KR101716555B1 - 포유동물 대상체에서 5t4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 5t4-양성 암을 진단하는 방법 - Google Patents

포유동물 대상체에서 5t4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 5t4-양성 암을 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암을 진단하는 방법이 제공된다. 검출 또는 진단 방법은 5T4-양성 전이성 암 또는 초기 단계 5T4-양성 암의 존재를 나타낸다.

Description

포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 5T4-양성 암을 진단하는 방법 {METHODS FOR DETECTING 5T4-POSITIVE CIRCULATING TUMOR CELLS AND METHODS OF DIAGNOSIS OF 5T4-POSITIVE CANCER IN A MAMMALIAN SUBJECT}
본 발명은 일반적으로 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
인간 5T4 항원은 다수의 암 유형에서 발현되고 정상 조직에는 실질적으로 없다. 최근에, 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 고-친화성 모노클로날 항체가 개발되었으며 세포독성제를 그 5T4 항체에 접합시켜 5T4-양성 암의 치료에 사용하기 위한 항체-약물 접합체를 형성하였다 (미국 특허 번호 8,044,178 및 8,309,094). 그 결과 5T4 발현의 평가는 5T4-양성 암 보유 환자의 확인을 위한 유용한 접근법일 수 있다는 것이다. 하나의 접근법은 암 환자에서 순환 종양 세포 (CTC) 상 5T4 항원의 검출이 될 것이다.
순환 종양 세포는 상피-유래 암 보유 환자의 말초 혈액에서 매우 낮은 농도로 관찰되었다 (문헌 [Kraeft et al., Clin Cancer Res 10: 3020-3028, 2004]). 이들 세포의 수는 샘플링시에 진행성 질환을 보유한 전이성 유방암 환자의 코호트에 대한 결과와 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Cristofanilli et al., N Engl J Med 351: 781-791, 2004]). 이러한 이유로, 어떻게 이들 세포가 혈류를 통해 해부학적으로 떨어진 부위로 이동하여 전이성 질환을 형성할 수 있는지를 이해하기 위해서는 그의 특징규명이 상당한 생물의학적 관심사이다. 그 결과로서, 5T4-양성 암과 관련된 CTC를 확인하는 것이 환자 확인을 위한 귀중한 진단 도구를 제공할 수 있다.
현재, CTC는 주로 EpCam과 같은 면역세포화학적 마커 및 DNA 내 A-T 풍부 영역에 강력하게 결합하는 형광 염색제 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로의 핵 염색의 이용을 통해 검출 및 분석된다. 비록 이들 접근법은 CTC의 계수 및 구별에 성공적이지만, 그들이 진단병리학이 의존하는 표준 형태학적 염색과의 상관관계를 생략함에 따라 그들은 표준 세포병리학적 접근법과는 다르다. 이러한 점은 CTC를 일상적인 진단 절차에 의해 수득된 다른 부위로부터의 종양 세포와 비교하는 데에 어려움을 가져온다. 비록 CTC 검출능이 암의 진단과 개별화된 치료 및 치료 효능에 도움을 줄 가능성은 있지만, CTC의 생물학에 관한 이해는 표준 세포병리학적 방법을 포함시킴으로써 향상될 수 있다. CTC의 상세한 고-해상도 영상화를 통상적인 진단병리학 염색법 및 명시야 현미경검사와 함께 활용하여 진료소에서 순환 5T4-양성 암종 세포의 표준 세포병리학적 진단을 하고 5T4-양성 CTC를 이용하는 진단의 채택을 앞당기는 가능성을 부여하기 위한 필요성이 당업계에 존재한다.
발명의 개요
한 실시양태에서, 본 발명은 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계; 기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는(mounting) 단계; 혈액의 샘플 중 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 결합하는 제2 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 종양 세포인 것으로 결정되지 않는 세포 집단 또는 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 방법은 포유동물 대상체에서의 초기 단계 5T4-양성 암, 무질환 상태 또는 비-측정가능 질환 상태의 존재를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 혈액 샘플 중 순환 종양 세포의 존재 또는 부재는 5T4-양성 암 요법 또는 암 회복 동안의 요법 관리를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 혼합 세포 집단이고, 기판은 평면 기판, 마이크로유체 소자, 또는 세포의 농축 집단을 보유하는 카트리지이다.
또 다른 실시양태에서, 기판 상 시험 샘플의 탑재는 생물학적 단층을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 핵의 세부, 핵의 윤곽, 핵소체의 존재 또는 부재, 세포질의 질 또는 세포질의 양에 의해 분석되고, 여기서 상기 분석은 DAPI를 사용한다.
또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 높은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 낮은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 초기 아폽토시스 세포 또는 후기 아폽토시스 세포를 측정하고, 순환 종양 세포를 확인함으로써 분석된다.
또 다른 실시양태에서, 제1 마커, 제2 마커, 제3 마커 및 제4 마커는 형광 마커이다.
또 다른 실시양태에서, 제1 마커는 형태, 크기, 또는 핵 대 세포질 비율에 의해 순환 종양 세포를 확인하기 위한 세포학적 염색제이다.
또 다른 실시양태에서, 세포학적 염색제는 DAPI이다.
또 다른 실시양태에서, 세포학적 염색제는 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색제이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 마커 또는 제3 마커는 세포-특이적 마커이다.
또 다른 실시양태에서, 세포-특이적 마커는 시토케라틴, CD45, M30, 케모카인 수용체, CXCR1, CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR 또는 HuR이다.
또 다른 실시양태에서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 존재 또는 제4 마커의 존재 검출은 기판에의 세포 부착에 의해 세포 집단을 분석하는 단계, 기판 상 세포 집단을 스캐닝하는 단계 및 재배치를 사용한 디지탈 현미경검사에 의해 세포를 영상화하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 혈액 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 검출은 5T4-양성 암의 존재를 나타내고, 여기서 상기 암은 방광, 유방, 자궁경부, 결장직장, 자궁내막, 신장, 간, 폐, 식도, 난소, 전립선, 췌장, 피부, 위 및 고환의 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 암은 결장직장, 유방, 췌장 및 비-소세포 폐 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계; 기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계; 혈액의 샘플 중 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 결합하는 제2 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 종양 세포인 것으로 결정되지 않는 세포 집단 또는 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석 및 정량하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원의 상기 정량을 사용하여 H-점수를 생성하며, 여기서 상기 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되고, 상기 순환 종양 세포는 최적화 5T4 4색 검정을 이용하여 특징규명되는 것인 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항체-약물 접합체를 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에게 투여하는 단계; 약물 후보로의 처리 전후에 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 5T4-양성 순환 종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포 집단을 포함하는 것인 단계; 기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계; 혈액의 샘플 중 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 결합하는 제2 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 종양 세포인 것으로 결정되지 않는 세포 집단 또는 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하여, 항체-약물 접합체로의 처리 후와 비교하여 항체-약물 접합체로의 처리 전 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포를 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 처리 전 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포의 비율과 비교하여 처리 후 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포의 비율 변화는 5T4-양성 순환 종양 세포의 감소에 있어서 항체-약물 접합체의 효능을 나타낼 수 있고, 상기 항체-약물 접합체 화합물은 항-5T4-A1-mcMMAF인, 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암의 치료를 위한 항체-약물 접합체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계; 기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계; 혈액의 샘플 중 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제1 마커는 DAPI인 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 결합하는 제2 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제2 마커는 시토케라틴인 단계; 혈액의 샘플 중 종양 세포인 것으로 결정되지 않는 세포 집단 또는 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제3 마커는 CD45인 단계; 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 상기 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
도 1a는 H-점수의 계산에 이용된 5T4 발현 범위를 비교한다.
도 1b는 비-소세포 폐암 (NSCLC)에서 5T4의 저-, 중- 및 고-발현에 대하여 확립된 역치를 묘사하는 보정(calibrating) 세포주를 제공한다.
도 2a는 최적화 5T4 4색 진단 검정으로 분석된 NSCLC 환자 샘플로부터의 단일 CTC 및 CTC 클러스터 양쪽 모두에 대한 5T4 발현 산발 플롯(scatter plot)을 도시한다.
도 2b는 최적화 5T4 4색 진단 검정으로 분석된 17개 NSCLC 환자 샘플로부터의 데이터 및 보정 세포주를 사용하여 계산된 H-점수를 도시한다.
별도로 규정하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 기재하고 권리주장함에 있어서, 하기 전문용어가 사용될 것이다.
5T4는 42 kDa 비-글리코실화 코어를 포함하는 72 kDa 고-글리코실화 막횡단 당단백질인 5T4 종양태아 항원을 언급한다 (미국 특허 번호 5,869,053 참조). 인간 5T4는 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 신장, 폐, 식도, 난소, 전립선, 췌장, 피부, 위 및 고환의 암종을 포함한 (이들에 한정되지 않음) 다수의 암 유형에서 발현된다. 고-종양발생 세포 - "암 줄기 세포" 또는 "종양-개시 세포"로도 불림 - 는 고-수준의 5T4 발현을 보유하는 것으로 나타났다 (WO2010/111659). 항-5T4 항체는 인간 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 8,044,178 참조).
"생물학적 단층"은 세포 분리 또는 정제의 다양한 상태로 존재할 수 있는 혈액 샘플을 언급한다. 예를 들어, 생물학적 단층은 부분적으로 정제될 수 있으며 적혈구의 용해가 일어난 후 단핵 세포 및 그 밖의 세포를 함유할 수 있다.
"기판 상에 샘플을 탑재하기에 앞서 세포 집단을 분류하는"은 샘플, 예를 들어 혈액 샘플로부터 세포 집단의 하위세트를 제거하는 것을 언급한다. 분류는 선택적인 세포 용해 및 세포 하위분획의 원심분리에 의해 일어날 수 있다. 분류는 또한 형광 세포 마커 및 형광-활성화 세포 분류를 이용하여 일어날 수 있다. 세포 마커에 대한 세포 분류는 순환 종양 세포에 대한 양성 선택으로서 또는 비-종양 세포를 제거하기 위한 음성 선택으로서 일어날 수 있다.
"기판"은 시험 샘플, 예를 들어 검출 및 분석을 위해 탑재된 세포를 함유하는 혈액 샘플을 보유한다. 한 측면에서, 기판은 평면일 수 있다. 추가 측면에서, 기판은 다소 굴곡질 수 있다.
"대상체", "포유동물 대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 임의의 포유동물의 환자 또는 대상체를 언급한다. "포유동물" 또는 "포유동물의"는 인간 환자와 비-인간 영장류, 및 실험 동물, 예컨대 토끼, 래트와 마우스, 및 기타 동물을 언급한다. 본 발명의 방법에 따른 치료를 위한 대상체 환자를 확인하기 위한 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 허용되는 스크리닝 방법을 이용하여 표적화된 또는 의심되는 질환 또는 병태, 예를 들어 5T4-양성 암과 관련된 위험 인자를 측정하거나, 또는 대상체에서 기존 질환 또는 병태의 상태를 측정한다. 이들 스크리닝 방법은 예를 들어 표적화된 또는 의심되는 질환 또는 병태와 관련될 수 있는 위험 인자를 측정하기 위한 통상적인 정밀 검사를 포함한다. 이들 및 다른 일상적인 방법은 임상의로 하여금 본 발명의 방법 및 제제를 사용하는 요법을 필요로 하는 환자를 선택하게 해준다.
"혈액 샘플", "혈액 시편", "시험 샘플" 및 "혈액의 샘플"은 상호교환가능하게 사용되며, 진단 검정을 비롯한 의학적 검사에 사용하기 위한, 일반적으로 가요성 플라스틱 카테터를 담지하는 예리한 경질 탐침 또는 캐뉼라에 의한 또는 주사기나 카테터에 부착된 강침에 의한 정맥의 정맥천자 또는 경피적 천자에 의해 대상체로부터 채혈 또는 채취된 소정량의 혈액으로서 정의된다.
"암", "악성종양", "고형 종양" 또는 "과증식성 장애"는 동의어로 사용되며, 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 확산하려는 병적 5T4-양성 세포의 능력 (즉, 전이)인 5T4-양성 세포의 제어되지 않은 비정상적 증식을 특징으로 하는 다수의 질환 중 어느 것 및 다수의 특색을 이루는 구조적 및/또는 분자적 특성의 어느 것을 언급한다.
"제1 마커", "제2 마커", "제3 마커" 및 "제4 마커"는 세포학적 염색제에 의해 또는 세포-특이적 마커에 의해 순환 종양 세포를 확인한다. 제1 마커는 DAPI, 라이트-김사 염색제, 또는 당업계에 알려져 있는 다른 세포학적 염색제를 포함한 (이들에 한정되지 않음) 세포학적 염색제이다. 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [B.F. Atkinson, Atlas of Diagnostic Cytopathology. 2nd Edition, W.B. Saunders Company, Ed., 2003]을 참조한다. 제2 및 제3 마커는 시토케라틴, CD45, M30, 케모카인 수용체, CXCR1, CXCR4, CD44, CD24, 혈관내피 성장인자 이소형 (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3), 상피 성장인자 수용체 (EGFR), 또는 mRNA 안정성 인자 HuR에 대한 마커를 포함한 (이들에 한정되지 않음) 세포-특이적 마커이다. 제4 마커는 5T4 항원을 언급한다.
이들 마커는 조혈 기원의 세포를 비롯한 다양한 세포 유형, 상피 세포 상 시토케라틴, 유방암 세포, 전립선암 세포, CD44, 히알루론산을 인식하는 세포 표면 수용체, 케모카인 수용체, 예컨대 CXCR1 또는 CXCR4를 확인한다.
본원에서 사용되는 세포에 관련해서 "분류"는 예를 들어 형광-활성화 세포 분별기를 사용하여 달성될 수 있는 바와 같은 세포의 물리적 분류, 및 세포 표면 마커의 발현에 기반한 세포의 분석, 예를 들어 분류 부재하에서의 FACS 분석 양쪽 모두를 언급한다.
"핵의 세부, 핵의 윤곽, 핵소체의 존재 또는 부재, 세포질의 질 또는 세포질의 양에 의한 세포 집단 분석" 및 "높은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 낮은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 초기 아폽토시스 세포 또는 후기 아폽토시스 세포를 측정하고 순환 종양 세포를 확인함에 의한 세포 집단 분석"은 [B. F. Atkinson, id]에 기재된 바와 같은 기술 및 분석 방법을 이용하여 일어날 수 있다.
"암 요법 또는 암 회복의 관리"는 암 진행의 병기 또는 특정 암 요법 치료의 유효성을 측정하기 위한 생체내 또는 시험관내 진단 시험을 언급한다.
"순환 종양 세포 (CTC)"는 팬(pan) 시토케라틴에 대하여 양성이고 CD45에 대하여 음성인 무손상 종양 세포 또는 종양 세포의 클러스터를 언급한다. CTC는 또한 5T4에 대하여 양성이고 CD45에 대하여 음성인 세포; 팬 시토케라틴 및 5T4 양쪽 모두에 대하여 양성이고 CD45에 대하여 음성인 세포; 및 악성 세포와 형태학적으로 일치하는 세포를 포함한다. CTC를 카테고리화하고 검출하는 방법은 이전에 보고된 바 있다 (WO2011/028905, WO2011/050103 및 US2009/0317836, 본원에 참조로 포함).
"H-점수"는 각 카테고리 내 CTC의 백분율 (저, 중, 고)에 그들의 각 카테고리 값을 곱하여 합산한 가중 점수(weighted score)이며, 0 내지 300 사이의 점수가 생성된다.
당업계에 알려져 있는 순환 종양 세포를 검출하는 몇몇 방법이 존재한다. 혈액 샘플 중 악성 상피 세포의 낮은 수준의 농도인, 106 내지 107개 총 유핵 세포중 대략 1개는 그들을 검출해내기 어렵게 한다. CTC의 검출 및 계수는 PCR, 유동 세포측정법, 영상-기반 면역학적 접근법, 면역자기 기술, 마이크로유체 기술 및 마이크로칩 기술을 비롯한 몇몇 방법으로 시도하여 왔다.
예를 들어, 애드나테스트 브레스트 캔서(AdnaTest Breast Cancer)® 시스템은 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하여 순환 종양 세포를 검출한다 (애드나겐 아게(AdnaGen AG), 독일 랑겐하겐; 온코비스타 인코포레이티드(OncoVista, Inc.), 미국 텍사스주 샌 안토니오). 시험은 상피 표면 항원에 대한 3종 항체 중 하나로 코팅된 면역자기 비드의 특허(proprietary) 혼합물을 이용하는 CTC-농축 절차가 특징을 이룬다. 이어서 CTC의 수는 반-정량적 RT-PCR 방법에 의해 간접적으로 측정된다.
셀서치 시스템(CellSearch System)TM (베리덱스 엘엘시(Veridex LLC), 미국 뉴저지주 워렌)은 전혈(whole blood)중 CTC의 검출 목적으로 개발되었다. 셀서치 시스템은 혈액 샘플을 상피 세포에 부착하는 항체로 코팅된 철 입자와 혼합하는 기술을 수반한다. 이어서 상피 세포는 암 세포가 용이하게 구별되고 계수될 수 있도록 형광 염료로 표지시킨 항체에 의해 백혈구와 구별된다.
온코퀵(OncoQuick)TM (그라이너 바이오원 인코포레이티드(Greiner Bio-One-, Inc.), 미국 플로리다주 롱우드)은 순환 종양 세포 검출을 위해 개발된 또 다른 시험 시스템이다. 이러한 시스템은 밀도 구배 원심분리와 면역-기반 기술을 조합하는 향상된 밀도 구배 시스템이다.
하나 이상의 순환 종양 세포를 선택적으로 농축하는 마이크로유체 소자에 상기 샘플을 통과하여 유동시키는 단계를 포함하는, 환자로부터의 샘플 중 CTC의 수를 계수하는 방법이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2010/0233693에 기재되어 있다. 마이크로유체 소자는 크기, 친화성, 변형성 또는 형상에 기반하여 하나 이상의 CTC를 농축할 수 있다.
마이크로채널 소자를 이용하여 CTC를 단리하고 분석하는 방법이 미국 특허 출원 번호 2010/0255479에 기재되어 있다. 이러한 방법은 CTC를 함유하는 샘플을 세포에 특이적으로 결합하는 결합 파트너로 미리 표지하거나 또는 그와 미리 혼합하여 마이크로채널 소자 중 CTC의 포획을 증진시킴으로써 용액으로부터의 생물학적 표적의 포획을 제공한다.
순환 종양 세포를 검출하는 전술한 방법 각각은 세포 농축 단계를 요구한다. 본 발명의 두드러진 특징은 5T4-양성 암 보유 환자 대다수에서 CTC의 유의한 수를 확인하는 능력을 증명해 보여주는 무농축 검정이다.
본 발명의 측면은 일반적으로 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포 (CTC)를 검출하는 방법 또는 포유동물 대상체에서 초기 단계 5T4-양성 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 5T4-양성 암의 치료를 위한 포유동물 대상체에서 약물 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터 CTC를 함유하는 것으로 의심되는 혼합 세포 집단을 포함하는 혈액의 샘플을 수득하는 단계, 기판 상에 혈구 및 CTC를 탑재하여 생물학적 단층을 형성하는 단계, 생물학적 단층 중 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커를 검출하는 단계, 생물학적 단층 중 CTC에 결합하는 제2 마커를 검출하는 단계, 생물학적 단층 중 혼합 세포 집단 또는 혼합 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커를 검출하는 단계, 생물학적 단층 중 5T4-양성 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커를 검출하는 단계, 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하여 CTC를 확인하는 단계를 포함하며, 혈액의 샘플 중 CTC의 존재는 포유동물 대상체 중 5T4-양성 암 또는 초기 단계 5T4-양성 암의 존재를 나타내는 것인, 포유동물 대상체에서 5T4-양성 CTC를 검출하는 방법이 제공된다. 혈액의 샘플 중 CTC의 존재 또는 부재는 포유동물 대상체에서의 무질환 상태 또는 비-측정가능 질환 상태의 존재를 나타낼 수 있다.
방법은 암 환자의 혈액 중 5T4-양성 CTC를 검출하는 방법과 함께, 혈액 샘플 내 상피-유래 세포를 확인하기 위한 세포 부착 프로토콜을 제공한다. 이러한 프로토콜에서, 혈액 중의 살아있는 백혈구 (WBC), 예를 들어 백혈구 및 기타 세포를 슬라이드 상에, 예를 들어 생물학적 단층으로서 단리시킨다. 백혈구는 T-림프구; 식세포작용에 관여하는 단핵구, 호산구 및 호중구; 및 염증 반응에 관여하는 호염기구를 포함하며 그들에 한정되지 않는다.
방법은 특수 코팅한 접착성 슬라이드 상의 부착 WBC 및 CTC를 형광 표지하는 것을 추가로 제공한다. 세포는 유핵 세포에 선택적으로 결합하는 제1 마커 (여기서 상기 제1 마커는 DAPI이다), 순환 종양 세포에 결합하는 제2 마커 (여기서 상기 제2 마커는 CTC의 필수 성분인 시토케라틴 (CK)이다), 종양 세포인 것으로 결정되지 않는 세포 집단 또는 세포 집단의 하위세트에 결합하는 제3 마커 (여기서 상기 제3 마커는 CD45이다), 및 순환 종양 세포에 선택적으로 결합하는 제4 마커 (여기서 상기 제4 마커는 인간 5T4 항원이다)로 형광 표지된다. 슬라이드는 이어서 형광 부위에 대하여 스캐닝되고, 제1, 제2, 제3 및 제4 마커에 의해 검출된 세포 파라미터를 검량하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 알고리즘을 이용하는 고성능 계산으로 분석된다.
방법은 형광 현미경검사 및 세포 부착 프로토콜을 이용하여 5T4-양성 암 환자에서 CTC의 유병율을 조사하는 방법을 추가로 제공한다. 방법의 부가적인 이점은 병리학자로 하여금 병리학적 확인 및 특징규명을 위하여 관심 세포를 재배치하고 조사할 수 있게 해주는 것이다. 본 발명에서, 프로토콜은 커버슬립을 제거하고/하거나 각 형광-염색 슬라이드 상에 수용성 탑재 매질(mounting media)을 가용화하고 제2 세포 마커, 예를 들어 표준 라이트-김사 염색을 이용하여 동일 세포를 재-염색하여 CTC 형태, 크기 및 불균질에의 부가적인 통찰력을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 고성능 계산 및 세포 부착 프로토콜에 의해 위치특정된 공지의 CK+ 개별 희귀 세포 및 희귀 세포 클러스터는 형태학적으로 평가될 수 있다. 비록 CTC의 형광 영상이 그들의 검증된 확인에 도움을 주었지만, 라이트-김사 염색은 CTC에 관한 부가적인 세포학적 정보를 제공하였다. 본 발명의 추가 측면에서, 방법은 질환 상태, 세포 유형 또는 세포 상태에 대하여 특이적인 상이한 세포 마커의 평가에 이용될 수 있다.
CTC 검출 및 특징규명 능력은 5T4-양성 암 환자의 진단적 및 개별화된 치료를 보조할 잠재성을 갖는다. 그들의 희귀성으로 인하여, CTC 조사에는 특수한 방법이 요구된다. 본 발명은 암 환자로부터 수득한 혈액 중 CTC의 상세한 형태학적 특징규명을 위한 표준 세포병리학적 방법의 사용을 가능케 해주고 표면 단백질-기반 농축을 사용하지 않고도 소정 범위의 CTC의 세포학적 특징의 세부사항을 제공하는 유체상 생검 접근법을 제공한다. 전혈로부터 회수된 유핵 세포를 접착성 슬라이드 상에 침착시켜, 면역형광 표지한 다음, 디지탈 현미경검사에 의해 5T4-양성 CTC에 대하여 분석한다. 이들 기술을 일상적인 염색 방법과 연계시키면 광학 현미경검사를 이용하여 CTC의 확인 및 평가를 가능케 해준다. 통상적인 병리학적 방법을 이용하여 세포를 관찰하면, CTC는 전혈 제제에서 고도의 환자간 및 환자내 다형태성(pleomorphism)을 보이며, 아폽토시스성 특질을 보이는 CTC와 더불어 높은 및 낮은 핵 대 세포질 비율 양쪽 모두를 갖는 무손상 CTC가 확인된다. 형태학적 관찰은 원발성 및 전이성 종양 부위에 존재하는 세포의 전범위가 또한 혈액으로 순환중인 것으로 보일 수 있음을 시사하고, 더 나아가서는 전이에 관여된 세포 하위세트의 특성을 조사하기 위한 형태학적 분류의 가능한 골격을 제공한다.
자동 디지탈 현미경검사. 예상되는 세포의 좌표를 완전 자동 스캐닝 디지탈 현미경검사 시스템인 희귀-사례 영상화 시스템 (rare-event imaging system, REIS)에 대입한다. REIS의 하드웨어 성분 및 특허 스캐닝 소프트웨어는 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다 (문헌 [Krivacic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10501-10504, 2004]).
측정. 검출된 형광 물체를 소프트웨어 필터 작업으로 분석하여 희귀 세포를 가양성체와 구별한다. 세포는 일반적으로 레이저-스폿 해상도 (20 ㎛)보다 작기 때문에, 제1 필터는 크기 역치 (20 ㎛) 미만인 모든 물체를 통과시킨다. 제2 필터는 상이한 채널로부터의 형광의 강도간 비율을 분석하여 면역형광 염색의 통상적인 인공물인 균질한 염료 응집체를 제거한다.
샘플은 대상체로부터의 혈액 또는 혈액의 일부를 포함한 (이에 한정되지 않음) 생물학적 유체의 샘플을 뽑아냄으로써 생물학적 단층으로서 제조될 수 있다. 한 측면에서, 샘플은 세포의 단층이다. 유체 샘플은 표면에 또는 세포 내부에 있을 수 있는 상이한 종류의 생물학적 분자, 예컨대 단백질, 핵산 또는 기타 분자에 선택적으로 결합하는 형광 물질, 예컨대 마커 염료 (이에 한정되지 않음)로 처리된다. 선택된 암 세포 유형, 태아 세포, 또는 고려되는 다른 적당한 세포를 비롯하여 임상적 관심의 다수의 상이한 세포 유형을 표지하기 위한 적합한 마커가 당업계에 알려져 있다. 그 중에서도 특히 박테리아 세포뿐만 아니라 뇌 세포, 간 세포와 같은 다수의 다른 세포에 대한 마커가 개발될 수 있다. 물질은 선택된 여기 조사, 예컨대 광의 선택된 파장 또는 스펙트럼에 의한 조사, x선 조사, 전자-빔 조사 등에 반응하여 특징적인 출력, 예컨대 형광 또는 인광을 방출한다. 특징적인 발광은 전형적으로 파장의 특징적인 파장 또는 스펙트럼 범위를 갖는다. 염료가 우세한 표지 방법이지만, 양자점 및 DNA 나노입자 프로브로 알려져 있는 마커의 사용을 포함하여 다른 기술이 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생물학적 단층 내 희귀 세포, 예를 들어 5T4-양성 순환 종양 세포 (CTC)의 위치를 입수하는 방법이 제공된다. 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 2004/0131241을 참조한다. 적어도 하나의 희귀 세포를 운반하고 실질적으로 직각을 이루는 위치에 배치된 십자선 마크를 가지는 슬라이드를 제1 영상화 시스템의 슬라이드 홀더에 위치시킨다. 영상화 시스템의 제1 좌표공간이 정의되고, 제1 좌표공간내 십자선 마크의 좌표가 지정된다. 제2 영상화 시스템의 제2 좌표공간이 정의되고, 제2 좌표공간내 십자선 마크의 좌표가 지정된다. 제1 좌표공간의 십자선 마크의 지정 좌표를 이용하여, 좌표 변환 파라미터를 계산한다. 그 후, 제1 좌표공간내 적어도 하나의 물체의 좌표를 지정하고, 물체의 제1 좌표공간 좌표를 좌표 변환 파라미터를 사용하여 제2 좌표공간내 고유 좌표로 변환시킨다.
일단 희귀 세포 또는 CTC가 국재화되면, 생물학적 단층 상의 커버슬립을 제거할 수 있거나 또는 수용성 탑재 매질을 각 형광-염색 슬라이드 상에 가용화시킬 수 있다. 동일 세포를 제2 세포 마커, 예를 들어 표준 라이트-김사 염색을 이용하여 재-염색하여 CTC 형태, 크기 및 불균질에의 통찰력을 제공할 수 있다. 공지의 시토케라틴-양성 (CK+) 개별 희귀 세포 및 희귀 세포 클러스터가 위치특정되고 형태학적으로 평가될 수 있다. 비록 CTC의 형광 영상이 그들의 확인된 확인에 도움을 주었지만, 라이트-김사 염색은 CTC에 관한 부가적인 정보를 제공하였다.
추가 측면에서, 이러한 과정을 이용하여 질환, 질환 상태, 세포 유형 또는 세포 상태에 특이적인 상이한 세포 마커를 평가할 수 있다. 본 발명의 방법은 CTC의 특징규명에 도움을 줄 것이다. 농축없이 5T4-양성 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 CTC의 고-품질 검증을 가능케 해주고, CTC의 형태 및 특징에의 통찰력을 제공한다.
희귀 전이성 CTC에 대한 조사는 다수 CTC가 아폽토시스성이고 전이를 형성할 수 없음을 시사하며, 10,000개 중 단 1개의 파종된 암 세포만이 전이를 확립할 수 있음을 추정한다. 따라서, 이들 희귀 세포의 검출, 형태학적 분류 및 분자적 특징규명은 CTC의 임상적 유의성을 증명해 보여주는 신규한 지향성 요법을 표적화할 수 있다.
암 치료
암 치료의 방법은 면역요법이며, 여기서 5T4 항원에 특이적인 항체는 적합한 약물, 예컨대 세포독성제나 세포증식억제제, 면역억제제, 방사성동위원소, 독소 등에 접합될 수 있다. 항체-약물 접합체 (ADC)를 이용하여 환자에서 5T4-양성 종양 세포 또는 암 세포로 약물을 전달할 수 있다. 5T4-양성 암의 치료를 위한 ADC는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,309,094에 개시되어 있다. ADC의 예로는 5T4-A1-mcMMAF, 5T4-A1-vcMMAE 및 5T4-vc-MMAD가 있으며, 여기서 5T4-A1은 5T4 항원에 특이적으로 결합하는 인간화 항체이고 MMAE, MMAE 및 MMAD는 아우리스타틴 유도체이다. 아우리스타틴은 미세소관 역학과 핵 및 세포 분열을 방해하고 항암 활성을 보유하는 것으로 나타났다.
진단 검정
본 발명의 실시양태를 도 1a에 도시하였으며, 여기서 CTC 상 5T4 항원의 정량을 사용하여 각 카테고리내 CTC의 백분율에 그들의 각 카테고리 값을 곱하여 합산함으로써 "H-점수"를 생성하고, 0 내지 300 사이의 점수가 생성된다. 도 1b에 도시한 바와 같이, 채점 시스템은 5T4 발현 수준에 기반하여 선택된 NSCLC 세포주의 패널을 사용하여 실시예 1에 기재된 최적화 5T4 4색 검정에 의해 측정되는 5T4 발현을 이용한다. 이들 수준은 표준 면역세포학적 (ICC) 염색 실험에 의해 확인되었다. 이들 세포주는 5T4의 고 (MDA-MB-435 및 NCI-H226 세포주), 중 (NCI-H1975 및 MDA-MB-361 세포주) 및 저 (NCI-H522 및 NCI-H2122 세포주) 발현 수준을 나타낸다. 이들 세포주 각각에서의 5T4의 평균 발현 수준을 이용하여 이러한 검정에서 5T4의 고-, 중- 및 저-발현에 대한 역치를 확립하였다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 암 환자는 실시예 1에 기재된 최적화 5T4 4색 진단 검정을 이용하여 5T4 항원을 발현하는 CTC의 존재에 대하여 스크리닝된다. 이러한 검정은 원발성 종양에서 5T4 표적의 CTC 발현과 5T4 발현간의 상관관계를 측정함으로써 뿐만 아니라 CTC를 계수 및 특징규명함으로써 CTC 상 5T4 항원 발현 수준의 측정에 도움을 줄 것이다. 도 2a에 도시한 5T4 발현 산발 플롯은 대조군 세포주에 의해 보정한 단일 CTC 및 CTC 클러스터 양쪽 모두에 대한 것이다. 도 2b에 도시한 바와 같이, 17개 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자 샘플을 최적화 5T4 4색 검정으로 프로세싱하였다. 따라서, 본 발명의 5T4 4색 검정을 이용하여 H-점수 카테고리를 측정하고 이를 이어서 H-점수 계산에 사용한다. 궁극적으로, 5T4 표적-발현 CTC를 확인하는 진단 검정은 치료가능한 암 환자 집단의 확인에 및 ADC, 예컨대 5T4-A1-mcMMAF로의 치료 동안 암 환자에서 CTC를 모니터링하는 수단으로서 이용될 것이다.
본 발명의 추가 측면은 CTC 상 5T4를 특징규명하기 위한 예비 채점 시스템으로서 H-점수를 사용하는 것이다. 전술한 바와 같이, H-점수는 각 카테고리내 CTC의 백분율에 그들의 각 카테고리 값을 곱하여 합산하는 가중 점수이며, 0 내지 300 사이의 점수를 생성한다. CTC는 도 1a에 도시한 바와 같이 개별적인 5T4 발현에 기초하여 4개 카테고리 (0-3)로 세분된다. 합리적으로 유용한 H-점수를 계산해내기 위해서는 최소 10개 CTC가 존재하여야 한다.
환자에 대하여, H-점수는 두 가지 방식으로 계산될 것이다: (1) 전통적인 H-점수 (THS) - 매 사례 (단일 CTC 또는 CTC 클러스터)의 평균 5T4 강도가 단일 데이터 포인트로서 계수된다; (2) 클러스터-가중 H-점수 (CWHS) - 매 CTC 평균 5T4 강도 (단일 또는 클러스터내)가 단일 데이터 포인트로서 계수된다.
H-점수 카테고리에 대한 값 및 카테고리당 %CTC를 이용하는 H-점수 계산의 일례는 다음과 같다: H-점수 카테고리 0 (1.5% CTC); H-점수 카테고리 1 (15.0% CTC); H-점수 카테고리 2 (68% CTC); H-점수 카테고리 3 (15.5% CTC). H-점수 = (1.5 x 0) + (15.0 x2) + (68.0 x 2) + (15.5 x 3) = 198
이어서 H-점수를 이용하여 ADC, 예컨대 5T4-A1-mcMMAF 또는 다른 5T4-특이적 ADC로의 치료에 대한 최고 성공 확률을 보이게 될 환자 집단을 선택할 수 있다. 도 2b는 본 발명의 5T4 4색 검정을 이용하는 17명 NSCLC 환자 중 14명에 대한 H 점수 계산을 제공한다.
다른 실시양태에서, 최적화 5T4 4색 검정으로 5T4-양성 CTC를 확인함으로써 5T4-양성 암을 보유하는 환자를 확인하는 단계, H-점수를 측정함으로써 상기 환자를 카테고리화하는 단계, 및 5T4-양성 암에 특이적으로 결합하는 유효량의 ADC를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또한 환자는 최적화 5T4 4색 검정을 이용하여 5T4-양성 CTC의 존재에 대하여 요법중에 시간적인 간격을 두고 모니터링된다. ADC로의 처리 전 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 수와 비교하여 ADC로의 처리 후 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 감소된 수의 검출은 포유동물 대상체에서의 5T4-양성 암 치료에 있어서 항체-약물 접합체 화합물의 유효성을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 최적화 5T4 4색 검정을 이용하여 세포 집단을 분석하여, 항체-약물 접합체로의 처리 후와 비교하여 항체-약물 접합체로의 처리 전 시험 샘플 중 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하며, 여기서 처리 전 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포 비율과 비교하여 처리 후 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포 비율의 변화는 5T4-양성 순환 종양 세포의 감소에 있어서 항체-약물 접합체의 효능을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 최적화 5T4 4색 검정으로 5T4-양성 CTC를 확인함으로써 5T4-양성 암을 보유하는 환자를 확인하는 단계 및 화학요법제와 조합하여 5T4-양성 암에 특이적으로 결합하는 유효량의 ADC를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 화학요법제는 암의 치료가 불응성인 것으로 밝혀지지 않은 것이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 암의 치료가 불응성인 것으로 밝혀진 것이다. ADC는 또한 치료, 예컨대 암 치료를 위한 수술을 받은 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료의 부가적인 방법은 방사선 요법이다. 또한 환자는 최적화 5T4 4색 검정을 이용하여 5T4-양성 CTC의 존재에 대하여 요법중에 시간적인 간격을 두고 모니터링된다.
검출가능한 표지
검정에 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 기는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능하다. 표지의 특정 유형은 검정에 사용된 세포 또는 순환 종양 세포 상 세포 마커에의 항체의 특이적 결합을 현저하게 방해하지 않는 한 본 발명의 중요 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 그러한 검출가능한 표지는 검정 또는 면역검정 분야에 충분히 개발되었으며, 일반적으로, 그러한 방법에 유용한 대부분의 임의의 표지는 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에서의 유용한 표지는 알렉사플루오르(AlexaFluor)® 형광 염료 (인비트로젠(Invitrogen)), 자기 비드 (예를 들어, 다이나비즈(Dynabeads)TM), 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성표지, 기타 영상화제, 예컨대 마이크로버블 (초음파 영상화용), 효소 (예를 들어, ELISA에 통용되는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등), 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다.
표지는 당업계 주지의 방법에 따라 검정의 목적 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 전술한 바와 같이, 다양한 표지가 사용될 수 있으며, 표지의 선택은 요구되는 감도, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 기구사용, 및 처분 규정에 따라 좌우된다.
비-방사성 표지는 종종 간접 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예를 들어, 비오틴)가 분자에 공유결합된다. 이어서 리간드는 본질적으로 검출가능하거나 또는 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유결합되는 항-리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 다수의 리간드 및 항-리간드가 사용될 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드, 예를 들어 비오틴, 티록신 및 코르티솔을 갖는 경우, 표지된 자연 발생 항-리간드와 함께 사용될 수 있다. 이와 달리, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물이 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
분자는 또한 예를 들어 효소 또는 형관단과의 접합에 의해 신호-발생 화합물에 직접 접합될 수 있다. 표지로서의 관심 효소는 주로 가수분해효소, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 산화환원 효소, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광 화합물은 알렉사플루오르® 형광 염료 (인비트로젠), 플루오레세인과 그의 유도체, 로다민과 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린, 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호-생성 시스템의 검토에 대해서는, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,391,904를 참조한다.
표지 검출 수단은 당업자에게 주지이다. 따라서, 예를 들어 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단은 자가방사법에서와 같은 섬광 계수기 또는 사진용 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 형광색소를 광의 적당한 파장으로 여기시키고 생성되는 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 사진용 필름에 의해, 전자 검출기, 예컨대 전하 커플링 소자 (CCD) 또는 광전증배관 등의 사용에 의해 가시적으로 검출될 수 있다. 마찬가지로, 효소 표지는 효소에 대한 적당한 기질을 제공하고 생성되는 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 마지막으로, 단순 비색 표지는 단순히 표지와 관련된 색상을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
다른 실시양태 및 용도는 본원 개시내용에 비추어 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1
최적화 5T4 4색 진단 검정
최적화 4 채널 검정은 5T4-양성 CTC의 확인을 위하여 개발되었다. CTC를 4종의 상이한 염색제로 염색하고 4개 별도 채널 상에서 측정하였다. 예를 들어, CTC는 항-CK-알렉사플루오르® 555 (적색); 항-CD45-알렉사플루오르® 488 (녹색); 항-5T4-알렉사플루오르® 660 (자주색)으로 염색할 수 있고; 세포핵은 DAPI로 청색 염색한다. 알렉사플루오르® 형광 염료 (인비트로젠)는 다수의 색상으로 입수가능하므로 대안적인 염색 조합이 이용가능하다.
환자 및 혈액 샘플 수집
샘플을 전이성 암 환자로부터 항-응고 혈액 튜브에 수집하여 24시간 안에 프로세싱하였다. 혈액 샘플을 또한 정상 대조군으로부터도 채취하였다.
CTC 검출을 위한 혈액 샘플 프로세싱
헤모큐(Hemocue) WBC 시스템 (헤모큐, 스웨덴)을 사용하여 백혈구 (WBC) 총수를 측정하기 전에 혈액 샘플을 5분 동안 흔들어 주었다. WBC 총수에 기초하여, 소정 부피의 혈액을 적혈구 용해 (염화암모늄 용액)에 투입하였다. 원심분리 후, 유핵 세포를 PBS에 재현탁시키고 주문제작 유리 슬라이드 상에 단층으로서 부착시켰다. 유리 슬라이드는 표준 현미경검사 슬라이드와 동일한 크기이지만 살아있는 세포의 최대 보유를 허용하는 특허 코팅을 갖는다. 각각의 슬라이드는 대략 삼백만개 유핵 세포를 보유하고; 따라서 슬라이드 당 플레이팅된 세포의 수는 환자의 WBC 총수에 좌우되었다.
이 연구를 위한 암 환자에서의 CTC 검출을 위하여, 4개 슬라이드가 하나의 시험으로서 사용하였다. 각각의 환자에 대하여 생성된 나머지 슬라이드는 후일 실험을 위해 -80℃에서 저장하였다. 각각의 환자에 대하여 4개 슬라이드를 해동시키고, 이어서 세포를 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, 차가운 메탄올로 투과화시킨 다음, 비-특이적 결합 부위를 염소 혈청으로 차단하였다. 슬라이드를 후속하여 모노클로날 항-팬 시토케라틴 항체 (시그마(Sigma)), 및 CD45-알렉사 형광 염료 (세로텍(Serotec))와 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS 세척 후, 슬라이드를 염소 항-마우스 항체-알렉사 형광 염료 (인비트로젠)와 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS 세척 후, 슬라이드를 이어서 항-5T4 항체-알렉사 형광 염료와 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 DAPI로 10분 동안 대조염색한 다음 수성 탑재 매질로 탑재하였다.
영상화 및 기술적 분석
각 환자로부터의 4개 슬라이드 전부를, 고속의 신뢰성 있는 스캐닝용으로 개발 및 최적화된 주문제작 형광 스캐닝 현미경을 사용하여 스캐닝하였다. 각각의 슬라이드는 10x 배율에서 4개 색상으로 완전히 스캐닝하였으며 6900개가 넘는 영상을 생성하였다. 생성되는 영상을 시토케라틴 강도, CD45 강도, 5T4 강도 및 핵과 세포질의 형상과 크기를 비롯한 다양한 척도에 기초하여 유력후보 CTC를 확인하는 분석 알고리즘에 대입하였다. 이어서 기술적 분석자는 알고리즘 전과정을 완수하여 유력후보를 생성하고 명백히 세포가 아닌 히트(hit), 예컨대 염료 응집체를 제거하였다.
전문 분석 및 해석
모든 유력후보 CTC를 웹-기반 보고를 통한 분석 및 해석을 위하여 혈액병리학자에게 제출하였으며, 여기서 혈액병리학자는 각 후보 세포를 CTC로서 포함시키거나 또는 배제시킨다. 세포는, 그들이 시토케라틴 양성, 5T4 양성, CD45 음성이고, 특정할 수 있는 아폽토시스성 변화 (수포화(blebbing), 퇴화된 외관) 또는 붕괴된 외관 없이 무손상 DAPI 핵을 함유하며, 주위 WBC와는 형태학적으로 다른 경우, CTC로서 분류되었다. 세포는 뚜렷하게 원주상이고 온전한 핵이 들어있는 세포질을 가지고 있어야 한다. 세포질은 주변 세포질 경계에서 수포화 및 불규칙한 밀도 또는 온화한 붕괴와 같은 아폽토시스성 변화를 보일 수는 있지만, 그의 핵과의 회합에 문제가 있을 정도로 붕괴되지는 않아야 한다. 영상은 복합 영상으로서 뿐만 아니라 개별 형광 채널 시능력(viewing capability)을 갖는 디지탈 영상으로서 제시되었다. 각 세포 영상에는 상대적인 핵 크기, 형광 강도 및 비교 형광 강도에 관하여 보조 통계 데이터로 주석을 달았다. 각 CTC 후보는 배경 WBC와 대비하여 해당 세포의 세포형태학적 특징간의 전후관계 비교를 가능케 하도록 충분한 주위 WBC와 시야에 제시되었다.
라이트- 김사 염색. 커버슬립을 형광 염색된 슬라이드로부터 제거하고 PBS에서 세정하였다. 슬라이드를 이어서 라이트-김사 염색제 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미국 미시간주 칼라마주)로 3분 동안 플러딩하였다(flooded). 1.5 mL의 포스페이트 완충제 pH 6.8 (피셔 사이언티픽, 미국 미시간주 칼라마주)를 염색제-피복된 슬라이드에 첨가하고 염색제와 완충제를 1분 동안 부드럽게 흔들어 줌으로써 함께 혼합하였다. 혼합물을 이어서 슬라이드 상에 2분 더 정치시킨 다음, 슬라이드를 탈이온수로 세정하고 공기 건조시켰다.
본 발명의 최적화 5T4 4색 검정의 CTC 확인 및 특징규명 과정에 이용되는 단계는 다음과 같다: (1) 슬라이드 제조; (2) 슬라이드 저장; (3) 슬라이드 해동 및 염색; (4) 슬라이드 스캐닝; (5) 알고리즘 실행; 및 (6) 기술적 분석 및 보고.
CTC 검정은 구체적으로는 조기 기술 혁신과 장래 자동화에 대한 필요성뿐만 아니라 임상 환경을 염두에 두고 개발되었다. 모든 실험실 과정은 최적화되고 시험되며 검증된 엄격한 표준 조작 절차를 준수하였다. 데이터 수집 및 후보 확인은 병리학자의 의사 결정 및 이들 결정의 후속 추적 양쪽 모두를 가능케 해주는 특정 인터페이스를 사용하여 자동화하였다.
이러한 시스템은 암 환자의 포인트 오브 케어(point-of-care) 스크리닝, 모니터링 및 관리를 위한 적용뿐만 아니라 CTC의 형태학적 분류 분자적 특징규명에의 새로운 연구를 가능케 해줄 것을 약속한다.

Claims (42)

  1. 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계;
    기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계;
    혈액의 샘플 중 제1 마커를 사용하여 유핵 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제2 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제2 마커는 시토케라틴인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제3 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제3 마커는 CD45인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제4 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및
    세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커를 분석하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계
    를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재의 검출이 포유동물 대상체에서의 초기 단계 5T4-양성 암의 존재를 나타내는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 부재의 검출이 포유동물 대상체에서의 무질환 상태 또는 비-측정가능 질환 상태를 나타낼 수 있으며, 여기서 질환이 5T4-양성 암인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재 또는 부재의 검출이 5T4-양성 암 요법 또는 암 회복 동안의 요법 관리를 나타내는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 세포 집단이 혼합 세포 집단인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 기판이 평면 기판인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 기판이 마이크로유체 소자인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 기판이 세포의 농축 집단을 보유하는 카트리지인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 기판 상 샘플의 탑재가 생물학적 단층을 형성하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제1 마커, 제2 마커, 제3 마커 또는 제4 마커가 형광을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제1 마커가 핵의 세부, 핵의 윤곽, 핵소체의 존재 또는 부재, 세포질의 질 또는 세포질의 양에 의해 세포 집단을 분석하는 데에 사용되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제1 마커가 DAPI인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 높은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 낮은 핵 대 세포질 비율을 갖는 무손상 세포, 초기 아폽토시스 세포 또는 후기 아폽토시스 세포를 측정하고, 순환 종양 세포 및 순환 종양 세포 클러스터를 확인함으로써, 세포 집단을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 형태, 크기, 또는 핵 대 세포질 비율에 의해 순환 종양 세포를 확인하기 위한 세포학적 염색제를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세포학적 염색제가 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색제인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 기판에의 세포 부착에 의해 세포 집단을 분석하는 단계, 기판 상 세포 집단을 스캐닝하는 단계, 및 재배치를 사용하여 디지탈 현미경검사에 의해 세포를 영상화하는 단계를 추가로 포함하는, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원을 정량하여 H-점수를 생성하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출이 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재를 나타내는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재의 검출이 포유동물 대상체에서의 5T4-양성 암의 존재를 나타내는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 5T4-양성 암이 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 신장, 폐, 식도, 난소, 전립선, 췌장, 피부, 위 및 고환의 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  21. 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계;
    기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계;
    혈액의 샘플 중 제1 마커를 사용하여 유핵 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제2 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 제2 마커는 시토케라틴인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제3 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 제3 마커는 CD45인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제4 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및
    세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커를 분석 및 정량하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계
    를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암을 진단하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원의 정량을 사용하여 H-점수를 생성하며, 여기서 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되는 것인, 5T4-양성 암을 진단하는데 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제1 마커가 DAPI인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출이 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 방법.
  25. 암을 보유하는 것으로 의심되며 5T4-양성 암의 치료를 위한 치료 유효량의 항체-약물 접합체를 투여받은 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계;
    기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계;
    혈액의 샘플 중 제1 마커를 사용하여 유핵 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제2 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제2 마커는 시토케라틴인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제3 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제3 마커는 CD45인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제4 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및
    세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커를 분석하여, 항체-약물 접합체로의 처리 후와 비교하여 항체-약물 접합체로의 처리 전 혈액의 샘플 중 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계
    를 포함하며, 여기서 처리 전 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포의 비율과 비교하여 처리 후 혈액의 샘플 중 5T4-양성 순환 종양 세포 대 5T4-음성 순환 종양 세포의 비율 변화는 5T4-양성 순환 종양 세포의 감소에 있어서 항체-약물 접합체의 효능을 나타낼 수 있는 것인,
    암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 암의 치료를 위한 항체-약물 접합체의 활성 또는 효능을 스크리닝하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원을 정량하여 H-점수를 생성하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되는 것인, 5T4-양성 암의 치료를 위한 항체-약물 접합체의 활성 또는 효능을 스크리닝하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제1 마커가 DAPI인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출이 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 항체-약물 접합체가 항-5T4-A1-mcMMAF인 방법.
  30. 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플을 시험하며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 단계;
    기판 상에 혈액의 샘플을 탑재하는 단계;
    혈액의 샘플 중 제1 마커를 사용하여 유핵 세포의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제1 마커는 DAPI인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제2 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제2 마커는 시토케라틴인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제3 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제3 마커는 CD45인 단계;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제4 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하며, 여기서 제4 마커는 인간 5T4 항원인 단계; 및
    세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커를 분석 및 정량하여 순환 종양 세포를 확인 및 특징규명하는 단계
    를 포함하는, 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원의 정량을 사용하여 H-점수를 생성하며, 여기서 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출이 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커의 분석 및 정량을 이용하여 5T4-양성 암의 치료를 위한 포유동물 대상체의 포함 또는 배제를 결정하는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  34. 기판 상에 탑재된 5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체로부터의 혈액의 샘플 중 유핵 세포에 결합하는 제1 마커이며, 여기서 혈액의 샘플은 세포 집단을 포함하는 것인 제1 마커;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제2 마커의 발현을 검출하기 위한 항-시토케라틴 항체이며, 여기서 제2 마커는 시토케라틴인 항-시토케라틴 항체;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제3 마커의 발현을 검출하기 위한 항-CD45 항체이며, 여기서 제3 마커는 CD45인 항-CD45 항체;
    혈액의 샘플 중 세포 상 제4 마커의 발현의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 항-5T4 항체이며, 여기서 제4 마커는 인간 5T4 항원인, 항-5T4 항체를 포함하며,
    여기서 세포 집단 내의 제1, 제2, 제3 및 제4 마커의 분석 및 정량이 순환 종양 세포의 확인 및 특징규명을 허용하는 것인,
    5T4-양성 암을 보유하는 것으로 의심되는 포유동물 대상체에서 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하기 위한 키트.
  35. 제34항에 있어서, 순환 종양 세포 상 인간 5T4 항원의 정량을 사용하여 H-점수를 생성하며, 여기서 H-점수는 5T4-양성 암 환자 집단을 선택하는 데에 사용되는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하기 위한 키트.
  36. 제34항에 있어서, 제1 마커가 DAPI인 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하기 위한 키트.
  37. 제34항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출이 5T4-양성 순환 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하기 위한 키트.
  38. 제34항에 있어서, 제1 마커의 존재, 제2 마커의 존재, 제3 마커의 부재 및 제4 마커의 존재의 검출을 이용하여 5T4-양성 암의 치료를 위한 포유동물 대상체의 포함 또는 배제를 결정하는 것인, 5T4-양성 순환 종양 세포를 검출하기 위한 키트.
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