TWI539158B - 使用血液中之循環黑色素瘤細胞預測黑色素瘤病患之臨床結果的方法。 - Google Patents

使用血液中之循環黑色素瘤細胞預測黑色素瘤病患之臨床結果的方法。 Download PDF

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Description

使用血液中之循環黑色素瘤細胞預測黑色素瘤病患之臨床結果的方法。
本發明提供一種用於捕捉並偵測黑色素瘤病患血液中循環黑色素瘤細胞(CMC)之自動化方法。外周血腫瘤負荷中所偵測得之循環黑素色瘤細胞絕對數量，在某種程度上可作為預測存活、惡化時間及治療效果之要素。
由於晚期黑色素瘤之組織病理學混雜，且隨病程發展累積各種組成變化，因此其治療十分複雜。轉移性乳癌或大腸直腸癌病患體內循環腫瘤細胞之計數及特性描述能提供獨立預後及預測資訊，此等資訊於臨床上有其重要性，且可用於監控病患管理。
已知循環腫瘤細胞(CTC)為原發癌與轉移性疾病間之關鍵連結，其中原發癌為尚可治療之疾病階段，而轉移性疾病則為多數惡性腫瘤之主要死因。臨床研究顯示循環腫瘤細胞為轉移性乳癌之有力預後及預測生物標記，且在前列腺癌及大腸直腸癌方面也有類似發現。這些資料顯示循環腫瘤細胞為驅動轉移性癌症之生物機制的代表物，並說明對於這些細胞的進一步細胞與分子分析可為轉移之分子機理與治療反應開啟全新觀念。
將捕捉、計數及描述循環腫瘤細胞特性的方法加以修改，用來對病患血液中循環黑色素瘤細胞(CMC)進行捕捉、計數及特性描述。參閱2008年10月20日提出申請之美國專利申請第12/254188號，血液中循環黑色素瘤細胞之自動化計數與特性描述(Automated Enumeration and Characterization of Circulating Melanoma Cells in Blood)。該申請案於此合併參照。雖然此方法可用以捕捉循環黑色素瘤細胞，並對之進行計數及特性描述，但轉移性黑色素瘤病患之短期存活預測值則仍無法掌握。本發明因此提供預測轉移性黑色素瘤病患整體存活之方法。
本發明包括一種用以預測轉移性黑色素瘤病患整體存活之方法，其包含：
a)　自一轉移性黑色素瘤病患取得7.5 mL之血液樣本，該樣本包含一疑似含有循環黑色素瘤細胞之混合細胞群；
b)　純化該樣本之一部分，該部分含有該循環黑色素瘤細胞；
c)　確認該稀少細胞之結構完整性為完整；
d)　分析該完整之稀少細胞，其中該分析係與疾病惡化有關；
e)　估計該血液樣本中之循環黑色素瘤細胞數量
其中若該數量大於或等於2，預測該病患之整體存活為低，且其中若該循環黑色素瘤細胞之數量少於二，則預測該病患之整體存活為高。
在此所述之「純化」意指將循環黑色素瘤細胞自步驟(a)之血液樣本中分離出來。純化之方法包括但不限於利用結合磁性粒子的抗CD146。較佳的方法是利用對黑色素瘤細胞上結合磁珠之抗原的抗體，以從血液樣本中擷取細胞。「確認」意指決定分離而得之細胞是否為循環黑色素瘤細胞或其他細胞成分。確認方法包括但不限利用核酸染劑或一黑色素瘤細胞特異性單株抗體。較佳的確認方法為利用不同的螢光標記單株抗體將循環黑色素瘤細胞著色，且較佳的抗體為CD45和CD34以排除白血球及內皮細胞，以及高分子量黑色素瘤相關抗原HMW-MAA以標定黑色素瘤細胞。「分析」意指估計捕獲之循環黑色素瘤細胞以判定循環黑色素瘤細胞是否表達多種黑色素瘤特定標記，如HMW-MAA，以及其他標記，如Ki-67。較佳的分析方法表示判定循環黑色素瘤細胞是否表達Ki-67及/或HMW--MAA。「估計」意指判定樣本中有多少循環黑色素瘤細胞，其方法包括但不限於自動化影像分析。較佳的估計方法是利用CellTracks Analyzer II。
本發明係由以下方法與實例證明。這些實例及方法並非用以限制本發明之範圍。
實例
提供下述方法以利本發明之實施。
病患及血液採集。將健康志願者與惡性黑色素瘤病患之血液抽入清空的10-mL血液CellSave保存採血管(Veridex LLC,Raritan,NJ)並於72小時內處理。
所有病患係依據研究倫理委員會核准協議，由牛津大學腫瘤醫學系自邱吉爾醫院募集而來。所有病患均已提出書面同意文件。共募集四十四名病患，25名男性，19名女性，年齡介於31至81歲(平均59歲)。第一次抽血時，44人中有39人(86%)具有轉移性疾病，而另5名病患具有未切除第三期疾病。轉移性疾病患者中有38人(78%)具有內臟疾病，44人中有5人(11%)並無內臟感染，1名病患之轉移位置不明。追蹤期之中位數為10.1個月。抽血之時間為癌症病患靜脈注射療法之前或至少七天以後。納入五十五名健康志願者為對照組，其於抽血時無已知疾病或發燒現象，且無惡性疾病病史。
細胞培養與細胞添加。在裝有RPMI 1640與10%胎牛血清的燒瓶中培養黑色素瘤細胞株SK-Mel28，爾後不經胰蛋白酶化即行採收。僅於經錐藍質排除法評估細胞存活力超過90%時使用懸浮液。為判定實際細胞數量，將200 μL之緩衝液與總共含約20,000珠數之20 μL之螢光微珠(Beckman-Coulter,Inc.,Miami,FL)加入50 μL之SK-Mel28細胞等量樣本中。以PE共軛抗HMW-MAA將SK-Mel28細胞著色以便偵測。將兩枚僅有微珠之相同試管以流式細胞儀(FACSCalibur;BD Biosciences,San Jose,CA)處理，直到100%之樣本吸入為止。如此可精確估計20 μL中存有之微珠數量。之後將三枚相同之實驗試管以流式細胞儀測試，直到每管計得10,000顆微珠為止。SK-Mel28細胞之數量利用每單位量之已知微珠數量加以判定。
樣本製備。將7.5 mL血液置入15 mL之CellTracks AutoPrep樣本管，並混合6.5 mL之緩衝液，以800 g離心10分鐘，爾後置CellTracksTracksAutoprep(Veridex LLC)以進行自動化樣本製備14。將用以捕捉並偵測黑色素瘤細胞之試劑優化，該等試劑包括外層包覆CD146抗體之磁性流體(用以免疫磁性地純化黑色素瘤細胞與內皮細胞)15-19、強化捕獲試劑(用以最大化捕捉效率)20、藻紅蛋白共軛抗體(其結合高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)(clone 9.2.27，Veridex LLC)以鑑別黑色素瘤細胞12，21-23、兩種藻藍蛋白共軛抗體之混合物(用以鑑別白血球(CD45,clone HI30,Veridex LLC)及內皮細胞(CD34,clone 581,BD Biosciences))、FITC共軛抗體(用以鑑別Ki-67蛋白(clone B56,BD Biosciences,San Jose,CA))、核染劑4’,6-脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(用以鑑別有核細胞)，以及緩衝液(用以清洗、滲透化和再懸浮細胞)。於最後處理步驟中，將細胞再懸浮於MagNest Cell Presentation Device(Veridex LLC)中。MagNest裝置產生之磁場，使得磁性標記細胞均勻分布於匣體分析表面，便於以CellTracks Analyzer II進行分析 24 。
樣本分析。將MagNest置於CellTracks AnalyzerII上，後者為一四色半自動化螢光顯微鏡。擷取四個螢光濾鏡個別匣體之完整表面的影像。由使用者依據細胞螢光及細胞形態，將包含PE及DAPI正面事件之影像歸入事件分類圖像集。定義物體為黑色素瘤細胞的標準包括圓形至橢圓細胞形狀、可見細胞核(DAPI正面)、HMW-MAA之正面著色及CD45和CD34之負面著色。將黑色素瘤細胞分為KI67+及Ki67-細胞。細胞計數結果概以每7.5 mL血液中之細胞數量表達。
黑色素瘤細胞偵測之精確度、敏感度與線性。為進行精確度、線性與精確度實驗，將SK-Mel28細胞加入7.5 mL之血液中，以六種不同細胞數置入CellSave Preservative Tubes(0、5、20、75、300及1200)。以流式細胞技術判定加入血液之精確細胞數量。於血液添加後，將樣本於CellTracks AutoPrep處理24小時，並以CellTracks Analyzer II進行分析。以每種細胞濃度各共計五個不同樣本，於兩天中進行樣本測試。
統計分析
主要試驗指標為整體存活，測量自採樣日至任何原因死亡日之時間。對於未回診或於研究結束時仍存活之病患，於其已知最終存活日或研究結束日進行審查。若每一病患具多重樣本，則以最後樣本為存活分析之依據。利用卡本麥爾方法計算整體存活，產生存活圖。以考克斯(Cox)回歸模型決定相對死亡危險度(HR)。以SPSS 16.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)分析結果。
實例1 添加組織培養黑色素瘤細胞株(SK-Mel28)之回收率
在此實例中描述添加SK-Mel28細胞之全血檢驗結果。本研究所採用之協議如下。將健康志願者之全血抽入CellSave Tubes，並添加組織培養黑色素瘤SK-Mel28細胞。將不同數量之SK-Mel28細胞加入血液，測量回收率。添加入健康捐贈者樣本之預期SK-Me128細胞數量(亦即0、5、18、72、280及1200個細胞)與樣本中觀測到之SK-Mel28細胞實際數量對照於圖1，結果歸納於表1。加入細胞之平均回收率為88%，最低回收率為最高添加數呈現的74%，而最高者為5個SK-Mel28細胞添加之88%。皮爾森(Pearson) R2關聯為0.99。一如預期，變異係數(CV)隨添加細胞數量之減少而增加，添加1,200個細胞時為7%，而添加5個細胞時為31%。SK-Mel28細胞之回收率為64-120%，且不因細胞數量較少而降低。
循環黑色素瘤細胞之鑑別操作者檢視HMW-MAA PE與HMW-MAA PE重疊、DAPI、CD45/CD34 APC及Ki67之縮圖。細胞核之存在、HMW-MAA之表達、細胞形貌，以及缺乏CD45或CD34表達為循環黑色素瘤細胞之必要特徵。圖2顯示檢視者所見一名黑色素瘤病患之6種事件。A組之細胞沾染DAPI及HMW-MAA，也沾染CD34及/或CD45，因此非屬循環黑色素瘤細胞。B、C、D及E組顯示細胞沾染DAPI及HMW-MAA，但未沾染CD34或CD45，且歸類為循環黑色素瘤細胞。B組及C組織循環黑色素瘤細胞未表達Ki67，而D組及E組之循環黑色素瘤細胞則有。值得注意的是B組之循環黑色素瘤細胞含有兩枚細胞核且未沾染Ki67，而D組之循環黑色素瘤細胞似乎主動分化且確實表達Ki67。不同黑色素瘤病患之循環黑色素瘤細胞，其尺寸及其細胞核與細胞質比率大不相同。圖3顯示不同病患之循環黑色素瘤細胞影像，特色為圓形至橢圓形，並具完整細胞核。細胞大小差異頗大，從□4 μm至□30 μm。亦觀察到小細胞簇與多核循環黑色素瘤細胞。
實例2 循環黑色素瘤細胞於健康志願者與黑色素瘤病患體內之頻率
在此實例中，描述循環黑色素瘤細胞於健康志願者與黑色素瘤病患體內之頻率。於取自健康捐贈者的55個血液樣本及取自44名轉移性黑色素瘤病患的79個樣本中進行循環黑色素瘤細胞計數。如圖4，圖表A顯示對照組與病患之7.5 mL血液內測得的循環黑色素瘤細胞數量。從測出循環黑色素瘤細胞的17病患之19個樣本中，評估Ki67表達。Ki67+循環黑色素瘤細胞之百分比為34至100%，平均為84%(SD25)。圖4之圖表B顯示Ki67表達及這些樣本中測得之循環黑色素瘤細胞數量。55名健康捐贈者中，三個細胞歸類為循環黑色素瘤細胞，但三個皆未表達Ki67。
實例3 黑色素瘤病患體內之循環黑色素瘤細胞與整體存活。
對照組中沒有任何人測得2個或以上之循環黑色素瘤細胞，因此選擇此截止數區分病患群組。具有<2個循環黑色素瘤細胞之病患平均整體存活時間為12.1個月(95% CI 9.7至14.4)，明顯久於2循環黑色素瘤細胞病患之整體存活時間中位數2.0個月(95% CI 0至4.9)(圖5)。對數等級p為0.001。經考克斯回歸得知相對死亡危險度為3.2(95% CI 1.6-6.5)。抽血後一個月內死亡之四名病患具有較高數量之循環黑色素瘤細胞(2、8、10及8043個循環黑色素瘤細胞/7.5 ml)。
圖1.　全血中已知數量之SK-Mel 28細胞添加回收率。SK-Mel28細胞添加入健康捐贈者樣本(亦即將0、5、18、72、280及1200個細胞每兩天加入五位健康捐贈者之7.5 mL的血液中，每種細胞濃度各5個不同樣本。圖表中以加入之細胞數量對照觀察而得之細胞數量。
圖2.　A至E行代表黑色素瘤病患之樣本中經CellTracks Analyzer II軟體判定同時具有DAPI訊號及PE訊號之物體。由右至左之縮圖代表Ki67 FITC訊號、CD45及/或CD34 APC訊號、DAPI訊號、HMW-MAA PE訊號及DAPI(紫色)與HMW-MAA(綠色)訊號之重疊。A行之細胞表達CD45及/或CD34，因此並非黑色素瘤細胞，B、C行之細胞為不表達Ki67之黑色素瘤細胞，而D、E行之細胞為表達Ki67之黑色素瘤細胞。
圖3. CellTracks Analyzer II從黑色素瘤病患之7.5 mL血液中所取得的典型循環黑色素瘤細胞影像集。
圖4. 55位健康捐贈者和44位轉移性黑色素瘤病患之79個樣本之7.5 mL血液中循環黑色素瘤細胞數量(A圖)，以及16位黑色素瘤病患之19個樣本中表達循環黑色素瘤細胞的Ki67百分比(B圖)。
圖5.　每7.5 ml全血中具有<2循環黑色素瘤細胞與每7.5 ml全血中具有2循環黑色素瘤細胞之轉移性黑色素瘤病患，其整體存活可能性之卡本麥爾(Kaplan-Meier)估計。整體存活時間自每次抽血起算。循環黑色素瘤細胞<2之群組存活中位數為12.1個月，而2循環黑色素瘤細胞者為2.0個月(對數等級檢定P=0.001，每7.5 ml2細胞之病患相對死亡危險度為3.2)。

Claims (7)

  1. 一種預測轉移性黑色素瘤病患整體存活之方法，其包含以下步驟：(a)提供7.5mL來自一轉移性黑色素瘤病患之血液樣本，該樣本包含疑似含有循環黑色素瘤細胞之一混合細胞群；(b)純化出該樣本之一部分，該部分含有該循環黑色素瘤細胞，其中係利用免疫磁性純化取得該部分，該免疫磁性純化係利用外部施加磁場以分離連接於生物特異性配體上的順磁性粒子，該生物特異性配體係專一性結合於該黑色素瘤細胞而實質排除其他細胞群；(c)確認該黑色素瘤細胞之結構完整性為完整；(d)分析該完整之黑色素瘤細胞，其中該分析係與疾病惡化有關；(e)估計該血液樣本中循環黑色素瘤細胞之數量，其中若該數量大於或等於2，預測該病患之整體存活不多於兩個月，以及其中若該循環黑色素瘤細胞之數量少於2，則預測該病患之整體存活為十二個月；其中該生物特異性配體為黑色素瘤細胞黏附分子CD146。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中決定該結構完整性之程序係選自由免疫細胞化學程序、FISH程序、流式細胞技術程序、影像細胞分析程序及其組合所構成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該結構完整性係由一核酸染劑決定。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中係利用白血球及內皮特異性抗體排除同時富含之白血球及循環內皮細胞，以進一步確認該結構完整性。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該特異性抗體為CD45及CD34。
  6. 如申請專利範圍第3項之方法，進一步包含CD45及CD34以排除同時富含之白血球及循環內皮細胞。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中係添加FITC標記抗Ki67以決定活性細胞週期中該循環內之循環黑色素瘤細胞數量。
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