MX2010004966A - Monitoreo de cambios seriales en celulas circulantes de cancer de mama en ratones. - Google Patents

Abstract

El sistema CellTracks(r) proporciona un sistema para enumerar las CTC en sangre. El sistema concentra inmunomagnéticamente células epiteliales, etiqueta fluorescentemente las células e identifica y cuantifica CTC. El número absoluto de CTC detectadas en la carga tumoral de la sangre periférica es, en parte, un factor en la predicción de la supervivencia, el tiempo a la progresión y la respuesta al tratamiento. Los estudios preclínicos de células tumorales circulantes (CTC) se han limitado por la incapacidad de monitorear repetitivamente las CTC en modelos animales. La presente invención proporciona un método para enumerar CTC en muestras de sangre obtenidas de ratones vivos, usando un protocolo similar a un sistema diagnóstico in vitro para cuantificar CTC en pacientes. Por consiguiente, esta tecnología puede adaptarse para el monitoreo en serie de CTC en modelos de ratón de tumores xenoinjertos de cáncer de mama humano.

Description

MONITOREO DE CAMBIOS SERIALES EN CELULAS CIRCULANTES DE CANCER DE MAMA EN RATONES REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente es una solicitud no provisional que reivindica el beneficio de prioridad de las Solicitudes de patentes provisionales de Estados Unidos núm. 61/001 ,418, archivadas el 01 de noviembre de 2007. La solicitud mencionada anteriormente se incorpora, en la presente, en su totalidad como referencia.

ANTECEDENTES Campo de la invención La invención se relaciona, en general, con el monitoreo del cáncer y la evaluación de la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer metastático, sobre la base de la presencia de células circulantes de cáncer (CTC, por sus siglas en inglés) morfológicamente intactas en la sangre. Más específicamente, se describen métodos, reactivos y aparatos para evaluar células circulantes de cáncer en modelos animales.

Antecedentes de la materia Las células epiteliales tumorales no hematógenas se identificaron, primero, en la sangre de un paciente con cáncer de mama, hace aproximadamente 150 años. Desde ese momento, se ha mostrado que las CTC son una conexión crítica entre el cáncer primario, una etapa de la enfermedad en la que la cura es posible, y la enfermedad metastática, que continua siendo la causa principal de muerte en la mayoría de los cánceres. Los estudios clínicos han mostrado que las CTC son un biomarcador predictivo y de pronóstico poderoso en cáncer de mama metastático, y se han informado hallazgos similares en cáncer de próstata y cáncer colorrectal. A partir de esta información, se mostró que las CTC son representativas de la biología subyacente que impulsa el cáncer metastático y sugiere que un mayor análisis celular y molecular de estas células puede revelar nuevos conocimientos acerca de la regulación molecular de la metástasis y la respuesta al tratamiento.

Las investigaciones acerca del rol de las CTC en la metástasis y la expansión de su uso como biomarcador en estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos se han limitado a la fase clínica de desarrollo de fármacos. En general, se acepta que la mayoría de los pacientes con cáncer no mueren a causa del tumor primario, pero sucumben, en cambio, a las metástasis: múltiples colonias tumorales expandidas establecidas por células malignas que se separan del tumor original y viajan por el cuerpo, frecuentemente, a sitios distantes. La estrategia terapéutica más exitosa en el cáncer es la detección temprana y la extracción quirúrgica del tumor, mientras aún se encuentra limitado al órgano. Se ha probado que la detección temprana del cáncer es factible para algunos cánceres, particularmente en donde existen pruebas diagnósticas adecuadas tales como el Papanicolaou en cáncer cervical, la mamografía en cáncer de mama y el antígeno prostático específico (PSA, por sus siglas en inglés) sérico en cáncer de próstata. Sin embargo, muchos cánceres detectados en etapas tempranas han establecido micrometástasis antes de la resección quirúrgica. Por lo tanto, la determinación temprana y certera del potencial maligno del cáncer es importante para la selección del tratamiento apropiado.

Si un tumor primario se detecta lo suficientemente temprano, frecuentemente, puede eliminarse mediante cirugía, radiación, quimioterapia o alguna combinación de estos tratamientos. Desafortunadamente, las colonias metastáticas son difíciles de detectar y eliminar y, frecuentemente, es imposible tratarlas a todas de manera exitosa. Por ello, las metástasis pueden considerarse el suceso concluyente en la progresión natural del cáncer. Además, la capacidad de metastatizar es una propiedad que solamente caracteriza a un tumor maligno.

Sobre la base de la complejidad del cáncer y la metástasis del cáncer y la frustración en el tratamiento de pacientes con cáncer durante los años, se han realizado muchos intentos para desarrollar pruebas de diagnóstico para guiar el tratamiento y monitorear los efectos de ese tratamiento en la metástasis o recaída.

Uno de los primeros intentos de desarrollar una prueba útil para el diagnóstico oncológico fue la formulación de un inmunoensayo para el antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés). Este antígeno aparece en células fetales y reaparece en células tumorales en ciertos cánceres. Se han realizado esfuerzos exhaustivos para evaluar la utilidad de las pruebas de detección de CEA así como de muchos otros antígenos "tumorales", tales como antígeno prostético específico (PSA), CA 15.3, CA 125, antígeno prostético específico de membrana (PSMA, por sus siglas en inglés), CA 27.29, p27 encontrados en muestras de tejido o sangre como desechos celulares solubles.

Las pruebas adicionales para predecir la progresión tumoral en pacientes con cáncer se han focalizado en los índices enzimáticos de correlación, tal como la actividad telomerasa, en muestras de biopsia de tumor cosechadas con una indicación de un pronóstico favorable o desfavorable (patentes de Estados Unidos núms. 5,693,474; 5,639,613). La evaluación de la actividad enzimática en este tipo de análisis puede incluir procedimientos de laboratorio que demandan mucho tiempo, tales como la electroforesis en gel y el análisis de Western Blot. Además, existen variaciones en la señal al sonido y la sensibilidad en el análisis de las muestras, basadas en el origen del tumor. A pesar de estas deficiencias, los marcadores tumorales solubles específicos pueden proporcionar un enfoque rápido y eficaz para desarrollar una estrategia terapéutica al comienzo del tratamiento. Por ejemplo, se ha mostrado que las detecciones de suero HER-2/neu y suero CA 15-3 en pacientes con cáncer de mama metastático son factores pronóstico para el cáncer de mama metastático (Ali S.M., Leitzel K., Chinchilli V.M., Engle L., Demers L, Harvey H.A., Carney W., Allard J.W. y Lipton A., Relationship of Serum HER-2/neu and Serum CA 1 5-3 in Patients with Metastatic Breast Cáncer, Clinical Chemistry, 48(8): 1314-1320 (2002)). El HER-2/neu aumentado resulta en una respuesta reducida al tratamiento hormonal y es un factor pronóstico importante en la predicción de respuestas al cáncer metastático de mama con receptor hormonal positivo. Por lo tanto, en cánceres en donde se asocia el producto del oncogen HER-2/neu, se han descrito métodos para monitorear el tratamiento o evaluar los riesgos, basados en niveles elevados (patente de Estados Unidos núm. 5,876,712). Sin embargo, en ambos casos, los niveles de base durante la remisión, o aun en normales saludables, son relativamente altos y pueden superponerse con concentraciones encontradas en pacientes, por lo que requieren monitoreos y pruebas múltiples para establecer los valores iniciales y los niveles aislados dependientes del paciente.

En el cáncer de próstata, se ha probado que los niveles de PSA en suero resultan útiles en la detección temprana. Cuando se usa con un examen físico y una biopsia de seguimiento, la prueba de PSA ha mejorado la detección del cáncer de próstata en una etapa temprana, cuando mejor se lo trata.

Sin embargo, la prueba de PSA o de PS A relacionada deja mucho que desear. Por ejemplo, los niveles elevados de PSA se correlacionan semanalmente con la etapa de la enfermedad y parecen no ser un indicador confiable del potencial metastático del tumor. Esto puede deberse, en parte, al hecho de que el PSA es un componente del tejido prostético normal y del tejido de hiperplasia prostática benigna (HPB). Además, aproximadamente el 30 % de los pacientes con presunto cáncer de próstata localizado y concentraciones bajas de PSA sérico pueden padecer enfermedad metastática (Moreno y otros, Cáncer Research, 52:61 10 (1992)).

Marcadores genéticos: Un enfoque para determinar la presencia de células tumorales malignas de próstata ha sido la realización de pruebas de detección de la expresión de ARN mensajero de PSA en sangre. Esto se está realizando mediante el trabajoso procedimiento de aislar todo el ARNm de la muestra de sangre y realizar PCR con transcripción inversa. No se ha descrito correlación importante entre la presencia de células tumorales en la sangre y la capacidad para identificar qué pacientes se beneficiarían con tratamientos más enérgicos (Gomella LG., J of Urology, 158:326-337 (1997)). Además, frecuentemente, se observan falsos positivos usando esta técnica. Existe un inconveniente adicionado, que es que hay un límite finito y práctico a la sensibilidad de esta técnica, basado en el tamaño de la muestra. Por lo general, la prueba se realiza sobre 05 a 106 células separadas de células interferentes de sangre rojas, correspondientes a un límite práctico menor de sensibilidad de una célula tumoral/0.1 mi de sangre (aproximadamente 10 células tumorales en un mi de sangre), antes de que se detecte una señal. Se ha sugerido una sensibilidad mayor mediante la detección de ARN hK2 en células tumorales aisladas de la sangre (patentes de Estados Unidos núms. 6,479,263; 6,235,486).

Se han usado estudios basados en RT-PCR cualitativa con nucleótidos marcadores basados en sangre para indicar que el potencial de supervivencia libre de enfermedad para pacientes con ARNm de CEA positivo en sangre preoperativa es peor que el de pacientes negativos para ARNm de CEA (Hardingham J.E., Hewett P.J., Sage R.E., Finch J.L, Nuttal J.D., Kotasel D. and Dovrovic A., Molecular detection of blood-borne epithelial cells ¡n colorrectal cáncer patients and ¡n patients with benign bowel disease, Int. J. Cáncer 89:8-13 (2000): Taniguchi T., Makino M., Suzuki K., Kaibara N., Prognostic significance of reverse transcriptase-polymerase chain reaction measurement of carcinoembryonic antigen ARNm levéis in tumor drainage blood and peripheral blood of patients with colorrectal carcinoma, Cáncer 89:970-976 (2000)). El valor pronóstico de este criterio de valoración depende de los niveles de ARNm de CEA, que también se inducen en individuos saludables por G-CSF, citocinas, esteroides o factores ambientales. Por consiguiente, el marcador de ARNm de CEA carece de especificidad y, claramente, no es exclusivo para las células circulantes de cáncer colorrectal.

Los estudios mencionados anteriormente, aunque parecen pronósticos bajo condiciones experimentales, no proporcionan información consistente con un periodo de seguimiento prolongado o a una especificidad satisfactoria. Por consiguiente, estos esfuerzos han probado ser algo inútiles ya que la aparición de ARNm para antigenos en la sangre, por lo general, no ha sido predictiva para la mayoría de los cánceres y, frecuentemente, se detectan cuando hay pocas esperanzas para el paciente.

En su lugar, la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) en tiempo real ha sido el único procedimiento informado que correlaciona la detección cuantitativa de células tumorales circulantes con el pronóstico de los pacientes. La RT-PCR en tiempo real se ha usado para cuantificar ARNm de CEA en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal (Ito S., Nakanishi H., Hirai T., Kato T., Kodera Y., Feng Z., Kasai Y., Ito K., Akiyama S., Nakao A., y Tatematsu M., Quantitative detection of CEA expressing free tumor cells in the peripheral blood of colorrectal cáncer patients during surgery with real-time RT-PCR on a Light Cycler, Cáncer Letters, 183:195-203 (2002)). Los resultados sugieren que las células tumorales se derramaron en el torrente sanguíneo (posiblemente, durante procedimientos quirúrgicos o a partir de micrometástasis ya existentes al momento de la operación) y tuvieron como consecuencia escasos resultados para el paciente en pacientes con cáncer colorrectal. La sensibilidad de este ensayo proporcionó un intervalo detectable de forma reproducible con sensibilidad similar a la RT-PCR convencional. Como se mencionó, estos intervalos de detección se basan en conversiones no confiables de producto amplificado al número de células tumorales. El conteo de células extrapolado puede incluir CTC dañadas incapaces de proliferación metastática. Más aun, los ensayos basados en PCR se encuentran limitados por la posible contaminación de las muestras, junto con una incapacidad para cuantificar las células tumorales. Más importante aún, los métodos basados en PCR, citometría de flujo, enzimas citoplásmicas y antigenos tumorales circulantes no pueden proporcionar información morfológica esencial que confirme la integridad estructural que subyace al potencial metastático de las CTC presuntas y, por lo tanto, constituyen ensayos experimentales funcionalmente menos confiables que los métodos de diagnóstico por imágenes altamente sensibles abarcados, en parte, en esta invención.

La detección de células tumorales intactas en sangre proporciona un enlace directo con las enfermedades metastáticas recurrentes en pacientes con cáncer que han sufrido la resección de su tumor primario. Desafortunadamente, la misma expansión de células malignas sigue sin ser detectada por los procedimientos convencionales de clasificación de tumores por etapas. Los estudios recientes han mostrado que la presencia de una única célula carcinómica en la médula ósea de los pacientes con cáncer es un factor pronóstico independiente para la recaída metastática (Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G. Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cáncer: a prognostic factor for distant metástasis. J Clin Oncol, 10:1534-1539, 1992). Pero estas técnicas invasivas se consideran indeseables o inaceptables para ensayos clínicos múltiples o de rutina, comparados con la detección de células tumorales epiteliales diseminadas en la sangre.

Un enfoque alternativo incorpora tecnología de separación inmunomagnética y proporciona mayor sensibilidad y especificidad en la detección inequívoca de células de cáncer intactas circulantes. Esta herramienta de diagnóstico simple y sensible, como se describe (patentes de Estados Unidos núms. 6,365,362; 6,551 ,843; 6,623,982; 6,620,627; 6,645,731 ; documentos WO 02/077604; WO 03/065042; y WO 03/019141) se usa en la presente invención para proporcionar un modelo animal preclínico para enumerar CTC.

El ensayo depende de la adquisición de una muestra de sangre conservada de un paciente. La muestra de sangre de un paciente con cáncer (documento WO 03/018757) se incuba con cuentas magnéticas, recubiertas con anticuerpos dirigidos contra un antígeno superficie de una célula epitelial, como por ejemplo, EpCAM. Después de etiquetarlas con nanopartículas magnéticas recubiertas con anti-EpCAM, las células etiquetadas magnéticamente se aislan usando un separador magnético. La fracción enriquecida inmunomagnéticamente se procesa más aún para el análisis inmunocitoquímico corriente abajo o la citometría de imagen, por ejemplo, en el sistema CelITracks® (Veridex LLC, NJ). La fracción magnética también puede usarse para el análisis inmunocitoquímico corriente abajo, RT-PCR, PCR, FISH, citometría de flujo u otros tipos de citometría de imagen.

El sistema CelITracks® usa selección y separación inmunomagnética para enriquecer y concentrar altamente cualquier célula epitelial presente en muestras completas de sangre. Las células capturadas se etiquetan de forma detectable con un marcador de leucocitos específico y con uno o más anticuerpos monoclonales fluorescentes específicos para células tumorales, para permitir la identificación y enumeración de las CTC capturadas, así como la diferenciación instrumental o visual inequívoca de las células contaminantes que no son destino. Este ensayo permite la detección de células tumorales aun en las etapas tempranas de masa tumoral baja. La modalidad de la presente invención no se limita al sistema CelITracks®, si no que incluye cualquier aislamiento y protocolo de diagnóstico por imágenes de sensibilidad y especificidad comparables.

Los protocolos preclínicos disponibles en la actualidad no han demostrado un medio consistentemente confiable para monitorear repetitivamente las CTC en la evaluación de la progresión del cáncer de mama metastático (MBC, por sus siglas en inglés). El desarrollo de un modelo de ratón confiable para evaluar avances diagnósticos y terapéuticos en la investigación del cáncer proporcionaría un medio para ampliar el desarrollo de la investigación en estas áreas. Por lo tanto, existe una necesidad clara de detectar adecuadamente las células de cáncer con potencial metastático, no sólo en MBC si no también en cánceres metastáticos en general. Además, esta necesidad se acentúa por la necesidad de seleccionar el tratamiento más eficaz para un paciente dado.

La incapacidad de monitorear repetitivamente las CTC en los pequeños volúmenes de sangre disponibles en modelos animales preclínicos de cáncer de mama y otros cánceres ha restringido su uso al análisis de muestras obtenidas de extracciones de sangre terminal. Como consecuencia, no se ha establecido el estudio de cambios temporales en CTC durante la progresión del tumor y el tratamiento en un modelo animal vivo, como en ratones. Sin embargo, el uso de esta tecnología para evaluar en serie las CTC en ratones permitiría la integración de las evaluaciones de CTC en estudios preclínicos y clínicos. Caracterizar más aún los marcadores moleculares específicos en estas células permitiría el desarrollo temprano de ensayos diagnósticos "asociados" para tratamientos dirigidos, lo que aceleraría la traducción de nuevos protocolos de ensayo a ensayos clínicos en pacientes y, en última instancia, a la práctica clínica.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método y un medio para el modelado preclínico de metástasis de cáncer en ratones con xenoinjertos, incorporando herramientas de análisis clínico como el sistema CelITracks®, y se basa en el número absoluto, el cambio o las combinaciones de ambos de células epiteliales circulantes en pacientes con cáncer metastático. El sistema concentra inmunomagnéticamente células epiteliales, etiqueta fluorescentemente las células, identifica y cuantifica las CTC para realizar una enumeración positiva en modelos de tumores xenoinjertos de cáncer de mama humano.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 : perfil de análisis fluorescente de CelITracks® usado para confirmar objetos capturados como células tumorales humanas. Los tics indican una célula tumoral positiva basada en la imagen compuesta. Las imágenes compuestas derivan de la selección positiva para el Marcador celular epitelial (EC-PE) y para el colorante nuclear (NADYE). También se necesita una selección negativa para el marcador de leucocitos (L-APC) y para control (CNTL).

Figura 2: Cuantificación de células de cáncer de mama humano en muestras de sangre de ratones. Se adicionaron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 sin o con transducción estable de GFP a 100 µ? de muestras de sangre de ratones sin xenoinjertos tumorales. Se fijaron las muestras y se enriquecieron células epiteliales por aislamiento con cuentas inmunomagnéticas, usando un anticuerpo para molécula de adhesión celular epitelial. Las células recuperadas, después, se tiñeron con un anticuerpo para citoqueratina (8, 18 y 19) para identificar células epiteliales y distinguirlas de leucocitos teñidos con CD45. Las células nucleadas se identificaron mediante tinción con el tinte de ácido nucleico fluorescente diclorhidrato de 4,2-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se detectó GFP en células de cáncer en el canal de FITC. Se muestran imágenes representativas de células de cáncer de mama recuperadas.

Figura 3: Cuantificación de células de cáncer de mama humano en muestras de sangre de ratones. Se obtuvieron muestras de sangre terminal de ratones con xenoinjertos de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 por punción cardíaca y se analizaron en busca de CTC. Los números de CTC se representaron frente a volúmenes tumorales medidos por calibradores.

Figura 4: Análisis en serie de CTC en ratones. Se implantaron ratones con xenoinjertos de tumores ortotópicos de células de cáncer de mama humano SUM-159 (A) o SKBR-3 (B) y se midieron las CTC en aproximadamente 100 µ? de muestras de sangre por punción cardíaca, a intervalos aproximadamente semanales, hasta que los ratones se eutanizaron debido a la carga tumoral. Los datos de CTC se normalizaron a un volumen de 100 µ? y se representaron frente al volumen tumoral por individuo. Los números promedio de CTC fueron significativamente mayores en el día 30, comparado con días previos (p < 0.05).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Si bien cualquier mecanismo para aislar, enriquecer y analizar CTC en sangre es adecuado, un método para recolectar células tumorales circulantes combina tecnología de enriquecimiento inmunomagnético, tecnología de etiquetado inmunofluorescente con una plataforma analítica adecuada, después de la toma de muestra de sangre inicial. Se ha mostrado que la prueba asociada tiene la sensibilidad y especificidad para detectar estas células raras en una muestra de sangre total y para investigar su función en la evolución clínica de la enfermedad en tumores malignos de origen epitelial. A partir de una muestra de sangre total, se detectan células raras con una sensibilidad y especificidad que permite que se recolecten y usen en el modelado de la progresión de la enfermedad en un modelo animal.

Se ha mostrado que las células tumorales circulantes (CTC) existen en la sangre en cantidades detectables. Esto creó una herramienta para investigar la significación de las células de origen epitelial en la circulación periférica de pacientes con cáncer (Radia E., Euhus D., Weiss A.J., Rao C, McConnell J., Terstappen L.W.M.M. and Uhr J.W., Detection and characterization of carcinoma cells in the blood, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 95:4589-4594 (1998)). Este estudio demostró que estas células transportadas por la sangre pueden tener una función significativa en la patofisiología del cáncer. Con una sensibilidad de detección de 1 célula epitelial por 5 mi de sangre del paciente, el ensayo incorporó enriquecimiento inmunomagnético de muestras y tinción con anticuerpos monoclonales fluorescentes por citometría de flujo para un análisis rápido y sensible de una muestra.

El sistema CellSearch™ (Veridex LLC, NJ) se ha utilizado previamente para aislar y enumerar células tumorales epiteliales circulantes de muestras de sangre humana2. Este es un sistema automatizado que enriquece para células epiteliales que usan anticuerpos para molécula de adhesión celular epitelial acoplada a perlas magnéticas. Las células aisladas, después, se tiñen con el tinte de ácido nucleico fluorescente diclorhidrato de 4,2-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para identificar células nucleadas. Las células recuperadas, subsiguientemente, se tiñen con anticuerpos monoclonales etiquetados fluorescentemente para CD45 (canal APC) y citoqueratina 8, 18, 19 (canal PE), para distinguir células epiteliales de leucocitos. Las células epiteliales nucleadas, después, se cuantifican como células tumorales circulantes. Hay un canal de fluorescencia adicional para FITC que no forma parte del ensayo CellSearch™ estándar y puede usarse para caracterizar más aún las células tumorales.

Como se muestra en el Ejemplo 1 , el ensayo se configuró más aún para un análisis citométrico asistido por imagen, de manera que la muestra enriquecida inmunomagnéticamente se analiza mediante el sistema CellTracks®. Este es un sistema de análisis de imágenes de microscopio basado en fluorescencia que, en contraposición con el análisis por citometría de flujo, permite la visualización de sucesos y la evaluación de características morfológicas para identificar más aún los objetos.

Ejemplo 1 Enumeración de células circulantes positivas para citoqueratina El sistema CelITracks® se refiere a un sistema microscópico de fluorescencia automatizado _ para la enumeración automatizada de células aisladas de la sangre. El sistema contiene un microscopio de fluorescencia integrado controlado por computadora y una etapa automatizada con un ensamble de yugo magnético que sostendrá un cartucho de muestra de un sólo uso. El yugo magnético está diseñado para permitir que las células tumorales candidatas etiquetadas por ferrofluidos que se encuentran en la cámara de muestra, se localicen magnéticamente en la superficie de visualización superior del cartucho de muestra para la visualización microscópica. El software presenta al operador células sospechosas de cáncer, etiquetadas con anticuerpos para citoqueratina y de origen epitelial, para la selección final.

Si bien el aislamiento de células tumorales para el sistema CelITracks® puede lograrse por cualquier medio conocido en la materia, una modalidad usa el enriquecimiento inmunomagnético para aislar células tumorales de una muestra biológica. Se adicionan partículas magnéticas específicas de células epiteliales y se incuban durante 20 minutos. Después de la separación magnética, las células ligadas a los anticuerpos unidos inmunomagnéticamente se sostienen magnéticamente en la pared del tubo. La muestra no unida, después, se aspira y se adiciona una solución isotóníca para volver a suspender la muestra. Un tinte de ácido nucleico, anticuerpos monoclonales para citoqueratina (un marcador de células epiteliales) y CD 45 (un marcador de leucocitos de amplio espectro) se incuban con la muestra. Después de la separación magnética, la fracción no unida se aspira nuevamente y las células unidas y etiquetadas se vuelven a suspender en 0.2 mi de una solución isotónica. La muestra se suspende en una cámara de presentación de células y se ubica en un dispositivo magnético, cuyo campo orienta las células etiquetadas magnéticamente para el análisis microscópico de fluorescencia en el sistema CelITracks®. Las células se identifican automáticamente en el sistema CelITracks® y las células tumorales circulantes candidatas se presentan al operador para la enumeración de la lista de verificación. Una lista de verificación de enumeración consiste en criterios morfológicos que constituyen una célula completa.

Las células positivas para citoqueratina se aislan por enriquecimiento inmunomagnético usando una muestra de 7.5 mi de sangre total de humanos. Se adiciona fluido inmunomagnético específico de la célula epitelial y se incuba durante 20 minutos. Después de la separación magnética durante 20 minutos, las células ligadas a los anticuerpos unidos inmunomagnéticamente se sostienen magnéticamente en la pared del tubo. La muestra no unida, después, se aspira y se adiciona una solución isotónica para volver a suspender la muestra. Un tinte de ácido nucleico, anticuerpos monoclonales para citoqueratina (un marcador de células epiteliales) y CD 45 (un marcador de leucocitos de amplio espectro) se incuban con la muestra durante 15 minutos. Después de la separación magnética, la fracción no unida se aspira nuevamente y las células unidas y etiquetadas se vuelven a suspender en 0.2 mi de una solución isotónica. La muestra se suspende en una cámara de presentación de células y se ubica en un dispositivo magnético, cuyo campo orienta las células etiquetadas magnéticamente para el análisis microscópico de fluorescencia en el sistema CelITracks®. Las células se identifican automáticamente en el sistema CélITracks®; el sistema enumera las células de control, mientras las células tumorales circulantes candidatas se presentan al operador para su enumeración usando una lista de verificación, como muestra la Figura 1.

Ejemplo 2 Recuperación in vitro de células epiteliales humanas Para lograr esto, se adicionaron células de cáncer de mama 500 MDA-MB-231 a 100 µ? de muestras de sangre recolectadas de sangre de ratones que no tenían tumores. Debido a que la versión clínica del ensayo requiere que la sangre se atraiga a un tubo de vacío patentado, como el tubo CellSave, que contenga un anticoagulante y un conservante, se adicionó una cantidad proporcionalmente reducida de solución CellSave a los especímenes. Después, se prepararon los especímenes adicionados, se cuantificaron las CTC y se calculó el porcentaje de recuperación. Como un control positivo, se prepararon muestras adicionales usando células MDA-MB-231 transducidas establemente con GFP. La fluorescencia de GFP se detectó en un canal abierto (FITC) del sistema para confirmar que todas las células cuantificadas como células epiteliales concordaban con las células 231 -GFP adicionadas a la sangre de ratón. Como un control negativo, se recolectaron muestras de sangre de ratón que no tenían células de cáncer, se procesaron de manera idéntica y se analizaron. De las 500 células adicionadas a la sangre de ratón (n = 4 muestras), se recuperaron 482-526 células por espécimen, lo que se encuentra dentro del intervalo de error de dilución para experimentos de adición a esta concentración (Figura 2). Para las muestras en las que se usaron células 231 -GFP, todas las células identificadas como células epiteliales también expresaron GFP, lo que verifica que eran células de cáncer de mama humano y no células epiteliales murinas contaminantes. No se recuperaron células epiteliales de la sangre de ratón normal, lo que confirma la especificidad del ensayo.

Ejemplo 3 Recuperación de CTC de xenoinjertos en ratones El método preferido para monitorear en serie CTC en modelos de ratón de cáncer de mama humano incorpora el uso del sistema CelITracks®. Como se mencionó anteriormente, el sistema usa el aislamiento inmunomagnético de células epiteliales de la sangre y la tinción inmunofluorescente para diferenciar más aun las células epiteliales de cáncer de los leucocitos. Dado que el sistema CelITracks® se desarrolló originalmente para procesar 7.5 a 30 mi de muestras de sangre humana, es necesario que las células epiteliales de cáncer de mama humano puedan recuperarse confiablemente de volúmenes pequeños de sangre de ratón, mediante el uso de este ensayo (véase el Ejemplo 2).

El sistema se usó para identificar las CTC que se intravasan de forma espontánea en la circulación de xenoinjertos de tumores ortotópicos de células MDA-MB-231. Se recolectaron 0.7 a 1 mi de muestras de sangre de cada ratón por punción del ventrículo izquierdo, cuando los animales se eutanizaron- por carga tumoral a las 10 semanas. Los números totales de CTC" iban de aproximadamente 100 a 1000 células por mi de sangre (Figura 3). No se recuperaron CTC de muestras de sangre recolectadas de ratones que no tenían xenoinjertos tumorales (no se muestran los datos). El número de CTC no se correlacionaba con el tamaño del tumor primario. Estos datos sugieren que los números de CTC reflejan la biología subyacente de varios tumores primarios, lo que es consistente con estudios previos que muestran que las células MDA-MB-231 contienen subpoblaciones con diferente potencial metastático. Mediante el uso del mismo método, las CTC también fueron detectables en ratones con xenoinjertos tumorales de líneas celulares MCF-7, células MCF-7 transfectadas con factor de crecimiento de fibroblasto (FGF, por sus siglas en inglés) y líneas celulares SUM-159 y SKBR-3.

Si bien el sistema resultó exitoso en la detección de CTC mediante el uso de punción cardíaca para recolectar sangre, este procedimiento es invasivo comparado con otros sitios de muestreo de sangre en ratones. Un aspecto de la presente invención es sacar repetitivamente muestras de sangre para el análisis de CTC, muestras de sangre de la vena caudal lateral y del plexo venoso retro-orbital y, por lo tanto, evitar la naturaleza invasiva de la punción cardíaca. En ratones con o sin xenoinjertos de tumores ortotópicos MDA-MB-231 se compararon con el muestreo cardíaco directo. No se detectaron células epiteliales en ninguna de las muestras de la vena caudal lateral, independientemente de la presencia de un xenoinjerto tumoral. Una explicación posible para la falla en la detección de CTC en ratones que tienen tumores fue el pequeño volumen de sangre (= 25 µ?) que podía recolectarse de la vena caudal lateral. Aunque pudieron obtenerse volúmenes más grandes de sangre (50 - 75 µ?) del plexo venoso retro-orbital, 3 de 3 muestras de sangre de este sitio contenían células epiteliales (5-500 células) en ratones sin tumores. Estas células contaminantes eran células epiteliales murinas normales desplazadas por el tubo microcapilar durante la recolección de sangre. Por lo tanto, el muestreo a través de la ruta retro-orbital haría imposible la identificación confiable de CTC en ratones que tienen tumores. Por comparación, no hubo CTC en muestras de sangre obtenidas por punción cardíaca en ratones sin xenoinjertos tumorales, pero pudo detectarse CTC en la sangre obtenida a través de punción cardíaca del ventrículo izquierdo en ratones con xenoinjertos MDA-MB-231.

Ejemplo 4 Análisis temporal de CTC en ratones Después de validar el ensayo y la ruta de recolección de sangre, se investigó la viabilidad de detectar cambios temporales en CTC usando ratones implantados con xenoinjertos de tumores ortotópicos de células SUM-159 (n = 3) o SKBR-3 (n = 4). Se recolectaron 75 a 100 µ? de muestras de sangre, aproximadamente una vez por semana durante 1 mes, hasta que los ratones se eutanizaron debido a la carga tumoral. Las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y SKBR-3 se cultivaron en DMEM con 10 % de suero fetal bovino, 1 % de L-glutamina y 0.1 % de penicilina/estreptomicina. Las células SUM-159 se cultivaron en medio Ham F12 (Invitrogen) suplementado con 5 % de suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés), 5 pg/ml de insulina, 1 pg/ml de hidrocortisona y 0.1 % de penicilina/estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora de 5 % C02. Para experimentos seleccionados, las células MDA-MB-231 se transdujeron con el vector lentiviral pSico para establecer células que expresan GFP de forma estable. La eficiencia de la transducción fue 100 %, como se determinó por microscopía de fluorescencia y de contraste de fase.

En la producción de xenoinjertos tumorales, se usaron hembras de ratones desnudos Ncr (Taconic) o SCID (Jackson) de 5 a 6 semanas de edad. Xenoinjertos de tumores de mama humanos de lineas celulares, 1 x 106 células se inyectaron ortotópicamente en panículos adiposos mamarios inguinales de ratones, mediante métodos conocidos en la materia. Para xenoinjertos tumorales con aislados clínicos de células de cáncer de mama humano, los ratones se implantaron con 1-5 x 05 células en el cuarto panículo adiposo mamario inguinal. Los ratones implantados con aislados clínicos de cáncer de mama también recibieron un comprimido subcutáneo de 17-P-estradiol de liberación sostenida durante 60 días (Innovative Research of America). Se cuantificaron los volúmenes de tumores como el producto de mediciones de calibre en dos dimensiones y se calcularon por la ecuación: ancho (mm) X ancho (mm) X largo (mm) X 0.52. Para estudios en serie de CTC, se recolectaron muestras de células del ventrículo izquierdo, a intervalos aproximadamente semanales, como se muestra en la leyenda de la figura.

Los resultados del ensayo muestran niveles bajos de CTC (0 - 7 células) en muestras más tempranas (días 8-23) (Figura 4), con los números de CTC aumentando significativamente en el día 30 en 6 de 7 ratones (26 - 55 células) (p < 0.05), lo que se corresponde con un aumento en el volumen del tumor. Estos estudios establecen que el ensayo pude usarse exitosamente para los estudios en serie de CTC en modelos de ratones de cáncer de mama.

Para todas las CTC medidas en ratones implantados con xenoinjertos, se obtuvieron células de cáncer de mama primario de especímenes de bíopsia de pacientes. Se recolectaron muestras de sangre (200 pL - 800 pL) por punción cardíaca al momento en que los animales se eutanizaron debido a la carga tumoral. Las células de cáncer de mama de 6 pacientes diferentes formaron tumores en ratones, y todos estos tumores produjeron CTC. Los números de CTC iban de 4 - 805 células por mi de sangre con un valor medio de 1 18 células ± 67 (n = 6). Particularmente, ninguno de estos animales tuvieron metástasis manifiestas o detectables histológicamente (no se muestran los datos), lo que sugiere que la mayoría de las CTC producidas por especímenes clínicos primarios pueden no ser capaces de formar metástasis tanto en ratones como en humanos. Estos datos muestran que los xenoinjertos de aislados clínicos de cáncer de mama pueden producir CTC en ratones y, por lo tanto, proporcionan un sistema modelo para investigar las propiedades y las subpoblaciones de células de cáncer de mama humano involucradas en las metástasis.

Si bien ciertas modalidades preferidas de la presente invención se describieron y ejemplificaron~especificamente anteriormente, no se intenta limitar la invención a esas modalidades. Pueden realizarse muchas modificaciones a las mismas sin apartarse del espíritu de la presente invención; el alcance total de las mejoras se delinean en las siguientes reivindicaciones:

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Un método para el análisis de células metastáticas raras circulantes en un modelo de xenoinjerto tumoral preclínico de ratón; el método comprende: a) obtener 100 µ? de muestra de sangre de un modelo de xenoinjerto de ratón; la muestra comprende una población de células mezcladas sospechadas de contener las células raras mencionadas; b) enriquecer una fracción del espécimen, la fracción contiene las células raras mencionadas; c) confirmar que la integridad estructural de las células raras está intacta; d) analizar las células raras intactas; y e) repetir las etapas a a d para evaluar la progresión de la enfermedad.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el modelo de xenoinjerto de ratón es de un ratón que intravasa las CTC espontáneamente en la circulación de xenoinjertos de tumores ortotópicos de células MDA-MB-231 , SUM-159, SKBR-3 y combinaciones de éstas.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el modelo de xenoinjerto de ratón se realiza mediante la implantación de aislados clínicos de cáncer de mama en ratones.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque los ratones recibieron un comprimido subcutáneo de 17-P-estradiol de liberación sostenida.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra de sangre se obtiene por punción cardiaca.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fracción se obtiene por enriquecimiento inmunomagnético usando un campo magnético aplicado externamente para separar partículas paramagnéticas acopladas a un ligando bioespecífico que se une específicamente a las células raras, para la exclusión sustancial de otras poblaciones.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la integridad estructural se determina por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de: procedimientos inmunocitoquímicos, procedimientos FISH, procedimientos de citometría de flujo, procedimientos de citometría de imagen y combinaciones de éstos.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque un aumento en el número de las células intactas raras en el espécimen concuerda con la progresión de la enfermedad.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células raras son del grupo que consiste de: células metastáticas de cáncer de mama, células metastáticas de cáncer de próstata, células de cáncer de vejiga, células metastáticas de cáncer de colon, y combinaciones de éstas.