KR101898432B1 - 혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법 - Google Patents

혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101898432B1
KR101898432B1 KR1020137000398A KR20137000398A KR101898432B1 KR 101898432 B1 KR101898432 B1 KR 101898432B1 KR 1020137000398 A KR1020137000398 A KR 1020137000398A KR 20137000398 A KR20137000398 A KR 20137000398A KR 101898432 B1 KR101898432 B1 KR 101898432B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
circulating
melanoma cells
melanoma
delete delete
Prior art date
Application number
KR1020137000398A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130112024A (ko
Inventor
갈라 찬드라 라오
마크 씨. 코넬리
Original Assignee
베리덱스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베리덱스, 엘엘씨 filed Critical 베리덱스, 엘엘씨
Publication of KR20130112024A publication Critical patent/KR20130112024A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101898432B1 publication Critical patent/KR101898432B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70589—CD45
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

본 발명은 흑색종 환자의 혈액에서 순환 흑색종 세포 (CMC)를 포획 및 검출하는 자동화된 방법을 제공한다. 말초 혈액 종양 덩어리 내에서 검출되는 순환 흑색종 세포의 절대적 개수는, 부분적으로, 생존, 진행 시간, 및 치료법에 대한 반응성을 예측하는 인자이다.

Description

혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법 {A METHOD OF PREDICTING CLINICAL OUTCOMES FOR MELANOMA PATIENTS USING CIRCULATING MELANOMA CELLS IN BLOOD}
진행성 흑색종의 치료는 종양 진행 동안에 축적되는 외양 변화 및 종양의 이종성 조직병리학에 의해 복잡해진다. 전이성 유방암 또는 결장직장암 환자에서 순환 종양 세포를 계수하고 특징화하는 것은 임상적으로 유의한 독립적인 예후 및 예측 정보를 제공하는 것으로 나타났고, 환자 관리를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
순환 종양 세포 (CTC)는 치유 가능한 질환 단계인 원발성 암, 및 계속 진행되어 대부분의 악성종양에 있어서 사망의 주요 원인이 되는 전이성 질환 간에 중요한 연결점인 것으로 나타났다. 임상 연구는 CTC 가 전이성 유방암에서 강력한 예후 및 예측성 바이오마커임을 나타내었고, 유사한 발견이 전립선암 및 결장직장암에서 보고되었다. 이들 데이터는 CTC 가 전이성 암을 이끄는 기본 생물학의 대표임을 보여주고, 이들 세포의 추가의 세포 및 분자적 분석은 전이의 분자적 조절 및 치료법에 대한 반응성에 대한 새로운 관점을 드러낼 수 있음을 제시한다.
CTC를 포획, 계수, 및 특징화하는 방법이 환자의 혈액 내의 순환 흑색종 세포 (CMC)를 포획, 계수, 및 특징화하도록 변형되어 왔다. 2008년 10월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제12/254188호, '혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계수 및 특징화'(Automated Enumeration and Characterization of Circulating Melanoma Cells in Blood)를 참조한다. 이 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다. 이러한 방법에 의해 CMC가 포획, 계수 및 특징화되었다고 하더라도, 전이성 흑색종 환자의 단기간 생존율에 관한 예측값은 알려져 있지 않았다. 본 발명은 전이성 흑색종 환자에 대한 전체 생존기간을 예측하는 방법을 제공한다.
도 1. 전혈로부터의, 기지의 개수의 스파이킹된(spiked) SK-Mel 28세포의 회수. SK-Mel28 세포는 건강한 공여자 샘플에 스파이킹되었다 (즉, 0, 5, 18, 72, 280 및 1183개의 세포가, 각각의 세포 수준에서 총 5개의 상이한 샘플을 사용하여 2일 중 각각의 날에 5명의 건강한 공여자로부터의 7.5 mL의 혈액에 스파이킹되었다). 스파이킹된 세포의 개수를 회수된 세포의 관찰된 개수에 대해 플롯하였다.
도 2. A 행 내지 E 행은 셀트랙스 애널라이저(CellTracks Analyzer) II(등록상표) 소프트웨어에 의해 흑색종 환자로부터의 샘플에서 DAPI 및 PE 신호 둘 모두를 갖는 대상으로서 동정된 대상을 나타낸다. 오른쪽으로부터 왼쪽으로, 썸네일 이미지는 Ki67 FITC 신호, CD45 및/또는 CD34 APC 신호, DAPI 신호, HMW-MAA PE 신호 및 DAPI (자주색)과 HMW-MAA (녹색) 신호의 오버레이를 나타낸다. A 행의 세포는 CD45 및/또는 CD34를 발현하기 때문에 흑색종 세포에서 배제되고, B행 및 C행의 세포는 Ki67을 발현하지 않는 흑색종 세포로 분류되고, D 행 및 E 행의 세포는 Ki67을 발현하는 흑색종 세포로서 분류된다.
도 3. 흑색종 환자로부터의 7.5 mL의 혈액으로부터 수득한, 셀트랙스 애널라이저 II(등록상표)에 의한 전형적인 CMC 이미지의 갤러리.
도 4. 55명의 건강한 공여자의 7.5 mL의 혈액, 및 44명의 전이성 흑색종 환자로부터의 79개의 샘플에서의 CMC의 출현 개수, 패널 A 및 16명의 흑색종 환자로부터의 19개의 샘플에서 Ki67 발현 CMC의 백분율, 패널 B.
도 5. 7.5 ml의 전혈 당 2개 미만의 순환 흑색종 세포를 갖는 환자 및 7.5 ml의 전혈 당 2개 이상의 순환 흑색종 세포를 갖는 그룹의 환자에 대한, 전이성 흑색종 환자의 전체 생존 확률의 캐플란-메이어(Kaplan-Meier) 추정. OS 시간은 각각의 혈액 채취 시간으로부터 계산하였다. 중위 생존기간이, CMC가 2개 미만인 그룹에 대해서는 12.1개월인 반면 CMC가 2개 이상인 사람들에 대해서는 2.0개월이다 (로그-랭크 테스트(log-rank test)에 의하면, P=0.001; 7.5 ml 당 세포가 2개 이상인 환자에서의 사망 위험도(hazard ratio of death)는 3.2).
본 발명은 전이성 흑색종 환자에 대한 전체 생존기간을 예측하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은
a) 7.5 mL의 혈액 샘플을 전이성 흑색종 환자로부터 수득하는 단계 (여기서, 상기 샘플은 순환 흑색종 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합된 세포 집단을 포함한다)와;
b) 상기 표본의 분획을 농축화(enriching)하는 단계 (여기서, 상기 분획은 상기 순환 흑색종 세포를 함유한다)와;
c) 상기 희귀 세포의 구조적 완전성이 온전함을 확인하는 단계와;
d) 상기 온전한 희귀 세포를 분석하는 단계 (여기서, 상기 분석은 질병 진행과 상호 연관된다)와;
e) 상기 혈액 샘플 내의 순환 흑색종 세포의 개수를 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 순환 흑색종 세포의 개수가 2개 이상인 경우 환자의 전체 생존기간이 짧을 것으로 예측하고,
상기 개수가 2개 미만인 경우 환자의 전체 생존기간이 길 것으로 예측한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "농축화"라는 용어는 단계 (a)의 혈액 샘플로부터 CMC를 단리하는 것을 의미한다. 농축화 방법은 자성 입자에 커플링된 항 CD146을 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 바람직한 방법은 자성 비드에 커플링된, 흑색종 세포에 존재하는 항원에 대한 항체를 사용하여 혈액 샘플로부터 세포를 포획하는 것이다. 용어 "확인"은 단리된 세포가 CMC인지 또는 다른 세포 성분인지 결정하는 것을 의미한다. 확인 방법은 흑색종 세포에 특이적인 핵산 염료 또는 모노클로날 항체를 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 바람직한 확인 방법은 상이한 형광 표지된 모노클로날 항체들을 사용하여 CMC를 염색하는 것이며, 바람직한 항체는 백혈구 및 내피 세포를 배제하는 CD45 & CD34, 흑색종 세포를 동정하는 고분자량 흑색종 관련 항원, HMW-MAA에 대한 것이다. 용어 "분석"은 포획된 CMC를 평가하여 CMC가 HMW-MAA, MART-1 (T-세포에 의해 인지되는 흑색종 항원) 및 기타 마커(marker), 예를 들어, Ki-67과 같은 다양한 흑색종 특이적 마커를 발현하는지를 결정하는 것을 의미한다. 바람직한 분석 방법은 CMC가 Ki-67 및/또는 HMW-MAA를 발현하는지를 결정하는 것을 의미한다. 용어 "평가"는 얼마나 많은 CMC가 샘플 중에 존재하는지를 결정하는 것, 및 자동화된 이미지 분석을 포함하지만 이로 한정되지 않는 방법을 사용하는 것을 의미한다. 바람직한 평가 방법은 셀트랙스 애널라이저 II(등록상표)를 사용하는 것이다.
본 발명은 하기 방법 및 실시예에 의해 설명된다. 이러한 실시예 및 방법은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
본 발명의 실시를 용이하게 하기 위해서 하기 방법을 제공한다.
환자 및 혈액 수집. 건강한 지원자 및 악성 흑색종 환자로부터, 진공화된 10-mL 혈액 셀세이브(CellSave) 방부성 혈액 채취 튜브 (미국 뉴저지주 래리탄 소재의 베리덱스 엘엘씨(Veridex LLC)) 내로 혈액을 채취하였고 72시간 이내에 처리하였다.
환자들은 모두 연구 윤리학 위원회(research ethics committee)가 승인한 프로토콜을 사용하여 처칠 병원(Churchill Hospital)에서 옥스포드 대학의 의학 종양학부(Department of Medical Oncology of the University of Oxford)로부터 명단에 올렸다. 모든 환자가 서면 사전 동의(written informed consent)를 하였다. 44명의 환자를 명단에 올렸으며, 25명이 남성이고 19명이 여성이었고, 연령은 31세 내지 81세의 범위 (평균 59세)였다. 처음 혈액 채취 시에, 39/44 (86%)에서 전이성 질환이 있었고 5명의 환자는 비절제된 III기 질환(unresected stage III disease)이 있었다. 전이성 질환이 있는 38 /44 (78%)의 환자에서 내장 질환이 있었고, 5/44 (11%)는 내장 관련 질환이 없었고, 1명의 환자에 대해서는 전이 부위가 기록되지 않았다. 중위 추적조사 지속 시간 (median duration of follow up)은 10.1개월이었다. 혈액은 항상 암 환자로부터 정맥내 요법의 투여 전에 또는 최소 7일 후에 채취하였다. 55명의 건강한 지원자를 대조군으로서 포함하였으며, 이들은 혈액 채취 시점에 기지의 병 또는 열이 없었고 악성 질환의 병력이 없었다.
세포 배양 및 세포 스파이킹. 10% 소태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640을 담은 플라스크에서 흑색종 세포주 SK-Mel28을 배양하고 후속하여 트립신처리 없이 수확하였다. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 판단했을 때 생존활성(viability)이 90%를 초과하는 경우의 세포 현탁액만을 사용하였다. 실제 세포 개수를 결정하기 위하여, 200 ㎕의 완충액, 및 약 20,000개의 총 비드를 함유하는 20 ㎕의 형광 비드 (미국 플로리다주 마이애미 소재의 베크맨-컬터, 인크.(Beckman-Coulter, Inc.))를 SK-Mel28 세포의 50㎕ 분액에 첨가하였다. 검출을 위해 PE에 컨쥬게이트된 항 HMW-MAA를 사용하여 SK-Mel28 세포를 염색하였다. 오직 비드만 담긴 중복 튜브들을, 100%의 샘플이 흡입될 때까지, 유세포분석기 (FACS칼리버(FACSCalibur); 미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에서 진행시켰다. 이는 20 ㎕ 중에 존재하는 비드의 개수에 대한 정확한 추산을 제공하였다. 이어서, 각각의 실험관에서 10,000개의 비드가 카운팅될 때까지, 유세포분석기에서 실험관을 3회 반복하여 시험하였다. 기지의, 단위 부피당 비드 개수를 사용하여 SK-Mel28 세포의 개수를 결정하였다.
샘플 제조. 7.5 mL의 혈액을 15 mL 셀트랙스(등록상표) 오토프레프(AutoPrep)(등록상표) 샘플 튜브로 옮기고 6.5 mL의 완충액과 혼합하고, 800 g에서 10분 동안 원심분리하고, 이어서 자동화된 샘플 제조를 위해 셀트랙스오토프레프(등록상표) (베리덱스 엘엘씨) 상에 놓았다. 시약들은 흑색종 세포의 포획 및 검출을 위해 최적화되었으며, 흑색종 세포 및 내피 세포 둘 모두를 면역학적으로 농축화하기 위한, CD146 항체로 코팅된 액체자석(ferrofluid), 포획 효율을 최대화시키기 위한 포획 향상 시약, 흑색종 세포를 동정하기 위한, 고분자량 흑색종 관련 항원 (HMW-MAA)에 결합하는 피코에리트린-컨쥬게이트된 항체 (클론 9.2.27, 베리덱스 엘엘씨), 백혈구 (CD45, 클론 HI30, 베리덱스 엘엘씨) 및 내피 세포 (CD34, 클론 581, 비디 바이오사이언시즈)를 동정하기 위한, 2가지 알로피코시아닌 컨쥬게이트된 항체의 혼합물, Ki-67 단백질을 동정하는 FITC 컨쥬게이트된 항체 (클론 B56, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 비디 바이오사이언시즈), 핵화된 세포를 동정하기 위한 핵 염료 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 및 세포를 세척하고, 투과성화하고, 재현탁하기 위한 완충액으로 이루어졌다. 최종 처리 단계에서는, 마그네스트(MagNest)(등록상표) 세포 제공 장치(Cell Presentation Device; 베리덱스 엘엘씨)에서 세포를 재현탁하였다. 마그네스트 장치에 의해 생성된 자기장은 자성에 의해 표지된 세포가, 셀트랙스 애널라이저 II(등록상표)를 사용한 분석을 위해 준비되는, 카트리지의 분석 표면 전반에 균일하게 분포되게 한다.
샘플 분석. 마그네스트를 셀트랙스 애널라이저 II(등록상표), 4색 반자동 형광 현미경 상에 놓는다. 4개의 형광 필터 큐브 각각에 대해 카트리지의 전체 표면을 덮는 이미지 프레임을 캡쳐한다. PE뿐만 아니라 DAPI 포지티브 이벤트(positive event)를 함유하는 이미지를, 세포 형광 및 형태에 기초한 사용자에 의한 이벤트의 분류를 위해 갤러리에 제공한다. 물체가 흑색종 세포로 정의되는 기준에는 원형 내지 타원형의 형태, 가시적 핵 (DAPI 포지티브), HMW-MAA에 대한 포지티브 염색, 및 CD45 및 CD34에 대한 네거티브 염색이 포함된다. 흑색종 세포는 KI67+ 및 Ki67- 세포로 분리되었다. 세포 계수의 결과는 항상 7.5 mL의 혈액 당 세포의 개수로 표현한다.
흑색종 세포 검출의 정확도, 민감도, 및 선형도. 정확도, 선형도, 및 민감도 실험을 위해, 셀세이브 방부성 튜브 내에 수집된 7.5 mL의 혈액 내에, 6가지 상이한 세포 수준 (0, 5, 18, 72, 280 및 1183개)에서 SK-Mel28 세포를 스파이킹하였다. 혈액에 스파이킹된 세포의 정확한 개수를 유세포분석에 의해 결정하였다. 셀트랙스 오토프레프(등록상표) 상에 혈액을 스파이킹한 지 24시간 후에 샘플을 처리하고 셀트랙스 애널라이저 II(등록상표)로 분석하였다. 각각의 세포 수준에서 총 5개의 상이한 샘플을 사용하여 2일의 서로 다른 날에 걸쳐 샘플 시험을 수행하였다.
통계 분석
1차 평가항목(primary endpoint)은 샘플 일자로부터 임의의 원인에 의한 사망 일자까지의 시간으로서 측정되는, 전체 생존기간이었다. 추적 조사를 놓쳤거나 또는 연구 마지막에 여전히 살아있는 환자는 살아있는 것으로 알려진 마지막 날짜 또는 마지막 연구 일자에 검열하였다. 환자 당 다수의 샘플이 있는 경우, 마지막 샘플을 생존기간 분석을 위해 사용하였다. 캐플란-메이어법을 사용하여 전체 생존기간을 계산하고 생존기간을 플롯하였다. 콕스 회귀 모델(Cox regression model)을 사용하여 사망 위험도 (HR)를 결정하였다. SPSS 16.0 (미국 일리노이주 시카고 소재의 에스피에스에스 인크(SPSS Inc.))에서 결과를 분석하였다.
실시예 1
스파이킹된 조직 배양 흑색종 세포주 (SK-Mel28)의 회수율
본 실시예에서는, SK-Mel28 세포로 스파이킹된 전혈을 사용한 검정 수행을 설명한다. 본 연구를 위해 사용되는 프로토콜은 다음과 같았다. 건강한 지원자로부터 전혈을 셀세이브 튜브에 채취하고 조직 배양 흑색종 SK-Mel28 세포로 스파이킹하였다. 다양한 개수의 SK-Mel28 세포를 혈액에 스파이킹하였고, 회수율을 측정하였다. 건강한 공여자의 샘플에 스파이킹된 SK-Mel28 세포의 예상 개수 (즉, 0, 5, 18, 72, 280 및 1183개의 세포)를 샘플에서 관찰되는 SK-Mel28 세포의 실제 개수에 대해 플롯한 것이 도 1에 나타나 있으며, 결과가 표 1에 요약되어 있다. 스파이킹된 세포의 평균 회수율은 88%였는데, 최고 스파이크에서는 회수율이 74%인 반면 5개의 SK-Mel28 스파이크에서는 88%였다. 피어슨(Pearson) R2 상관계수는 0.99였다. 예상된 대로, 스파이킹된 세포의 개수가 감소함에 따라 변동 계수(coefficient of variation; CV)가 증가하였으며, 1,183개-세포 스파이크에서의 7%로부터 5개-세포 스파이크에서의 31%까지의 범위였다. SK-Mel28 세포의 회수율은 64 내지 120%의 범위였고 세포 개수가 더 적어져도 감소하지 않았다.
Figure 112013001472079-pct00001
순환 흑색종 세포의 동정. HMW-MAA PE의 오버레이 및 HMW-MAA PE, DAPI, CD45/CD34 APC 및 Ki67의 썸네일 이미지를, 검토를 위해 오퍼레이터에 제공한다. 핵의 존재, HMW-MAA의 발현, 세포 형태, 및 CD45 또는 CD34 발현의 결여가 CMC의 필수 특징들이다. 도 2는 검토자에게 제공된, 1명의 흑색종 환자로부터의 6개의 이벤트를 나타낸다. 패널 A는 DAPI 및 HMW-MAA뿐만 아니라 CD34 및/또는 CD45에 의해서 세포가 염색됨을 나타내며 따라서 CMC로서 분류되지 않는다. 패널 B, 패널 C, 패널 D 및 E는 DAPI 및 HMW-MAA에 의해서는 세포가 염색되나 CD34 또는 CD45에 의해서는 염색되지 않음을 나타내며 CMC로서 분류된다. 패널 B 및 패널 C에서 CMC는 Ki67을 발현하지 않는 반면, 패널 D 및 패널 E에서 CMC는 Ki67을 발현한다. 패널 B에서 CMC는 2개의 핵을 함유하며 Ki67에 의해서 염색되지 않는 반면, 패널 D에서 CMC는 확실히 활발하게 분리되는 것으로 보이며 Ki67을 확실히 발현한다는 것에 주목한다. CMC의 크기 및 그의 핵 대 세포질 비는 흑색종 환자들 내의 그리고 그들 사이의 CMC 사이에서 크게 다르다. 도 3은 특징적으로 원형 내지 타원형 형상 및 온전한 핵을 갖는, 상이한 환자들로부터의 CMC 이미지의 갤러리를 나타낸다. 세포 크기는 4 ㎛ 내지 30 ㎛의 넓은 범위에 걸쳐 다양하였다. 작은 세포 클러스터 및 다핵 CMC가 또한 관찰되었다.
실시예 2
건강한 지원자 및 흑색종 환자에서의 순환 흑색종 세포의 빈도
이 실시예에서는, 건강한 지원자 및 흑색종 환자에서의 순환 흑색종 세포의 빈도를 설명한다. 건강한 지원자로부터의 55개의 혈액 샘플 및 44명의 전이성 흑색종 환자로부터의 79개의 샘플에서 CMC를 계수하였다. 도 4, 패널 A는 대조군 그룹 및 환자의 7.5 mL의 혈액에서 검출된 CMC의 개수를 나타낸다. CMC가 검출된 17명의 환자로부터의 19개의 샘플에서 Ki67 발현의 평가를 결정하였다. Ki67+ CMC의 백분율은 34 내지 100%의 범위였으며 평균이 84% (SD25)였다. 도 4의 패널 B는 Ki67 발현 및 이들 샘플에서 검출된 CMC의 개수를 나타낸다. 55명의 건강한 지원자에서, 3개의 세포가 CMC로 분류되었으며 3개 모두 Ki67을 발현하지 않았다.
실시예 3
흑색종 환자에서의 순환 흑색종 세포 및 전체 생존기간
대조군 그룹의 개체들 중에는 2개 이상의 CMC가 검출된 개체가 없었으며, 환자 그룹들을 구별하기 위해 이러한 컷-오프(cut-off)를 선택하였다. 2개 미만의 CMC를 갖는 이들 환자에 대한 평균 OS 시간은 12.1 개월 (95% CI 9.7. 내지 14.4)이었으며, 이는 2개 이상의 CMC를 갖는 환자에 대한 중위 OS 시간, 2.0 개월 (95% CI 0 내지 4.9)보다 유의하게 더 길었다 (도 5). 로그랭크 p는 0.001이었다. 사망 위험도는, 콕스 회귀에 의하면, 3.2 (95% CI 1.6-6.5)였다. 혈액 채취 후 1개월 이내에 사망한 4명의 환자는 CMC의 개수가 상대적으로 많았다 (2, 8, 10 및 8043개의 CMC / 7.5 ml).

Claims (11)

  1. 순환 흑색종 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혼합된 세포 집단을 포함하는, 전이성 흑색종 환자로부터 수득된 혈액 샘플 7.5 ㎖ 중에서 전이성 흑색종 환자에 대한 전체 생존기간을 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) CD146 항체에 결합된 상자성 입자를 다른 집단을 실질적으로 배제하고 분리하기 위해 외부에서 인가되는 자기장을 이용하는 면역자기 농축화에 의해 상기 순환 흑색종 세포를 함유하는 상기 혈액 샘플의 분획을 농축화(enriching)하는 단계;
    (b) 상기 순환 흑색종 세포의 구조적 완전성이 온전함을 확인하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 구조적 완전성이 핵산 염료 및 고분자량 흑색종 관련 항원(High Molecular Weight Melanoma Associated Antigen)에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 측정되고, CD45 및 CD34 항체를 추가로 함유하여 공동-농축화된 백혈구 및 순환 내피 세포를 배제함에 의해 측정되고;
    (c) 상기 순환 흑색종 세포를 질병 진행과 상호 연관시키는 분석을 실시하는 단계;
    (d) 상기 혈액 샘플 내의 순환 흑색종 세포의 개수를 평가하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 순환 흑색종 세포의 개수가 2개 이상인 경우 환자의 전체 생존기간이 2개월 이하인 것으로 예측하고,
    상기 순환 흑색종 세포의 개수가 2개 미만인 경우 환자의 전체 생존기간이 12개월인 것으로 예측하는 것인, 전이성 흑색종 환자에 대한 전체 생존기간을 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구조적 완전성은 면역세포화학 방법, FISH 방법, 유세포분석 방법, 이미지 세포분석 방법, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, FITC 표지 항-Ki67을 첨가하여 순환 내 활성 세포 주기에서의 순환 흑색종 세포의 비율을 측정하는, 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
KR1020137000398A 2010-06-08 2011-06-08 혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법 KR101898432B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35244110P 2010-06-08 2010-06-08
US61/352,441 2010-06-08
PCT/US2011/039596 WO2011156468A1 (en) 2010-06-08 2011-06-08 A method of predicting clinical outcomes for melanoma patients using circulating melanoma cells in blood

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130112024A KR20130112024A (ko) 2013-10-11
KR101898432B1 true KR101898432B1 (ko) 2018-09-14

Family

ID=44543745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137000398A KR101898432B1 (ko) 2010-06-08 2011-06-08 혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20110300551A1 (ko)
EP (1) EP2580594B1 (ko)
JP (1) JP5889883B2 (ko)
KR (1) KR101898432B1 (ko)
CN (1) CN103026235B (ko)
AU (1) AU2011264906B2 (ko)
BR (1) BR112012031389A2 (ko)
CA (1) CA2800938A1 (ko)
DK (1) DK2580594T3 (ko)
ES (1) ES2672127T3 (ko)
IL (1) IL223179B (ko)
PT (1) PT2580594T (ko)
TW (1) TWI539158B (ko)
WO (1) WO2011156468A1 (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010068812A1 (en) 2008-12-10 2010-06-17 Abqmr, Inc. Nuclear magnetic resonance apparatus, methods and associated technology
AU2010310688A1 (en) 2009-10-21 2012-05-17 Epic Sciences, Inc. Method of using non-rare cells to detect rare cells
US9428547B2 (en) 2010-04-21 2016-08-30 Dna Electronics, Inc. Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US9541480B2 (en) 2011-06-29 2017-01-10 Academia Sinica Capture, purification, and release of biological substances using a surface coating
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
EP3100047B1 (en) 2014-01-27 2021-08-11 Epic Sciences, Inc. Circulating tumor cell diagnostics for prostate cancer biomarkers
WO2015127008A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Epic Sciences, Inc. Methods for analyzing rare circulating cells
EP3126814B1 (en) 2014-04-01 2019-06-12 Academia Sinica Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis
EP3140656B1 (en) * 2014-05-09 2021-02-17 The Scripps Research Institute Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma
US10112198B2 (en) 2014-08-26 2018-10-30 Academia Sinica Collector architecture layout design
US10107726B2 (en) 2016-03-16 2018-10-23 Cellmax, Ltd. Collection of suspended cells using a transferable membrane
US11515039B2 (en) 2017-04-28 2022-11-29 University Of Southern California System and method for predicting survival time
KR102327062B1 (ko) 2018-03-20 2021-11-17 딜로이트컨설팅유한회사 임상시험 결과 예측 장치 및 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525642A (ja) * 2003-02-27 2007-09-06 イムニベスト・コーポレイション 循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）：転移癌患者における増悪までの時間、生存および療法に対する応答の早期評価
US20090136946A1 (en) 2007-11-27 2009-05-28 Mark Carle Connelly Automated Enumeration and Characterization of Circulating Melanoma Cells in Blood

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000047998A1 (en) * 1999-02-10 2000-08-17 Cell Works Inc. Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use
NZ588574A (en) * 2006-11-03 2012-07-27 Baylor Res Inst Diagnosis of metastatic melanoma and monitoring indicators of immunosuppression through blood leukocyte microarray analysis
US20120178645A1 (en) * 2009-06-26 2012-07-12 Johannes Albert Foekens Identifying circulating tumor cells (ctcs) using cd146 in breast cancer patients
CN104781007B (zh) * 2012-11-09 2017-11-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 循环肿瘤细胞的体外捕获和分析

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525642A (ja) * 2003-02-27 2007-09-06 イムニベスト・コーポレイション 循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）：転移癌患者における増悪までの時間、生存および療法に対する応答の早期評価
US20090136946A1 (en) 2007-11-27 2009-05-28 Mark Carle Connelly Automated Enumeration and Characterization of Circulating Melanoma Cells in Blood
WO2009070392A1 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Veridex, Llc Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Medic S et al, Pigment Cell Research (2007), vol. 20, no.2, pp. 80-91.
Rao Chandra et al, Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research (2008), vol. 49, pp. 874.
Steen S et al, PROC(BAYL UNIV MED CENT) (2008), vol. 21, no. 2, pp. 127-132.
Ulmer A et al, Clinical Cancer Research (2004), vol. 10, no.2, pp. 531-537.

Also Published As

Publication number Publication date
TWI539158B (zh) 2016-06-21
PT2580594T (pt) 2018-07-10
WO2011156468A1 (en) 2011-12-15
JP2013529774A (ja) 2013-07-22
CN103026235B (zh) 2016-09-07
WO2011156468A8 (en) 2012-12-20
EP2580594B1 (en) 2018-04-18
TW201205079A (en) 2012-02-01
CN103026235A (zh) 2013-04-03
IL223179B (en) 2018-04-30
EP2580594A1 (en) 2013-04-17
JP5889883B2 (ja) 2016-03-22
ES2672127T3 (es) 2018-06-12
KR20130112024A (ko) 2013-10-11
DK2580594T3 (en) 2018-06-14
AU2011264906A1 (en) 2013-01-24
AU2011264906B2 (en) 2015-11-26
IL223179A0 (en) 2013-02-03
BR112012031389A2 (pt) 2016-10-25
CA2800938A1 (en) 2011-12-15
US20110300551A1 (en) 2011-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101898432B1 (ko) 혈액 내 순환 흑색종 세포를 사용하여 흑색종 환자에 대한 임상 결과를 예측하는 방법
Rao et al. Circulating melanoma cells and survival in metastatic melanoma
KR101604649B1 (ko) 혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화
JP6352588B2 (ja) 希少ではない細胞を用いて希少細胞を検出する方法
Cho et al. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages
US7901950B2 (en) Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
KR101716555B1 (ko) 포유동물 대상체에서 5t4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 5t4-양성 암을 진단하는 방법
Samsel et al. Imaging flow cytometry for the study of erythroid cell biology and pathology
US20080113350A1 (en) Blood test to monitor the genetic changes of progressive cancer using immunomagnetic enrichment and fluorescence in situ hybridization (FISH)
KR20100012847A (ko) 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법
Widemann et al. CD146‐based immunomagnetic enrichment followed by multiparameter flow cytometry: a new approach to counting circulating endothelial cells
US20110159561A1 (en) Kit and method for the capture of tumor cells
US20150233932A1 (en) Methods, Systems, and Compositions for Enrichment of Rare Cells
WO2006020936A2 (en) A method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
US20160153047A1 (en) Cell culture isolation and expansion of circulating tumor cells (ctc) from cancer patients or animals to derive prognostic and predictive information and to provide a substrate for subsequent genetic, metabolic, immunologic, and other cellular characterizations.
JP2012506048A (ja) マウスにおける循環乳癌細胞の連続的変化を監視するための前臨床方法
RU2770284C1 (ru) Способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы
KR20140019823A (ko) 종양 세포를 검출하는 스테로이드 수용체 분석법
Bijnen et al. Characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry
ES2356738T3 (es) Células tumorales circulantes (ctc): evaluación temprana del tiempo de evolución, de la supervivencia y la respuesta a la terapia en pacientes con cáncer metastásico.
WO2024039744A1 (en) Methods of forming patient-derived 3d cell cultures for tracking live immune-tumor interactions
CN111458515A (zh) 一种外周血中的肺小细胞肿瘤细胞数量的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right