術を使用して哺乳動物被験体からの胸腔内液サンプルをアッセイすることを包含する。例えば、被験体の胸腔内液のサンプルを、癌細胞上の決定子に結合するリガンド(例えば捕捉抗体)に結合されたコロイド状磁性粒子と混合する。一局面において、この第一のリガンド/捕捉抗体は癌細胞上若しくは中でのみ発現される。一局面において、このリガンドは、癌細胞以外の胸腔内液中の他の細胞および細胞以外の成分上若しくは中で発現される決定子にベースライン閾値より上で結合しない。生じる胸腔内液と磁性粒子の混合物を磁場に曝し、胸腔内液サンプル中にいずれかが存在する場合は磁性粒子が結合された癌細胞が濃縮された細胞画分を生じる。一態様において、濃縮された画分をその後胸腔内液中のリガンド陽性細胞の数について分析する。このリガンド陽性細胞数は、ベースライン閾値より上である場合、該胸腔内液中の悪性細胞の存在を示す。癌の診断若しくは鑑別診断が、胸腔内液中のベースライン閾値より大きい癌細胞の数を同定することにより提供される。
一局面において、本診断法で使用されるリガンド(例えば捕捉抗体)は細胞決定子例えばEpCAMを同定しそして抗EpCAM抗体である。別の局面において、本診断法で使用されるリガンドは癌細胞決定子例えばL1CAMを同定し、そして抗L1CAM抗体である。別の局面において、本診断法で使用されるリガンドは癌細胞決定子例えばクローデ
ィン4を同定し、そして抗クローディン4抗体である。一態様において、悪性胸水の診断のためのベースライン閾値は胸腔内液1mlあたり約100リガンド陽性細胞以上である。他の態様において、悪性胸水の診断のためのベースライン閾値は胸腔内液1mlあたり約500リガンド陽性細胞以上である。他の態様において、悪性胸水の診断のためのベースライン閾値は胸腔内液3.5mlあたり約1000リガンド陽性細胞以上である。別の局面において、本方法の特異性は、胸腔内液に存在する癌細胞を同定するためにサイトケラチン、クローディン4、サバイビン若しくはテロメラーゼまたは他者のようなマーカーに対する「二次抗体」の使用のような付加的な腫瘍マーカーについてEPCAM+細胞をまた染色することにより高められる。なお他の局面において、別の捕捉リガンド例えばL1CAM若しくはクローディン4を使用する本方法の特異性は二次抗体の使用によってもまた高めることができる。
別の局面において、該方法は癌細胞型特異的リガンドを使用し、そして該方法は胸腔内液に存在する癌細胞の型を同定するのに有用である。一態様において、第一のリガンド(例えば捕捉抗体)は中皮腫細胞上の細胞決定子に対する抗体であり、例えばリガンドは抗メソテリン抗体であり、そして該癌は中皮腫と同定される。別の局面において、該方法は、癌細胞型特異的リガンド、例えば、胸腔内液に存在する癌細胞の型を乳癌と同定することに対し有用な乳癌細胞上の細胞決定子例えばHer2/neuに対する抗体を使用する。別の局面において、該方法は、癌細胞型特異的リガンド、例えば、胸腔内液に存在する癌細胞の型を肺癌と同定することに対し有用な肺癌細胞上の細胞決定子に対する抗体、抗gp160を使用する。
なお他の局面において、癌細胞型特異的リガンドを二次抗体として使用する。別の局面において、これらのより特異的な二次抗体が、癌細胞決定子EPCAM、L1CAM若しくはクローディン4に対する「捕捉」抗体の使用とともに本明細書に記述されるところの方法で使用される。
別の局面において、該方法はしばしば培養物、ならびに胸水腫瘍細胞(「PETC」)の形態学的、表現型的および分子的特徴づけを可能にする量で腫瘍材料の独特の供給源を提供するために多数の胸腔内液細胞を濃縮することを必要とする。PETCの細胞的および分子的特徴づけは、患者の個別化処置の臨床管理および彼らの癌のモニタリングを補助し得る研究、同定および個別化分類のための広範な生物学的、研究および臨床的応用を可能にする。現在、腫瘍の特徴づけおよび分類は原発腫瘍の細胞で行われる。しかしながらいくつかのMPEにおいては起源の組織および原発性腫瘍の場所が不明である。肺癌の場合はとくに、原発性腫瘤はしばしば到達不可能でありかつ生検され得ないか、若しくは、穿刺吸引物は十分な腫瘍評価を実施するために不十分な材料を提供する。最後に、転移癌の症例において、元の原発性腫瘍組織で得られた情報は胸水提示の時点で数か月ないし数年齢であることができ、そしてもはや疾患を癌ほど動的に表さないかもしれない。多数のPETCを濃縮する能力はMPE提示の時点での腫瘍の特徴づけを可能にし得る。乳癌におけるホルモン療法若しくはハーセプチンまたは肺癌におけるEGFR若しくはALK阻害剤のようないくつかの癌処置はその患者の腫瘍の遺伝子型および表現型の特性に基づく。PETCは、MPEを伴う患者についてより早期にかつより効率的に治療選択を導くこの重要な特徴づけのための腫瘍材料の供給源としてはたらく。
別の局面において、該方法は、上の方法段階が適用される前に胸腔内液サンプルについてある種の調製段階例えば希釈を提供するように改変される。
別の局面において、該方法は、CD45のような全部の非腫瘍細胞を同定するためのマーカーのカクテル、および非腫瘍細胞を同定する他の抗体若しくはそれらの組合せを使用する。
別の局面において、該方法は限定されるものでないがEGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox−2、PTEN、IGF−1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMAおよびPSAなどを挙げることができるPETCを特徴づけるための予後および予測マーカーを使用する。
別の局面において、該方法はDNAおよびRNAマーカーを使用する腫瘍細胞の特異的分子的特徴づけのため浸出液中の他の非腫瘍細胞からPETCを濃縮する。
別の局面において、該方法は、限定されるものでないがEGFR、BRAF.ARAF、K−rasおよびP−53を挙げることができる遺伝子中の変異分析のためPETCを濃縮する。
別の局面において、該方法はPETCを数え上げ、そして異数染色体、遺伝子増幅(EGFR)、欠失(PTEN、P53)および転座(すなわちEML4/ALK)を蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により検出する。
別の局面において、該方法は、薬物動態(薬物処置に対する反応)を研究し、腫瘍の起源の組織を決定し、薬剤耐性のマーカーについて個体の腫瘍細胞を特徴づけ、薬剤耐性細胞集団、表現型若しくは分子的分子発現、変異解析、および新治療に対する潜在的応答性を同定かつ特徴づけ、ならびに遺伝子シグネチャの発見のような他の応用を実施するため、in vitro培養のために生存腫瘍細胞を単離する。
本発明の他の局面および利点はそれらの好ましい態様の以下の詳細な記述にさらに記述される。
良性(すなわちうっ血性心不全すなわちCHF、末期腎疾患すなわちESRD、放射線胸膜炎、乳び胸)ならびに悪性(リンパ腫、中皮腫、乳癌、非小細胞肺癌すなわちNSCLC、肺扁平上皮癌すなわちSCLC、卵巣癌および腎細胞癌)双方の胸水の病因の診断に対するCellSearch(R)系を使用するUPCCコホートからの患者サンプルの3.5ミリリットルの胸腔内液中で検出された腫瘍細胞(CK+/CD45−)の数をプロットするグラフである。各+は異なる患者の胸腔内液サンプルを表す。3.5mlの胸腔内液あたり約1100細胞のカットオフが100%特異性を与える。 組織学的型、例えば良性、悪性、非上皮および悪性上皮に従った胸腔内液3.5mlあたりのCD+/CD45−細胞の数を示すグラフである。 特異性に対し感度をプロットする、悪性胸水を診断するための実施例で論考されるところのCellSearch(R)の方法の性能特徴を示すグラフであり、ROC曲線下面積=0.8662。結果を下に要約する。すなわち 組織学的型、例えば図1Aに記述されるところの良性、悪性、非上皮および悪性上皮に従った胸水の病因の診断に対するCellSearch(R)系を使用するUPCCコホートからの患者サンプルの胸腔内液3.5ミリリットル中で検出される腫瘍細胞(CK+/クローディン+/CD45−)の数をプロットするグラフである。各+は異なる患者の胸腔内液サンプルを表す。 組織学的型、例えば良性、悪性、非上皮および悪性上皮に従った胸腔内液3.5ミリリットルあたりのCD+/クローディン+/CD45−細胞の数を示すグラフである。 PETCの連続免疫染色、ならびに固定およびサテライト計数(Satellite Enumeration)(SE)プローブを用いるハイブリダイゼーション後の同一PETCの多色FISH画像を示す写真である。 サイトケラチンで染色されたPETCの画像を示す。 CD45で染色されたPETCの画像を示す。 DAPIで染色されたPETCの画像を示す。画像の中央の大型のサイトケラチン+/DAPI+事象がPETCである。矢印はCD45+白血球の場所を示す。 固定および第1染色体のセントロメアに結合するSEプローブ(SE−1)でのハイブリダイゼーション後のFISH画像を示す。 固定および第7染色体のセントロメアに結合するSEプローブ(SE−7)でのハイブリダイゼーション後のFISH画像を示す。 固定および第8染色体のセントロメアに結合するSEプローブ(SE−8)でのハイブリダイゼーション後のFISH画像を示す。 固定および第17染色体のセントロメアに結合するSEプローブ(SE−17)でのハイブリダイゼーション後のFISH画像を示す。DAPI対染色を灰色で示す。全4種の染色体のコピー数獲得がPETC中で見られる。白血球上のFISHシグナル(矢印)をハイブリダイゼーション対照として使用し得る。
[発明の詳細な記述]
哺乳動物被験体の胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の診断若しくは鑑別診断方法は、望ましくは、癌細胞上の決定子に結合するリガンドに結合されたコロイド状磁性粒子と被験体の漿液の生物学的サンプルを接触させることを含んでなるアッセイ段階を包含する。本方法での使用のため選択されるリガンド若しくは捕捉抗体は、ベースライン閾値より上で漿液中の他の細胞(非悪性)および細胞以外の成分に結合しない。漿液と磁性粒子の混合物をその後磁場に曝し、漿液中の磁性粒子が結合された細胞が濃縮された細胞画分を生じる。濃縮された画分をその後分析して、漿液中のリガンドに結合された(すなわちリガンド陽性)細胞の数ならびに他の任意の情報を検出する。このリガンド陽性細胞数は、ベースライン閾値より上の場合、漿液中の悪性細胞の存在を示す。選択されたリガンド(例えば捕捉抗体)に依存して、癌の診断若しくは鑑別診断が、漿液中の選択されたリガンドについてベースライン閾値より大きいリガンド陽性細胞の数を同定することにより提供される。本明細書で使用されるところの「漿液」という用語は、限定されるものでないが胸腔内液(胸膜浸出液および胸膜漏出液のような)、腹水などを挙げることができる。本発明の例示的一漿液は胸腔内液である。
本明細書に記述される診断方法は、胸腔内液の病因のより少なく侵襲性のより迅速な決定を可能にする。これらの診断方法は、反復胸腔穿刺および胸膜生検処置に対する必要性を低減しかつ細胞学的診断が確定的でなかった患者により迅速でより感受性の診断情報を提供することにより、全体的医療費もまた大きく低下させうる。従来の診断プロトコルと結合されて、これらの方法はより迅速な診断を可能にしかつ処置のより迅速な適用を可能にして悪性疾患に対するより良好な予後をもたらすことができる。これらの方法は、未知の、不確定の若しくは不正確な初期診断に対する慣習的経過観察の間に発生しうる疾患のさらなる悪化若しくは付加的な症状および合併症を予防しうる。
本方法は、その多様な態様において、血液中の非常にまれな循環腫瘍細胞(CTC)を同定するよう設計されたある種の方法段階およびVeridex LLC CellSearch(R)系の装置を使用する。例えば、血液サンプル中で、通常、上皮細胞決定子EpCAMに対するリガンドを使用するCellSearch(R)方法論の主題、血液中のEpCAM陽性細胞のベースライン閾値は非常に低く、例えば約1細胞/7.5mlである。この技術は血液サンプル中の多様な癌のCTCの検出に応用されており(例えばShaffer DRら、2007、Clin Cancer Research、13:2023を参照されたい)、発明者は、いずれかの癌の診断、ましてや悪性胸水の診断で補助するためにこの分析技術を応用することについての示唆がないことを知っていた。該構成ならびに胸腔内液および腹水のような漿液ならびに血液の細胞/細胞以外成分に大きな差異が、ならびに胸膜腔若しくは腹腔および血管系の構造に多くの差異が存在する。例えば、肺は上皮細胞で覆われているため、胸腔内液中のEpCAM陽性細胞の「ベースライン」数は1/mlよりかなり大きいことが期待される。
A.CellSearch(R)
CellSearch循環腫瘍細胞系(Veridex LLC)は、血液サンプル中のまれなCTCを同定しかつその数を数え上げるための免疫磁性標識および自動ディジタル顕微鏡検査の組合せを利用するアッセイおよび装置を使用する。免疫磁性標識は「磁性流体」すなわち所望の細胞集団により表示される抗原決定子に特異的なリガンド、例えば上皮細胞接着分子(EpCAM)に対する抗体で被覆されたポリマー層により囲まれる磁性核をもつナノ粒子の使用で成し遂げられる。磁性流体と抗体の複合物は上皮細胞上の抗原決定子に結合し、これがその後サンプルの残部から磁性的に分離されうる。細胞をその後、汚染する白血球および非特異的破片から上皮細胞を識別するのを助けるため3種の細胞染色剤で染色する。使用される染色剤は、生存細胞を同定するのに役立つように細胞の核を染色するのに使用される4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)であり;ピコエリトリン(pycoerythrin)(PE)−標識サイトケラチン(CK)抗体(CK 8、18および19)は上皮細胞を認識し;ならびにアロフィコシアニン(APC)標識CD45抗体は汚染する白血球を結合する。自動化された蛍光に基づくディジタル顕微鏡検査を使用して、細胞をCTCの存在について分析する。CTCはDAPI+、CK+、CD45−染色の表現型に基づき可視化される。
末梢血を分析するためにCellSearch系を使用する臨床研究は、ベースライン若しくは処置終了時の患者での5以上のCTCの存在が、全部の他の群の患者より短い無増悪生存期間および全生存期間の中央値と相関したことを示した。各時点で5未満のCTCを伴う患者は最長の無増悪生存期間および全生存期間の中央値を有した。加えて、処置終了時に5未満のCTCに低下したベースラインで5以上のCTCを伴う患者は、5以上のCTC数を維持した患者より長い無増悪および全生存期間の中央値を有した。例えばCristofanilli Mら 2004 N Engl J Med、351(8):781−791(引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
CellSearch系の使用方法は、米国特許第6,365,362号;同第6,623,982号;同第7,282,350号;同第5,993,665号;同第6,790,366号;および同第6,645,731号明細書;ならびにそれらに基づく特許出願に記述されている。CellSearch系を実行するのに使用しうる装置の記述は、米国特許第5,985,153号;同第6,861,259号;同第6,660,159号;同第6,890,426号;同第6,136,182号およびそれらに基づく特許出願に見出し得る。上で示される特許のそれぞれは、CellSearch系の多様な局面を記述するためにそっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる。
B.サンプルおよびその調製
本明細書に記述される方法での使用のためのサンプルは哺乳動物被験体若しくは患者により提供される。こうした被験体若しくは患者は哺乳動物、例えばヒト、獣医学の動物若しくは家畜(farm animal)、家畜(domestic animal)若しくは愛玩動物、ならびにヒト以外の霊長類、イヌおよびマウスを包含する臨床研究に通常使用される動物を包含する。好ましくはこれらの方法の被験体は人である。本明細書に記述される方法の一局面において、該診断方法を受ける被験体は悪性病変若しくは悪性胸水に対し無症候性である。別の局面において、本明細書に記述される診断方法を受ける被験体は悪性病変若しくは悪性胸水の臨床症状若しくは病歴を示す。なお他の態様において、被験体の胸腔内液サンプルは臨床および細胞学的試験、ならびに場合によっては細胞化学的分析を受けており、検出可能な悪性病変なし若しくは未知病因の胸水という診断をもたらす。
一態様において、「生物学的サンプル」若しくは「サンプル」という用語は異常な悪性細胞を含有することが疑われるいかなる胸腔内液すなわち胸水も意味している。こうした細胞はNSCLC若しくはSCLCのような原発性若しくは転移性肺癌由来でありうる。あるいは、こうした細胞は別の器官例えば乳房、卵巣、結腸若しくは前立腺から発した二次転移癌細胞でありうる。一局面において、本明細書に記述される方法での使用に最も適するサンプルは胸膜浸出液である。別の局面において、本明細書に記述される方法での使用のためのサンプルは胸膜漏出液である。他の生物学的サンプルは、例えば腹部若しくは膵嚢胞液からの腹水を包含する悪性細胞を含有する他の漿液を包含しうる。腹水および胸腔内液は非常に類似の化学的系を伴い;腹部および肺の双方が、悪性病変において同一様式で中皮内層、ならびに胸膜腔および腹腔中で液体の形態を有する。以下の開示において胸腔内液が例示される場合、同一の方法を腹水若しくは他の嚢胞液を使用して類似の結果を伴い実施しうる。
一態様において、胸腔内液を患者から直接取り出されるところの処理されない形態で該方法で使用する。一態様において、処理されない胸腔内液を接触段階前にEDTA若しくはヘパリンチューブのような標準的採血管に入れる。一態様において、処理されない胸腔内液を接触段階前に標準的CellSave(R)チューブ(Veridex)に入れる。なお別の態様において、サンプルは、処理されない胸腔内液中で放置される場合に4℃でさえ24時間以内に大きな程度まで起こりうる癌細胞の減少を回避するため、患者からの収集直後にCellSaveチューブに入れる。別の態様において、サンプルは患者からの取り出し後1時間、5時間、10時間、15時間若しくは24時間まで以内に適切な収集管に入れる。
該方法の他の態様において、選ばれた被験者からのサンプルをCellSearch粒子との接触前に処理しうる。一態様において、希釈は希釈液に対し1:10胸腔内液である。別の態様において、希釈は希釈液に対し1:9胸腔内液である。別の態様において、希釈は希釈液に対し1:8胸腔内液である。別の態様において、希釈は希釈液に対し1:5胸腔内液である。別の態様において、希釈は希釈液に対し1:2胸腔内液である。別の態様において、希釈は希釈液に対し1:1胸腔内液である。好ましい希釈液は、生理的食塩液、リン酸緩衝生理的食塩液、別の緩衝液若しくは生理学的に許容できる希釈液を包含する。一態様において、希釈された胸腔内液を、本明細書の方法で記述されるところの磁性粒子と接触される前にCellSaveチューブに入れる。なお別の態様において、サンプルは、処理されない胸腔内液中で放置される場合に4℃でさえ24〜48時間以内に大きな程度まで起こりうる癌細胞の減少を回避するため、患者からの収集および希釈直後にCellSaveチューブに入れる。別の態様において、サンプルは患者からの取り出しおよび希釈後1時間、5時間、10時間、15時間、24時間、36時間、48時間まで以内に適切な収集管に入れる。
なお別の態様において、こうしたサンプルは該方法の接触段階前に慣習的手段により濃縮する。胸腔内液のこの前処理は、該方法を実施する検査施設への発送若しくは後の分析(すなわち収集後24〜48時間より後)のため胸腔内液を低温保存しなければならない状況で好ましい。こうした一態様において、接触段階で使用される胸腔内液サンプルは、被験体からのその抜き出し後に胸腔内液サンプルを遠心分離すること、および遠心分離物すなわちペレットを緩衝液に再懸濁することにより調製する。なお他の態様において、胸腔内液サンプルは、それを輸送若しくは後の分析のため低温保存する前に、下に実施例1で具体的に説明されるような複数の遠心分離および再懸濁にかけられる。
別の態様において、こうしたサンプルは濾過方法を使用することによる該方法の接触段階前に濃縮される。こうした一態様において、接触段階で使用される胸腔内液サンプルは、メンブレンを通る胸腔内液の通過を可能にするがしかし腫瘍細胞を保持する既知のかつ本質的に均一の孔径を含有するフィルターを通して液体を濾過することにより調製する。こうした一態様において、メンブレンの孔の直径は最低4μMでありうる。別の態様において、孔の直径は5μM若しくはそれ以上、および他の態様において、6、7、8、9若しくは10μMのいずれかでありうる。濾過後、メンブレンにより保持される腫瘍細胞をメンブレンから適する生理学的に許容できる緩衝液中にすすぎ落としうる。こうして濃縮された細胞をその後該方法の接触段階で使用しうる。
別の態様において、サンプル、例えば処理されない胸腔内液、希釈された胸腔内液、若しくは再懸濁された細胞ペレットを、サンプル中に存在する無核赤血球を差別的に溶解する溶解試薬と接触させる。この段階は、望ましくは、胸腔内液が実質的な数のRBCを含有する状況で磁性粒子とサンプルを接触させる前に実施する。適する溶解試薬は、単一の溶解試薬、若しくは溶解試薬およびクエンチ試薬、または溶解剤、クエンチ試薬および固定試薬を包含する。適する溶解系は商業的に販売されており、そして下の実施例1で利用されるBD Pharm LyseTM系(Becton Dickenson)を包含する。他の溶解系は、VersalyseTM系、FACSlyseTM系(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系若しくはErythrolyse II系(Beckman Coulter,Inc.)または塩化アンモニウム系を包含する。溶解試薬は変動し得、主な要件は赤血球の効率的溶解、ならびに胸腔内液中の癌細胞およびWBC上の抗原決定子の保存である。溶解のため単一試薬を使用することに加え、本明細書に記述される方法で有用な溶解系は第二の試薬、例えば該方法の残存段階の間に溶解試薬の効果をクエンチ若しくは妨害するもの、例えばStabilyseTM試薬(Beckman Coulter,Inc.)を包含し得る。慣習的固定試薬もまた、溶解試薬の選択若しくは該方法の好ましい実行に依存して使用しうる。
なお別の態様において、処理されない、希釈された、または本明細書に記述されるとおり多数重なった遠心分離若しくは処理された胸腔内液サンプルは、上述されたコロイド状粒子と接触される前に約−140℃の温度で低温保存する。
C.診断法の態様
上述された一般的方法の多様な態様を悪性胸水の診断で使用しうる。
上で述べられたところの一般的診断法は、胸腔内液を収集する段階、癌細胞上の決定子に結合するがしかし胸腔内液中の他の細胞および細胞以外の成分にベースライン閾値より上で結合しない第一のリガンドに結合されたコロイド状磁性粒子と被験体の胸腔内液のサンプルを接触させる段階;胸腔内液と磁性粒子の混合物を磁場に曝し、胸腔内液中に存在する場合は磁性粒子が結合された癌細胞が濃縮された細胞画分を生じる段階;濃縮された画分を胸腔内液中の癌細胞の数について分析する段階;ならびに胸腔内液中のベースライン閾値以上のリガンド陽性細胞の数を同定することにより癌の鑑別診断を提供する段階を
使用する。該代替において、悪性病変なしの診断は、胸腔内液中のベースライン閾値より少ないリガンド陽性細胞の数を同定することにより提供される。
本明細書に記述される方法の一態様において、診断方法は、悪性病変若しくは悪性胸水の臨床指標について哺乳動物被験体の臨床評価を実施することを包含する。こうした症状すなわち指標は、限定されるものでないが胸痛、咳、呼吸困難、疲労および炎症を挙げることができる。一態様において、臨床評価は該方法の一般的診断段階の前に実施する。
別の態様において、診断方法は、該方法の接触段階、曝す段階および分析段階により胸腔内液を分析する前に異常細胞の存在についての胸腔内液の細胞学的若しくは免疫細胞学的若しくは細胞化学的検査を実施する段階を包含する。本態様において、胸腔内液の分析は、それがベースラインを越えている場合は悪性病変の細胞学的診断を確定し得るリガンド陽性細胞の診断的数を提供する。あるいは、該分析は、悪性病変なしの細胞学的診断すなわち不確定診断を否定することがあり、そして胸腔内液の細胞の付加的な細胞学的検査を集中させる。従って、診断方法は付加的な細胞学的段階若しくは付加的な外科的診断段階例えば生検を包含しうる。あるいは、リガンド陽性細胞の数がベースラインより十分下である場合、細胞学的診断を確定することができ、そして該診断方法は付加的な段階を必要としなくてもよいか、または感染症若しくは胸水の悪性以外の原因の1つを検出するためのさらなる段階を包含しうる。
別の態様において、診断方法は、該方法の接触段階、曝す段階および分析段階により胸腔内液を分析した後に異常細胞の存在についての胸腔内液の細胞学的若しくは免疫細胞学的若しくは細胞化学的検査を実施することを必要とする。本態様において、胸腔内液の分析は、それがベースラインを越える場合に癌の供給源を同定若しくは確認するため癌特異的試薬を用いる胸腔内液の細胞のさらなる細胞学的検査に対する必要性を示すリガンド陽性細胞の診断的数を提供する。従って、該診断方法は、付加的な細胞学的段階を包含しうるか、若しくは診断で付加的な外科的段階例えば生検が使用されることを示した。あるいは、リガンド陽性細胞の数がベースラインより十分下である場合、該診断方法は感染症若しくは胸水の悪性以外の原因の1つを検出するための付加的な診断段階のみ示しうる。
なお別の態様において、上で論考されたとおり、コロイド状粒子との接触段階は、該液体が低温保存されない場合は被験体から胸腔内液サンプルを抜き出すことの24時間以内に起こる。なお別の態様において、上で論考されたとおり、コロイド状粒子との接触段階は被験体から胸腔内液サンプルを抜き出すことの30時間以内に起こる。なお別の態様において、上で論考されたとおり、コロイド状粒子との接触段階は被験体から胸腔内液サンプルを抜き出すことの48時間以内に起こる。後者2つの場合、ある態様において、サンプルは低温保存されかつ接触段階前に慣習的方法により再構成される。
一態様において、癌細胞上の決定子に結合する第一のリガンド(例えば捕捉抗体)に結合されたコロイド状磁性粒子と被験体の胸腔内液のサンプルを接触させる段階は、(a)胸腔内液中の他の細胞および細胞以外の成分に全く結合しないか、若しくは(b)ベースライン閾値より上で胸腔内液中の他の細胞および細胞以外の成分に結合しないか;若しくは(c)ベースライン閾値より上である種の癌細胞型にのみ結合するか;若しくは(d)識別可能な数で多様な癌細胞型に結合する、リガンドを使用する。例えば、使用されるリガンドは、癌細胞中で発現される決定子に結合しかつ非癌細胞上でしないリガンドでありうる。別の態様において、使用されるリガンドは特定の細胞型の癌細胞例えば上皮細胞癌のみに結合する。別の態様において、使用されるリガンドは、ある器官由来の癌細胞例えば乳癌細胞のみに結合するがしかし他の正常細胞から若しくは異なる起源からの癌細胞例えば肺癌細胞に結合しない。なお別の態様において、リガンドは、際立って異なる濃度/数で1種の癌細胞型に結合し、例えば、それが肺癌細胞にするよりはるかに多数で乳癌細
胞に結合して、それにより分析段階で生じられる数により癌の型が同定されることを可能にする。
一態様において、第一のリガンドは癌細胞上の決定子に結合することが可能であるモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントである。「フラグメント」により、選択された抗体のFabフラグメント、Fab’フラグメント若しくはF(ab’)2フラグメントを意味している。同様に、適する抗体の相補性決定領域(CDR)を含んでなる一本鎖可変抗体フラグメント若しくは組換え構築物を、これらの方法で有用な第一のリガンドとして使用しうる。なお他のリガンドは本明細書で論考される特許刊行物に記述されている。
一態様において、第一のリガンドは最低1個の癌細胞決定子に特異的なモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントである。一態様において、刊行物および下の実施例3に記述されるとおり、第一のリガンドは、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合するモノクローナル抗体若しくはその有用なフラグメントである。EpCAM受容体は胸水中に存在するWBC上に存在しないが、しかしそれは多様な癌腫上で広範に発現されている。しかしながら、EpCAMリガンドは非上皮癌若しくは造血起源の癌細胞上で発現されない。例えばEpCAMは中皮腫癌細胞、白血病、リンパ腫若しくは多発性骨髄腫上に存在しない。抗EpCAMが該方法で使用されるリガンドである場合、それは可能なEpCAM陰性腎細胞若しくは胸腺細胞癌を容易には同定しないことがある。しかしながら、下の実施例により同定されるとおり、抗EpCAM抗体はNSCLC、卵巣癌および乳癌に有意に結合するのである。例えば表3のデータを参照されたい。
本方法の別の態様において、第一のリガンドおよび/若しくは捕捉抗体は、L1CAMのような高度に悪性の細胞上で上方制御されている別の細胞特異的決定子に結合する。例えば、Katayamaら、1997、Cell Structure and Function 22:511−516;Haiら、2012 Clin Cancer Res、18:1914−1924;およびTischlerら、2011、Molecul.Cancer、10:127を参照されたい。別の態様において、第一のリガンド若しくは捕捉抗体は癌細胞決定子クローディン4に結合する。
これらの方法の特異性を改良するため、付加的な他のリガンド(例えば第二のリガンドおよび/若しくは二次抗体)を、染色により悪性病変若しくは非悪性病変を確認するのに使用する。一態様において、こうした第二のリガンド/抗体は非癌すなわち良性細胞で、例えばWBC上で発現される決定子若しくは抗原を結合する。別の態様において、こうした二次抗体が結合する決定子が腫瘍特異的決定子である場合、二次抗体の結合は該細胞が悪性であったことを確認し得る。二次抗体が結合したこうした決定子が良性細胞上でのみ若しくは主に発現される場合、細胞を非悪性として除外するために本明細書に記述される方法で該二次抗体を使用する。一態様において、こうした二次抗体はサバイバン(survivan)、テロメラーゼ若しくはクローディン4に対する抗体を包含する(EpCAM若しくはL1CAMが捕捉抗体である場合)。本方法の別の態様において、および胸水中の癌細胞型に依存して、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは肺癌細胞若しくはある型の肺癌細胞に特異的に結合するものである。
別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは、多様な肺癌のなかで独特に若しくは少なくとも差別的に発現される癌細胞決定子に結合する。こうした第一の抗体/捕捉抗体若しくは二次抗体は多くの既知抗体のなかから選択しうる。リガンドが癌細胞上で主に発現される決定子に結合するかどうかに依存して、これらのリガンドを捕捉抗体若しくは二次抗体として使用しうる。当業者は、公表された情報に頼ることにより、どの抗体を捕捉若しくは二次抗体として使用し得るかを容易に決定し得る。例えば、一態様において、非小細胞肺癌(NSCLC)を診断するためのリガンドとして有用な抗体は、
抗delE746−A750および抗L858Rを包含するEGFR突然変異を結合する抗体を包含する。別の態様において、これらの方法での使用のためのリガンドは703D4および704A1のようなIgG2Ak抗体でありうる。なお別の態様において、第一のリガンドは、例えばNCAM抗原に対するSEN7抗体(例えば第WO1994/006929号明細書を参照されたい)を包含する小細胞肺癌(SCLC)を診断するのに有用な抗体である。なお他の態様において、第一のリガンドは、TTF1、癌胎児性抗原、mMET、MUC1若しくは上皮細胞成長因子受容体に対する抗体である。第一の(捕捉)リガンド若しくは第二のリガンドとしての使用のためのなお他の可能な抗体が表1に同定され、そして当業者に既知である。例えば、Dennis,JLら、2005 Clin.Cancer Res.11:3766−3772に列挙される抗体および抗原を参照されたい。
別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは中皮腫を診断するための抗体である。該方法の一態様において、従って、第一のリガンド若しくは第二のリガンドはカルレチニンに結合する抗体である。該方法の別の態様において、従って、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは、tumor 1(WT1)若しくはBG8、若しくはCD15若しくはメソテリンに対する抗体である。
胸水中に存在する癌細胞が乳房、卵巣、前立腺若しくは結腸または他の器官の転移癌細胞であるなお別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドはそれらの細胞に対する異なる特異性の抗体を包含する。例えば、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは、ヒト乳癌細胞に特異的であるモノクローナル抗体F36/22若しくはそのフラグメントでありうる(例えば米国特許第5,652,114号明細書を参照されたい)。別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは結腸直腸癌細胞上の1エピトープに向けられるモノクローナル抗体である(例えば米国特許第5,459,043号明細書を参照されたい)。別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドはエストロゲン受容体を結合するモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントでありうる。別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドはHer2/nuを結合するモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントでありうる。別の態様において、第一のリガンド若しくは第二のリガンドは前立腺特異的抗原を結合するモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントでありうる。なお他の態様は、細胞決定子若しくは抗原すなわちCA15.3、CEA、CA125、癌精巣抗原、CDX2、CK20、GCDFP−15、ER、リゾチームおよびCK7に対するモノクローナル抗体若しくはそれらのフラグメントを使用し得る。本発明で有用であるなお他の抗体および細胞決定子は当業者に既知であり、そして特定の癌を同定するために容易に選択しうる。例えば、表1および例えばDennis,JLら、2005 Clin.Cancer Res.11:3766−3772に列挙される抗体および抗原を参照されたい。
なお別の態様において、該方法は、各第一の若しくは第二のリガンドが同一の癌細胞若しくは癌細胞型上の異なる決定子に向けられる異なる抗体(例えばCellSearch技術で記述される「標識試薬」)である接触段階での1種以上の第一の(捕捉)および/若しくは第二のリガンドを包含しうる。別の態様において、該方法の接触段階、曝す段階および分析段階が反復され、それぞれが同一の癌細胞型上の異なる決定子に向けられる異なる第一の/捕捉若しくは第二のリガンドを使用する。該方法の別の態様は、異なる癌細胞型上で差別的に発現される第一の若しくは第二のリガンドまたは一連の若しくは一団の第一の若しくは第二のリガンドを使用する。別の態様において、該方法の接触段階、曝す段階および分析段階が反復され、それぞれが異なる癌細胞型上の異なる決定子に向けられる異なる「第一のリガンド」および/若しくは第二のリガンドを使用する。例えば本明細書で参照される刊行物を参照されたい。従って、同一の癌細胞型若しくは集団上の異なる決定子を結合する異なる抗体の組合せを、ある癌細胞集団上の1個の決定子を結合する単
一抗体の代わりに使用し得る。
使用されるリガンドに依存して、かつ、CellSearch技術の刊行物で示されるとおり、使用される次の段階は、胸腔内液と磁性粒子の混合物を磁場に曝して、胸腔内液中に存在する場合は磁性粒子が結合された癌細胞が濃縮された細胞画分を生じることである。
ある態様において、胸腔内液サンプル中の細胞内容物および破片に依存して、該方法は、濃縮された画分から非癌細胞、無核細胞、細胞破片および結合されない物質を分析前に精製若しくは分離する段階もまた使用する。こうした精製段階は、胸腔内液中に存在する非癌細胞例えばWBC上に存在する抗原に特異的な第二のリガンドを濃縮された画分に添加する任意の段階を包含し得るか若しくはそれが続き得る。別の態様において、該方法は、胸腔内液中に通常存在するタンパク質上に存在する抗原に特異的な第二のリガンドを濃縮された画分に添加することにより改変し得る。濃縮された画分中の他の細胞若しくは細胞破片から非癌細胞を識別することが可能ななお他の試薬をサンプル若しくは濃縮された画分に添加して、濃縮された画分からの不要な成分の分離を可能にする。
一態様において、こうした第二のリガンドは、例えば胸腔内液中に存在する白血球に特異的に結合するモノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、とりわけ抗CD45である、を包含し得る。白血球に独特若しくは白血球および非白血球上で差別的に発現される他の抗体を、この目的上当該技術分野で既知のものから選択してもよい。別の態様において、第二のリガンドは、例えば上皮癌細胞型の細胞内サイトケラチンに結合するCellSearch系で使用される癌細胞上の異なる決定子に対する抗体、例えば標識試薬、若しくは同一癌細胞型上に存在することが既知の別のリガンドを包含する(例えば表1および本明細書に引用される文書の決定子を参照されたい)。表1は、本明細書に記述される方法で有用なリガンド/標識試薬としての使用のための例示的抗体およびそれらの細胞決定子の一覧である。
精製若しくは分離段階のなおさらなる一態様において、DAPIのような細胞特異的色素を使用して細胞破片から生存細胞を識別するため細胞核を染色する。これらはCellSearch技術の刊行物および特許で教示されるとおり選択しうる。従って、これらの付加的なリガンドおよび試薬は、濃縮された画分中でWBC、他の非癌細胞および細胞破片から癌細胞を識別することにおいて補助し、そして濃縮された画分からのこれらの胸腔内液成分の除去を可能にする。これらの付加的なリガンドおよび試薬は1種の癌細胞型を別のものから識別することにおいてもまた補助し得る。
上および実施例に記述されるとおり、血液の分析のためにCellSearch系で使用される普遍的リガンドおよび試薬を、胸水中の胸膜腔に存在する若しくはそこに転移するある種の上皮細胞癌の胸腔内液分析のため使用し得る。本方法の実務において、胸腔内液サンプルを、該細胞を結合しかつ上皮癌細胞と同定する抗EpCAM抗体被覆されたコロイド状金属粒子と接触させる。上で開示されたとおり、抗EpCAM抗体被覆された粒
子は、抗L1CAM抗体被覆された粒子および/若しくは抗クローディン4抗体被覆された粒子で置き換え若しくは補い得る。サンプルと粒子の混合物は無傷の細胞を染色しかつ細胞破片を染色しない色素DAPIともまた接触させる。該サンプルと粒子の混合物は、ほとんどの上皮細胞すなわち上皮癌細胞を包含する、もまた同定する抗サイトケラチン(CK)抗体ともまた接触させる。該サンプルと粒子の混合物は、胸腔内液中のWBCに結合しかつ白血球としてのそれらの除外を可能にするために抗CD45のような抗白血球抗体とさらに接触させる。抗体リガンドのそれぞれは、CellSearch技術およびそれを記述する特許(引用することにより本明細書に組み込まれる)に記述されるとおり、適する標識に結合しうる。
場合によっては胸腔内液の他成分から精製される濃縮された画分をその後分析して、リガンド/標識/色素結合により同定される適切な表現型を特徴とする細胞の数を検出する。本明細書に実施例3により例示されるとおり、NSCLC、乳癌、卵巣癌のような上皮細胞癌は、表現型すなわちEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45-を特徴とする癌細胞の数すなわち数え上げた数値により例示される。本分析は、慣習的免疫フローサイトメトリー若しくは他の細胞分析ならびにCellSearch特許および刊行物に同定される数え上げ技術を使用して実施される。一態様において、該方法の分析若しくは癌細胞数え上げは、ベースライン閾値を超える第一のリガンドに結合された癌細胞数を検出若しくは同定若しくは測定することを必要とする。同定された選択されたリガンド、標識試薬および色素のベースライン閾値は、正常な胸腔内液中で同一の試薬を使用する方法を実施することにより慣例に決定しうる。
一態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合のベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約100ないし1000超の間のEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞からの範囲にわたる数である。一態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合のベースライン閾値は、正常な胸腔内液3.5mlあたり約100ないし1000超の間のEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞からの範囲にわたる数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約200 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約300 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約400 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約500 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約600 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約700 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約800 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EpCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約900 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EPCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約1000 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガン
ドとして抗EPCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液1mlあたり約1100 EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。別の態様において、該方法が第一のリガンドとして抗EPCAMを使用する場合の平均ベースライン閾値は、正常な胸腔内液3.5mlあたり約1100以上のEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−細胞の数である。
胸腔の内層は上皮でありかつ高いEpCAM+細胞数を有することが期待されるとみられるため、この高いEpCAM+ベースライン閾値は、本方法が胸腔内液中で働くことを驚くべきこととする。しかしながら下の実施例3、図2ならびに表2A、2Bおよび3に示されるとおり、第一の/捕捉リガンドとして抗EpCAMを使用する本明細書に記述される方法は、上皮細胞癌を含有する胸水中の悪性病変のより正確な鑑別診断に貢献する結果を生じる。実施例3に記述される方法は、実施例2の細胞学的評価がしたよりも胸水中の癌のより高感度の検出を提供し、そして胸腔内液1mlあたり100 CTCのベースラインカットオフを使用する場合に2例の乳癌患者で反対の結果に達した。これらの結果は、胸水中の癌の現在の診断方法若しくはその鑑別診断における補助方法の価値を示す。
リガンド、標識剤および色素が実施例3で例示されるものと異なりかつこうした試薬が癌細胞型例えば肺癌を識別することを可能にする類似の様式において、各異なるリガンドのベースライン閾値が同様に計算されかつ該診断価値が決定される。
なおさらなる一態様において、胸腔内液中の癌細胞の数の診断的分析方法のこれらの段階の全部は、正確な診断若しくは予後を可能にする情報を提供するために被験体の疾患の間または被験体の癌の処置の前若しくは間の異なる時点で反復しうる。該方法により提供されるこの診断情報は、胸腔内液に適切な他の慣習的診断法と組合せられる場合に最も有用であることがありそうである。例えば、該方法は他の診断段階、例えば被験体からの胸腔内液サンプルを、前記サンプル中のタンパク質若しくはアルブメン(albumen)のレベルを測定する診断試薬と接触させる段階と結合しうる。
なお別の態様において、付加的な診断方法段階は、胸腔内液からの単離された癌細胞で染色体若しくは蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実施して、これらが腫瘍の起源と矛盾しない染色体異常を有するかどうかを決定することを包含しうる。
別の態様において、核酸を実施例5でのとおり胸腔内液から濃縮された癌細胞から分析しうる。特定の分子マーカー若しくは細胞学的マーカーの存在若しくは非存在は、患者についての診断若しくは予後情報を提供することができるか、または濃縮された腫瘍細胞の集団を特徴づけるのに役立つことができる。加えて、胸水腫瘍細胞の核酸分析は、患者を管理若しくは臨床試験の候補者を層別することにおいて有用なマーカーを同定するための発見ツールとして使用しうる。
本明細書で使用されるところの「細胞学的マーカー」という用語は分析の時点で無傷の細胞若しくは断片の一部として検出され得るマーカーを意味している。こうした細胞学的マーカーの検出方法は、限定されるものでないが免疫蛍光顕微鏡検査、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、FISHおよび免疫蛍光定量を挙げることができる。分子マーカーは、サンプルの均質化または細胞若しくは細胞断片の細胞内成分の精製後に検出される濃縮されたPETC由来の物質である。こうしたマーカーは、限定されるものでないがDNA、RNA、マイクロRNA、タンパク質、炭水化物および脂質を挙げることができる。こうしたマーカーは、限定されるものでないがPCR、RT−PCR、マイクロアレイ、ELISA、ウエスタンブロットおよびサザンブロットを挙げることができる方法により検出される。
これらの方法は、被験体が癌について処置されておりかつ該方法が処置の有効性若しくは予後の決定を可能にする状況でとりわけ有用である。これらの方法は、被験体の胸水が該被験体からの胸腔内液のサンプルの決定的でない細胞学的若しくは免疫細胞化学的検査後に未知の病因のものであることが決定された状況で有用である。これらの方法は、とりわけ、肺癌、リンパ腫、中皮腫、転移性乳癌、転移性卵巣癌および転移性前立腺癌の診断で有用であることもまたありそうである。
D.方法の態様
該方法の多様な態様は従って以下を包含する。
哺乳動物被験体の胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の診断若しくは鑑別診断方法は、a)被験体の胸腔内液若しくは漿液のサンプルを、癌細胞上の決定子に結合するがしかし胸腔内液若しくは漿液中の他の細胞および細胞以外の成分にベースライン閾値より上で結合しない第一のリガンドに結合されたコロイド状磁性粒子と接触させること;ならびにb)胸腔内液と磁性粒子の混合物若しくは漿液と磁性粒子の混合物を磁場に曝し、胸腔内液若しくは漿液中に存在する場合はリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞が濃縮された細胞画分を生じること、を含んでなる。一態様において、該方法は、c)該濃縮された画分を、胸腔内液若しくは漿液中のリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞の数について分析する段階;およびd)胸腔内液若しくは漿液中でベースライン閾値より大きいリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞の数を同定することにより癌の鑑別診断を提供する段階、をさらに包含する。
なお別の態様において、該方法は、濃縮された細胞画分を細胞学的若しくは分子マーカーを使用して特徴づけること;該濃縮された細胞画分を培養すること;および、該濃縮された細胞画分を細胞学的若しくは分子いずれかのマーカーを使用して特徴づけることを含んでなる1若しくはそれ以上の付加的な段階を実施することを必要とする。なお別の態様において、該方法は、該培養された濃縮された画分を分析する段階;および培養された濃縮された画分で薬物動態研究を実施する段階の付加的な段階を包含する。
一態様において胸腔内液は胸水である。
該方法は、接触、曝すおよび分析段階により胸腔内液若しくは漿液を分析する前若しくは後に、異常な細胞の存在について該胸腔内液若しくは漿液の細胞学的若しくは免疫細胞学的検査を実施することのような段階もまた包含し得る。該方法は前記接触段階前に胸腔内液若しくは漿液を希釈することを包含し得る。胸腔内液若しくは漿液は1:10の比で希釈液で希釈し得る。該方法の接触段階は、被験体から胸腔内液サンプル若しくは漿液サンプルを抜き出すことの24時間以内に起こる。
該方法の付加的な態様は、胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に、癌細胞若しくは非癌細胞中で発現される第二の抗原に特異的な第二のリガンド、または濃縮された画分中の他の細胞若しくは細胞破片から非癌細胞を識別することが可能である試薬を添加すること;胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に癌細胞の第二の細胞決定子を結合する標識試薬を添加すること;胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に、細胞破片から生存細胞を識別する細胞特異的色素を添加すること;ならびに/あるいは分析前に非癌細胞、無核細胞、細胞破片および結合されない物質を濃縮された画分から精製すること、を含んでなる1若しくはそれ以上の付加的な段階を包含する。一態様において、二次抗体は問題の細胞表面に存在する若しくは該細胞内で発現される細胞決定子を結合し得る。
該方法のある局面において、第一のリガンドは最低1種の癌細胞決定子に特異的なモノ
クローナル抗体若しくはそのフラグメントである。他の局面において、第二のリガンドは、胸腔内液中の白血球に特異的に結合するか、若しくは癌細胞上の特異的腫瘍マーカーに結合して、特異性を高めるかまたは胸腔内液若しくは漿液中に存在する癌細胞を同定する。他の局面において、第一のリガンド、第二のリガンド若しくは標識試薬の最低1種が肺癌細胞若しくは乳癌細胞に特異的に結合する。該方法のいくつかの態様において、第一のリガンドは上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合するか;または、第一のリガンドはL1細胞接着分子(L1CAM)に特異的に結合するか、若しくは第一のリガンドはクローディン4に特異的に結合する。別の態様において、そこで第一のリガンドがEpCAM若しくはL1CAMに特異的に結合しかつ第二のリガンドがクローディン4に特異的に結合する。
ある態様において、ベースライン閾値は3.5mlの胸腔内液あたり約1100 EpCAM+細胞である。他の態様において、EPCAM+細胞は、サイトケラチン、クローディン4、サバイビンおよび/若しくはテロメラーゼのような1種若しくはそれ以上の付加的な特異的腫瘍マーカーについて染色される。
他の態様において、該方法は、胸痛、咳、呼吸困難、疲労および炎症よりなる群から選択される臨床症状について哺乳動物被験体の臨床評価を実施すること;被験体からの胸腔内液若しくは漿液サンプルを、前記サンプル中のタンパク質若しくはアルブミンのレベルを測定する診断試薬と接触させること;ならびに、胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の数を分析するための前記前の段階を、被験体の疾患の間または被験体の癌の処置の前若しくは間の多様な時点で反復すること、を含んでなる1若しくはそれ以上の段階を含んでなる。ある態様において、被験体は癌について処置されており、そして該方法は処置の有効性若しくは予後の決定を可能にする。ある態様において、胸水は、接触段階前に被験体からの胸腔内液のサンプルの決定的でない細胞学的若しくは免疫細胞化学的検査後に未知の病因のものであることが決定された。
該方法の他の態様において、付加的な段階は以下、すなわち、漿液若しくは胸腔内液のサンプルを、接触段階前に本質的な均一な大きさの孔を含んでなるフィルターを通して濾過すること;濃縮された細胞画分を予後および予測マーカーを使用して分析すること;濃縮された細胞画分を遺伝子の変異解析を使用して分析すること;ならびに/または濃縮された細胞画分の蛍光in situハイブリダイゼーションを実施すること、から選択される。予後および予測マーカーは、EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox−2、PTEN、IGF−1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMAおよびPSAよりなる群から選択される。あるいは、遺伝子はEGFR、BRAF、ARAF、K−rasおよびP53よりなる群から選択される。
哺乳動物被験体の胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の別の診断若しくは鑑別診断方法は、a)被験体の胸腔内液若しくは漿液のサンプルを既知の本質的に均一の孔径の孔を含んでなるフィルターで濾過して胸水腫瘍細胞(PETC)を濃縮する段階;b)濾過されたPETCの数を分析する段階;およびc)胸腔内液若しくは漿液中のベースライン閾値より大きい濾過されたPETCの数を同定することにより癌の鑑別診断を提供する段階、を包含する。他の態様において、該方法は、濃縮された細胞画分を予後および予測マーカーを使用して分析すること;濃縮された細胞画分を遺伝子の変異解析を使用して分析すること;ならびに、濃縮された細胞画分の蛍光in situハイブリダイゼーションを実施すること、を含んでなる1若しくはそれ以上の段階を包含する。予後および予測マーカーは、EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox−2、PTEN、IGF−1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMAおよびPSAよりなる群から選択される。あるいは、
該遺伝子はEGFR、BRAF、ARAF、K−rasおよびP53よりなる群から選択される。
E.実施例
後に続く実施例は本明細書に記述される態様の範囲を制限しない。当業者は、改変が、本発明の技術思想および範囲により包括されることを意図している以下の実施例でなされ得ることを認識するであろう。
胸腔内液サンプル
1.収集
胸腔内液は通常、細胞学的検査のため無菌50ccシリンジ若しくは無菌採尿容器に収集し、そして、それが実施例2でのとおり細胞学的方法により検査される前に保存若しくは発送されることを意図している場合は、段階IIおよびIIIでのようにさらに処理し得る。
実施例3のCellSearchアッセイのため、上述されたとおり処理されない胸腔内液を抜き出す。場合によっては無菌緩衝液で単純に1:10希釈される処理されない該液体をCellSave(R)チューブに移す。
いずれの場合の収集された液体もあればサンプル番号および診断を示すラベルを付ける。最適には、液体は、抜き出されことの30分以内に処理のため検査施設に送付する。全部の手順はバイオセイフティーフード中で無菌的に行うべきである。胸腔内液サンプルは24時間以内に実施例3のアッセイにかける。
II.実施例3の方法の前の細胞学的検査若しくは保存のための任意の遠心分離段階および上清収集
A.収集されるべき全試料を50cc遠心管に移す。
B.この材料を約1,500rpmで10分間遠心分離する。
C.約50mlの上清を新たな50ml遠心管に移して上清を収集する。
D.段階IICからの上清を2200rpmで10分間遠心分離する(この高速回転が細胞破片をペレットにすることができる)。
E.10本の1.8ml低温チューブに、サンプルID、調製された日およびサンプルの種類(「PF上清」)を示すラベルを付ける。
F.高速回転からの上清を新たな50mlチューブに移す。
G.1mlの上清を低温チューブに分注する。
H.全部の収集された上清アリコートを−80℃で保存する。
III.段階IIBからの細胞ペレットの再懸濁。
A.真空吸引装置を使用し、細胞ペレットを乱さないように注意して上清の残りを注意深く取り出しかつ廃棄する。
B.全部の細胞ペレットを、最終容量が約20mlとなるように0.5%FBS含有無菌PBSを用いて50mlチューブ中で再懸濁する。
C.1500rpmで5分間遠心分離し、そして上清を除去する。
D.10×溶解緩衝液(BD Pharm LyseTM、カタログ番号555899、10×濃縮溶液)のストックを、滅菌水で1:10希釈することにより希釈する。細胞ペレットの容量のおよそ10倍容量の1×溶解緩衝液を細胞ペレットに添加し、そしてチューブをオービタルシェーカー上に穏やかに攪拌しながら15分間置く。必要とされる場合は溶解段階を延長する
E.1500rpmで5分間再度遠心分離し、上清を廃棄し、そして5mlの無菌PB
S(0.5%FBSを含む)で再懸濁する。
F.少量のアリコートを取り出しかつ細胞の数を計数する。
G.2×106細胞を4mlのPBS(0.5%FBSを含む)中に移す−段階4を参照されたい。
H.再懸濁された細胞ペレットの1ccを新たな無菌遠心管に移し、そして6ccの無菌PBSを添加する。
この細胞懸濁液を実施例2に記述されるところの慣習的細胞学的顕微鏡検査で評価する。
細胞学的検査
I.サンプルを調製
A.実施例1、段階III、副段落Iからの残存する細胞懸濁液を1500rpmで別の5分間遠心分離する。
B.上清を除去し、そして凍結用培地を添加するため準備する。
C.ペレットを4ccの凍結用培地に再懸濁する。
D.ラベル表示には、サンプル番号、サンプル収集日およびサンプルが胸腔内液であることの指示を含有すべきである。
E.イソプロパノールを含有するNalgene“Mr.Frosty”凍結容器中−80℃で一夜保存する。低温チューブをその時点で−140℃に移す。
II.CytoSpin(R)装置を使用する細胞学的分析
A.2×106細胞を4mlのPBS(0.5%FBSを含む)中に移す。
B.スライドに予めラベルを付ける。
C.紙製パッドを取り付けられたスライドとキュベットを金属ホルダー中で準備する。
D.この懸濁液200μlまでを各キュベットに負荷する。
E.750rpmで10分間回転する。
F.新鮮なサイトスピン(cytospin)に損傷を与えずにキュベットと紙を慎重に分離する。
G.細胞遠心分離された(cytocentrifuged)細胞の周囲の領域にドライポイント若しくは油性マーカーで印を付ける。
H.即座の固定若しくは乾燥のいずれかで進める。固定されないサイトスピンは室温で最長2日間保存する。あるいは、固定されないサイトスピンは−20℃の冷凍庫で数週間保存する。
生じる固定された細胞を、腫瘍細胞若しくは未熟血液細胞を示す異常細胞の存在について顕微鏡で検査する。この型の分析は下の表1の列3に記録される予備診断を生じた。
CellSearch(R)系を使用するアッセイ
CellSearch(R)循環腫瘍細胞系(Veridex LLC)を使用して胸腔内液中の循環腫瘍細胞を同定しかつその数を数え上げる。アッセイ手順は、Mayo Medical Laboratories Communique、第36巻、第1号(2011年1/2月)(引用することにより本明細書に組み込まれかつ下に簡潔に要約される)に記述されるとおりである。
A.処理されずかつ希釈されない胸腔内液7.5mlをCellSaveチューブ(Veridex LLC)に入れる。
B.PBSを除去し、そして細胞成分を新たな緩衝液で所望の希釈まで混合し、そしてその後磁性流体を添加する。磁性流体は上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的とする抗
体で被覆されたポリマー層により囲まれる磁性核をもつナノ粒子よりなる。磁性流体と抗体の複合体は細胞成分中の上皮細胞に特異的に結合する。
C.磁性流体と抗体の複合体を含有するチューブを磁性キュベット中でインキュベートし、それは磁性流体に結合された上皮細胞をチューブの側に誘引する。残存する流体および結合されない細胞を吸引しかつ磁石を除去する。結合された細胞をその後緩衝液に再懸濁して、上皮細胞が濃縮された液体をもたらす。
D.3種の細胞染色剤を上皮細胞が濃縮された液体に添加して、汚染する白血球および非特異的破片から上皮細胞を識別するのを助ける。すなわち
i.4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)は細胞の核を染色して生存細胞を同定するのを助けるのに使用し;
ii.フィコエリトリン(PE)標識サイトケラチン(CK)抗体(CK 8、18および19)は上皮細胞を認識し;ならびに
iii.アロフィコシアニン(APC)標識CD45抗体は汚染する白血球を結合する。
E.該液体をMagNest(R)(Veridex)細胞提示装置に入れ、それは磁性標識された上皮細胞をカートリッジの表面に誘引する。カートリッジをCellTracks(R)アナライザー(Veridex)に入れ、そして蛍光に基づく顕微鏡検査を使用して分析する。カートリッジの表面を走査して上述された3種の剤で染色された細胞の画像を取得する。
F.胸腔内液サンプル中に存在するいかなる上皮癌細胞(例えばEpCAM+およびCK+)も、表現型すなわちEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45-に基づき画像上で同定する。陽性DAPI染色は細胞破片から生存細胞を識別し;陽性CK染色は上皮細胞を他の細胞から識別する。CD45染色の非存在は細胞が白血球以外であることを示す。EpCAM+細胞は悪性上皮癌細胞を示す。全部の他の染色の組合せは癌細胞に相関しない。
下の表2Aおよび2Bは、胸水を伴う患者の2コホートからのマスク化された胸腔内液サンプルが臨床診断(細胞学、臨床症候学および/若しくは生検結果の1種若しくはそれ以上の組合せであり得る)を受けた場合のこの方法の予備結果を要約する。これらの患者サンプルをその後、CellSearch系を使用する血液中のCTCを測定する(例えばEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−と細胞表現型を同定する)ことにおいて現在使用されていると同一のリガンドおよび標識試薬を使用して、本明細書に記述される方法の細胞分析にかけた。表2Aおよび2Bの第二および第三の列はマスク化されたサンプルの診断を示す。表2Aおよび2Bの第五の列は該方法の癌細胞数を示す。第四の列は細胞学臨床検査からの結果を示す。該コホートは、被験者ID番号により、すなわち表2A中でCTCPF番号としておよび表2BでUPCC番号として同定される。
表3Aおよび3Bは、胸水を伴う患者の2コホートからのマスク化された胸腔内液サンプルが臨床診断(細胞学、臨床症候学および/若しくは生検結果の1種若しくはそれ以上の組合せであり得る)を受けた場合の本方法の更新された予備結果を要約する。これらの患者のサンプルをその後、CellSearch系を使用して血液中のCTCを測定する(例えばEpCAM+、DAPI+ CK+ CD45−と細胞表現型を同定する)ことにおいて現在使用されていると同一のリガンドおよび標識試薬を使用して、本明細書に記述される方法の細胞分析にかけた。表3Aおよび3Bの第二および第三の列はマスク化されたサンプルの診断を示す。表3Aおよび3Bの第五の列は該方法の癌細胞数を示す。第四の列は細胞学臨床検査からの結果を示す。該コホートは、被験者ID番号により、すなわち表3A中でCTCPF番号としておよび表3BでUPCC番号として同定される。
非悪性病変例えばCHF、薬物反応、肝性胸水、肺移植および照射後のサンプルについて、これらの細胞数の結果(列4、表3B)の大部分は3.5mlの胸腔内液あたり1100細胞のベースライン閾値の十分下であり、平均数は141であった。非上皮細胞癌の患者のサンプル(中皮腫ならびにおそらく腎細胞および胸腺細胞)ならびに血液学的癌、
多発性骨髄腫(EpCAM決定子を担持しない全部の癌細胞であると考えられる)について、各患者の計数はしばしば1100というベースラインより下でありかつ平均181であった。上皮悪性病変について3.5mlあたりの平均計数は1,845であった。図1Bはこのデータを示す。
検査の診断の正確さは選ばれる閾値に依存する。この閾値は追加データにより示されるとおり当業者により容易に決定されることが可能である。より高い閾値はより小さい感受性を伴いより高い特異性をもたらす。これまでに収集されたデータ(表3Aおよび3B)から、これは図1Cに示される受信者動作特性曲線に見ることができかつ下に表4に示される。
癌患者の全員が非常に高レベルを有するわけではない。多くの患者は100細胞/ml
PFを越える細胞数を有した。より小さい計数を伴う患者の腫瘍がCK決定子を喪失していたかもしれない、若しくは化学療法が胸水中の腫瘍細胞の数を低下させたこと、または腫瘍細胞が上皮間葉移行を受け、そしてEpCAM+決定子を喪失していた進行した病期の癌、が現在疑われている。加えて、高い平均細胞計数を示すサンプルについて(表4を参照されたい)、血液サンプル中のCTCを測定することと異なり、より多い細胞計数は必ずしも癌のより悪い病期を示さないと現在理論づけられている。
表2Aおよび2Bに示されるとおり、患者CTCPF−019およびUPPCC−23510−011について、細胞学的評価は、これらの患者からの胸腔内液サンプルが悪性病変について陰性であったことを示した。実施例3に記述される方法は実施例2の細胞学的評価がしたよりも感受性の検出を提供し、そして3.5mlの胸腔内液あたり100 CTCのベースラインカットオフを使用する場合にこれら2患者で反対の結果に達した。これらの結果は、胸水中の癌の現在の診断方法若しくはその鑑別診断での現在の補助方法の価値を示す。
下の表5は表3BのコホートUPCCについての診断により並べ替えられた3.5mlの胸腔内液あたりの腫瘍細胞(CTC)の平均数を要約する。図1Aのグラフは、病因に従った各被験体の3.5mlあたりのCTCの数の散布図表示のこのデータおよび本図が元のデータを裏付けることを具体的に説明する。
上の表中のデータで上に示されたとおり、実施例3に記述される方法はより正確かつ感受性の検出を提供し、そして実施例2の細胞学的評価が決定的でなかった若しくは正しくなかった患者について悪性病変を診断した。
バックグラウンド染色レベルを低下させるため第二の染色マーカー(クローディン4)を使用した予備データもまた収集した。密接なタンパク質に会合したクローディン4(CL4)は上皮起源の悪性細胞中に存在するがしかし中皮細胞中にしないことが示された。PF細胞学で、反応性中皮細胞を悪性起源のものと区別することが困難であり得る。EPCAM+/サイトケラチン+/CD45−/DAPI+であった細胞をその後およそ80例の患者でクローディン4について染色した。染色のバックグラウンドレベルは顕著に低下された。良性疾患の中央値は0細胞/3.5ml、悪性非上皮腫瘍については2細胞/3.5ml、および悪性上皮腫瘍については783細胞/3.5mlであった。図1Dおよび1Eは診断に対する細胞計数の分布を示す。
CellSearch(R)系を使用する腫瘍細胞の特徴づけ
本実施例において、腫瘍細胞を数え上げかつ多様なバイオマーカーで特徴づける。CellTracks(R)アナライザーIIは、3色を腫瘍細胞の数え上げのため使用しかつ第四の色が目的のバイオマーカーで腫瘍細胞を特徴づけるための利用可能である4色顕微鏡である。本実施例で検査されるバイオマーカーは、Ki67、EGFR、Muc1、Ki67、CD44、CEA、CD146、βカテニン、メソテリン、ならびにサイトケラチン5、6および7である。CellSearch(R)循環腫瘍細胞系(Veridex
LLC)を使用して胸腔内液中の循環腫瘍細胞を同定しかつその数を数え上げる。腫瘍細胞の特徴づけのためのサンプル調製は、蛍光色素に複合された目的のバイオマーカーがCellTracks(R)AutoPrep系でマーカー試薬として使用されることを除き、実施例3で記述されたと同一である。
表6は患者サンプル番号PF23501−44、−49、−51、−57、−61、−62、−63、−67、−75および02501−053により同定される異なる患者からの腫瘍細胞上の多様なマーカーの発現を示す。マーカー発現は各患者について変動しかつ各患者について特徴的なプロファイルを示す。本実施例は、胸腔内液から単離された腫瘍細胞を処置の予測および個別化された処置の選択のため特徴づけ得ることを示す。
核酸分析のための腫瘍細胞の単離
本実施例において、腫瘍細胞をCellSearch CTC Profileキット(Veridex LLC)を使用してCellTracks AutoPrep系により胸水から単離する。該Profileキットは胸腔内液から白血球および他の血液細胞の大部分を枯渇させることにより腫瘍細胞を濃縮して、それによりバックグラウンドを最小限とする。CellSearch CTC Profileキットは腫瘍細胞を単離するためのみの試薬を含有し、そしていかなる染色試薬も含有しないか、若しくは実施例3に論考されるとおり細胞を透過性にしない。
A.7.5mlの処理されずかつ希釈されない胸腔内液をCellSaveチューブ(Veridex LLC)若しくはEDTAチューブに入れる。
B.PBSを除去し、そして細胞成分を所望の希釈まで新たな緩衝液と混合し、そしてその後磁性流体を添加する。磁性流体は上皮細胞接着分子(EpCAM)を標的とする抗体で被覆されたポリマー層により囲まれる磁性核をもつナノ粒子よりなる。磁性粒子と抗体の複合体は細胞成分中の上皮細胞に特異的に結合する。磁性粒子と抗体の複合体を含有するチューブを磁性キュベット中でインキュベートし、それは磁性粒子が結合された上皮細胞をチューブの側に誘引する。残存する液体および結合されない細胞を吸引しかつ磁石を除去する。結合された細胞をその後緩衝液に再懸濁し、上皮細胞が濃縮された液体をもたらす。
C.濃縮後に、核酸画分を、被検体に適切かつ当業者に既知の技術を使用して下流の分析のためPETCから単離する。単離されうる核酸画分は、全RNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNAおよびDNAを制限なしに包含する。
D.単離された核酸をその後目的の被検体に適切な技術を使用して分析する。下流の分析方法は、PCR、RT−PCR、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、DNAシークエンシング、RNAシークエンシング、変異解析、SNP検出、マイクロアレイ分析およびメチル化状態決定を制限なしに包含する。
蛍光in situハイブリダイゼーションによる胸水腫瘍細胞の特徴づけ
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は異数染色体、転座、遺伝子増幅および/若しくは欠失のような染色体突然変異を同定するのに使用される技術である。腫瘍の変異状態を特徴づけることは治療的処置に対する応答の予測において有用であり、治療的臨床試験のための患者転帰患者層別についての予後情報を提供する。本実施例は、FISH分析がPETC細胞でどのように実施されるかを記述する。FISHという用語はCISH(発色in situハイブリダイゼーション)と互換性に使用されることを意図している。
A.細胞を濃縮し、そして実施例3および4に記述されるところのCellSearch(R)技術を使用して走査し、ならびにその後FISHのため処理する。
B.細胞を、メタノール/酢酸固定剤の添加によりカートリッジのガラス表面に固定し、そしてその後風乾する。本方法はPETC細胞の大多数の場所をカートリッジ内に保存する。サンプルは−20℃で数年間保存しうる。
C.標識されたハイブリダイゼーションプローブをサンプルに適用する。サンプルおよびプローブを80℃で5分間共変性し、その後42℃で一夜ハイブリダイズさせる。本実施例において、第1、7、8および17染色体のセントロメアに特異的なサテライト計数プローブ(satellite enumeration probe)を、それぞれPlatinum BrightTM 647、Platinum BrightTM 550、Platinum BrightTM 505およびPlatinum BrightTM
415で蛍光標識する。Platinum BrightTM キットはKreatech、オランダ・アムステルダムから得る。ハイブリダイゼーション後にストリンジェントな洗浄を使用して非特異的ハイブリダイゼーションを除去し、そしてサンプルをDAPIで対染色する。
D.PETCの画像を、FISHプローブで使用される蛍光色素を可視化するための特
殊なソフトウェア、40倍対物レンズおよび適切なフィルターキューブで改変されているCellTracks(R)機器を使用して取得する。CellSearch走査からの保管データを使用してカートリッジ較正を実施し、また、CellSearch走査で同定されるPETCの位置を再度突き止める。5個のz−stackから製造される混成画像を各腫瘍細胞の各蛍光色素について取得する。
図2A〜2Gは上述されたところの同一のPETCでの連続免疫染色およびFISHの結果を示す。
より大きな研究
上の初期データは本方法が感度および特異性に関して大きな診断の可能性を有することを示唆している。該方法の性能特徴を決定するため、胸腔内液を全部志願者の150名の被験体から収集し、それらは良性の浸出液および多様な悪性胸水の双方を包含した。上の実施例で概説された方法に従い、7.5mlの胸腔内液を検査施設で受領された各患者サンプルから抽出し(50cc以上収集された症例において)、そしてCellSaveチューブに入れた。チューブを実施例3に記述された同一技術により分析した。
化学分析の結果、細胞学の結果および他の生検を包含する浸出液に関する臨床情報を収集した。診断が液体収集の時点でなされなかった場合、これらの被験体体は最長12か月間若しくは診断がなされるまで追跡されている。
全150サンプルが収集されたとは言え、比較的多数の患者がなお臨床的に追跡されている。全部のデータが収集された後に、検査の性能特徴を標準的統計学的アプローチを使用して計算する。一態様において、該方法は、クローディン4、サバイビン若しくはテロメラーゼのような「汎悪性」タンパク質に対する二次抗体での免疫染色のような付加的な段階を包含することにより改変される。これらが腫瘍性起源と矛盾しない染色体異常を有するかどうかを決定するための、胸腔内液から単離された癌細胞での染色体若しくは蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実施することを包含するなお付加的な方法段階。
本明細に列挙される全文書および2011年7月28日出願の米国仮出願第61/512,576号明細書は引用することにより本明細書に組み込まれる。本明細若しくは請求の範囲の多様な態様は「含んでなる」言語を使用して提示される一方、多様な環境下で、関連する態様が「よりなる」若しくは「本質的によりなる」言語を使用してもまた記述されうる。「ある(a)」若しくは「ある(an)」という用語は1若しくはそれ以上を指すことが注目されるべきであり、例えば、「ある試薬(a reagent)」は1種若しくはそれ以上の試薬を表すと理解される。であるから、「ある(a)」(若しくは「ある(an)」)、「1若しくはそれ以上」および「最低1つ」という用語は本明細書で互換性に使用される。本発明は特定の態様を参照して記述された一方、改変が本発明の技術思想から離れることなくなされ得ることが認識される。こうした改変は付随される請求の範囲の範囲内にあることを意図している。

Claims (31)

  1. 哺乳動物被験体の胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の存在によって特徴付けられる、癌の診断若しくは鑑別診断方法であって、該方法が
    a)被験体の胸腔内液若しくは漿液のサンプルを、癌細胞上の決定子に結合するがしかし胸腔内液若しくは漿液中の他の細胞および細胞以外の成分にベースライン閾値より上で結合しない第一のリガンドに結合されたコロイド状磁性粒子、と接触させること;ならびに
    b)胸腔内液と磁性粒子の混合物若しくは漿液と磁性粒子の混合物を磁場に曝し、該胸腔内液若しくは漿液中に存在する場合はリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞が濃縮された細胞画分を生じること
    を含んでなる、上記方法。
  2. c)胸腔内液若しくは漿液中のリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞の数について濃縮された画分を分析すること;および
    d)胸腔内液若しくは漿液中のベースライン閾値より大きいリガンドに結合された磁性粒子が結合された細胞の数を同定することにより癌の鑑別診断を提供すること
    をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
  3. 胸腔内液が胸水である、請求項1に記載の方法。
  4. 接触段階、曝す段階および分析段階により胸腔内液若しくは漿液を分析する前若しくは後に異常細胞の存在について胸腔内液若しくは漿液の細胞学的若しくは免疫細胞学的検査を実施することをさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。
  5. 胸腔内液若しくは漿液を前記接触段階の前に希釈することをさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
  6. 胸腔内液若しくは漿液が希釈液で1:10の比で希釈される、請求項5に記載の方法。
  7. 接触段階が、被験体から胸腔内液サンプル若しくは漿液サンプルを抜き出すことの24時間以内に起こる、請求項1に記載の方法。
  8. 胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に、癌細胞若しくは非癌細胞で発現される抗原に特異的な第二のリガンドか、または濃縮された画分中の他の細胞若しくは細胞破片から非癌細胞を識別することが可能である試薬、を添加すること;
    胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に、癌細胞の第二の細胞決定子を結合する標識試薬を添加すること;
    胸腔内液若しくは漿液と磁性粒子の混合物に、細胞破片から生存細胞を識別する細胞特異的色素を添加すること;あるいは
    濃縮された画分から非癌細胞、無核細胞、細胞破片および結合されない物質を分析前に精製すること
    を含んでなる1若しくはそれ以上の付加的な段階をさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。
  9. 第一のリガンドが最低1種の癌細胞決定子に特異的なモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントである、請求項1に記載の方法。
  10. さらに、第二のリガンドが、胸腔内液中の白血球に特異的に結合するか、若しくは癌細胞上の特異的腫瘍マーカーに結合して、胸腔内液若しくは漿液中に存在する癌細胞の特異
    性を高める若しくはそれらを同定する、請求項8に記載の方法。
  11. 第一のリガンド、第二のリガンド若しくは標識試薬の最低1種が肺癌細胞若しくは乳癌細胞に特異的に結合する、請求項8に記載の方法。
  12. 癌が、肺癌、リンパ腫、中皮腫、転移性乳癌、転移性卵巣癌および転移性前立腺癌よりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  13. 第一のリガンドが上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
  14. 第一のリガンドがL1細胞接着分子(L1CAM)に特異的に結合する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
  15. 第一のリガンドがクローディン4に特異的に結合する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
  16. 第一のリガンドがEpCAM若しくはL1CAMに特異的に結合し、かつ、第二のリガンドがクローディン4に特異的に結合する、請求項8に記載の方法。
  17. ベースライン閾値が3.5mlの胸腔内液あたり約1100 EpCAM+細胞である、請求項13に記載の方法。
  18. EPCAM+細胞が1種若しくはそれ以上の付加的な特異的腫瘍マーカーについて染色される、請求項13に記載の方法。
  19. 付加的な特異的腫瘍マーカーがサイトケラチン、クローディン4、サバイビン若しくはテロメラーゼの1種である、請求項18に記載の方法。
  20. 胸痛、席、呼吸困難、疲労および炎症よりなる群から選択される臨床症状について哺乳動物被験体の臨床評価を実施すること;
    被験体からの胸腔内液若しくは漿液サンプルを、前記サンプル中のタンパク質若しくはアルブミンの濃度を測定する診断試薬と接触させること;ならびに
    被験体の疾患の間かまたは被験体の癌の処置の前若しくは後の異なる時点で、胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の数を分析するために、請求項1の前記段階(a)および(b)を反復すること
    を含んでなる1若しくはそれ以上の段階をさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。
  21. 前記被験体が癌に対し処置されておりかつ該方法が処置の有効性若しくは予後の決定を可能にする、請求項1に記載の方法。
  22. 前記胸水が、接触段階前の被験体からの胸腔内液のサンプルの決定的でない細胞学的若しくは免疫細胞化学的検査後に未知の病因のものであると決定された、請求項1に記載の方法。
  23. 漿液若しくは胸腔内液のサンプルを、接触段階の前に本質的に均質な大きさの孔を含んでなるフィルターを通して濾過すること;
    予後および予測マーカーを使用して、濃縮された細胞画分を分析すること;
    遺伝子の変異解析を使用して、濃縮された細胞画分を分析すること;ならびに
    濃縮された細胞画分の蛍光in situハイブリダイゼーションを実施すること、
    を含んでなる1若しくはそれ以上の段階を含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。
  24. 予後および予測マーカーが、EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox−2、PTEN、IGF−1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMAおよびPSAよりなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
  25. 遺伝子がEGFR、BRAF、ARAF、K−rasおよびP53よりなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
  26. 細胞学的若しくは分子マーカーを使用して、濃縮された細胞画分を特徴づけること;
    濃縮された細胞画分を培養すること;および
    細胞学的若しくは分子いずれかのマーカーを使用して、濃縮された細胞画分を特徴づけること
    を含んでなる1若しくはそれ以上の付加的な段階を実施することをさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。
  27. 培養された濃縮された画分を分析すること;および
    培養された濃縮された画分で薬物動態研究を実施すること
    を含んでなる1若しくはそれ以上の段階をさらに含んでなる、請求項26に記載の方法。
  28. 哺乳動物被験体の胸腔内液若しくは漿液中の癌細胞の存在を特徴とする癌の診断若しくは鑑別診断方法であって、該方法が
    a)既知の本質的に均一の孔径の孔を含んでなるフィルターで被験体の胸腔内液若しくは漿液のサンプルを濾過して胸水腫瘍細胞(PETC)を濃縮すること;
    b)濾過されたPETCの数を分析すること;および
    c)胸腔内液若しくは漿液中のベースライン閾値より大きい濾過されたPETCの数を同定することにより癌の鑑別診断を提供すること
    を含んでなる、上記方法。
  29. 予後および予測マーカーを使用して、濃縮された細胞画分を分析すること;
    遺伝子の変異解析を使用して、濃縮された細胞画分を分析すること;および
    濃縮された細胞画分の蛍光in situハイブリダイゼーションを実施すること
    を含んでなる1若しくはそれ以上の段階を含んでなる、請求項28に記載の方法。
  30. 予後および予測マーカーが、EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox−2、PTEN、IGF−1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMAおよびPSAよりなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
  31. 遺伝子がEGFR、BRAF、ARAF、K−rasおよびP53よりなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6238856B2 (ja) * 2014-08-25 2017-11-29 シスメックス株式会社 尿中異型細胞の分析方法、尿分析装置および体液中異型細胞の分析方法
CA3000438A1 (en) * 2015-09-28 2017-04-06 The Governing Council Of The University Of Toronto Device for magnetic profiling of particles in a flow
SG11202004646TA (en) * 2017-12-01 2020-06-29 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Methods for cell enrichment and isolation
US10696961B2 (en) 2017-12-01 2020-06-30 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Magnetic cell isolation techniques
WO2021119470A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 University Of Miami Materials and methods for extracellular vesicle detection

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63109793A (en) * 1986-10-28 1988-05-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Anti-human-mesothelial-cellular monoclonal antibody
JPH09510779A (ja) * 1994-03-10 1997-10-28 フォドスタッド オイステイン 特定化あるいは混合した細胞母集団または混合細胞母集団を含む溶液内の特定標的細胞を検出する方法および装置
JP2008538509A (ja) * 2005-04-21 2008-10-30 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー パリレンメンブレンフィルターの使用
JP2009525478A (ja) * 2006-01-31 2009-07-09 ビオメリュー 癌、特に乳癌、甲状腺癌及び肺癌のインビトロ診断のためのProNGFアッセイのための方法とProNGFの治療的使用
JP2010501549A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法
WO2010102177A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Becton, Dickinson And Company Glycodelin monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4939240A (en) 1983-03-04 1990-07-03 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies to human breast carcinoma cells and their use in diagnosis and therapy
CA2065874C (en) 1989-09-15 2001-12-11 Joseph P. Brown Hybridoma ct43 producing a monoclonal antibody to a mucin epitope of colorectal cancer
WO1994006929A1 (en) 1992-09-17 1994-03-31 Merck Patent Gmbh Small cell lung carcinoma specific antibody and antigen
US6660159B1 (en) 1996-06-07 2003-12-09 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
US6890426B2 (en) 1996-06-07 2005-05-10 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
US5985153A (en) 1996-06-07 1999-11-16 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods employing an internal magnetic capture gradient and an external transport force
US6136182A (en) 1996-06-07 2000-10-24 Immunivest Corporation Magnetic devices and sample chambers for examination and manipulation of cells
US6790366B2 (en) 1996-06-07 2004-09-14 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
AU760560B2 (en) 1998-02-12 2003-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
US7282350B2 (en) 1998-02-12 2007-10-16 Immunivest Corporation Labeled cell sets for use as functional controls in rare cell detection assays
US6623982B1 (en) 1999-07-12 2003-09-23 Immunivest Corporation Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles
IL156741D0 (en) 2001-02-12 2004-02-08 Immunivest Corp Cartridge for containing a specimen sample for optical analysis
JP2005502863A (ja) * 2001-08-23 2005-01-27 イムニベスト・コーポレイション 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析
GB2424273B (en) * 2002-11-14 2007-06-27 Univ Nottingham Method for preparing tumour marker protein
AU2005217375C1 (en) * 2004-02-19 2012-06-07 Yale University Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
CA2512295A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-16 Stemcell Technologies Inc. Magnetic target entity separation method
US7846743B2 (en) * 2005-04-21 2010-12-07 California Institute Of Technology Uses of parylene membrane filters
EP2037265A1 (en) * 2007-09-17 2009-03-18 Adnagen AG Solid phase cell isolation and/or enrichment method

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63109793A (en) * 1986-10-28 1988-05-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Anti-human-mesothelial-cellular monoclonal antibody
JPH09510779A (ja) * 1994-03-10 1997-10-28 フォドスタッド オイステイン 特定化あるいは混合した細胞母集団または混合細胞母集団を含む溶液内の特定標的細胞を検出する方法および装置
JP2008538509A (ja) * 2005-04-21 2008-10-30 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー パリレンメンブレンフィルターの使用
JP2009525478A (ja) * 2006-01-31 2009-07-09 ビオメリュー 癌、特に乳癌、甲状腺癌及び肺癌のインビトロ診断のためのProNGFアッセイのための方法とProNGFの治療的使用
JP2010501549A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法
WO2010102177A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Becton, Dickinson And Company Glycodelin monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of ovarian cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5015000877; MASAHIRO HORIKAWA: ONCOLOGY REPORTS V25 N5, 20110218, P1413-1420 *
JPN5015000886; ERIC KIELHORN: 'USE OF MAGNETIC ENRICHMENT FOR DETECTION OF CARCINOMA CELLS IN FLUID SPECIMENS' CANCER V94 N1, 20020101, P205-211 *

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