RU2646498C2 - Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего - Google Patents

Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего Download PDF

Info

Publication number
RU2646498C2
RU2646498C2 RU2014127474A RU2014127474A RU2646498C2 RU 2646498 C2 RU2646498 C2 RU 2646498C2 RU 2014127474 A RU2014127474 A RU 2014127474A RU 2014127474 A RU2014127474 A RU 2014127474A RU 2646498 C2 RU2646498 C2 RU 2646498C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
marker
blood sample
cells
absence
circulating tumor
Prior art date
Application number
RU2014127474A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014127474A (ru
Inventor
Ханс-Питер ГЕРБЕР
Дена Марринуччи
Стивен ПАЙРИ-ШЕПЕРД
Эрик ТАКЕР
Original Assignee
Пфайзер Инк.
Эпик Сайенсиз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пфайзер Инк., Эпик Сайенсиз, Инк. filed Critical Пфайзер Инк.
Publication of RU2014127474A publication Critical patent/RU2014127474A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2646498C2 publication Critical patent/RU2646498C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70589—CD45

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована при диагностике 5Т4-положительного рака. Способы по изобретению включают тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток, закрепление образца крови на подложке, детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера, детектирование наличия или отсутствия в образце крови экспрессии на клетке второго маркера, детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера, детектирования в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4 и анализ первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток. Использование изобретений позволяет выявить антиген 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках, провести морфологическую классификацию их молекулярной характеристики для скринига, мониторинга и ведения пациентов с раком. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в целом, относится к способу детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего и к способам диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Человеческий антиген 5Т4 экспрессируется при многочисленных типах рака и по существу отсутствует в нормальных тканях. Недавно были разработаны высокоаффинные моноклональные антитела, которые специфически связываются с антигеном 5Т4, и с антителами к 5Т4 были конъюгированы цитотоксические агенты с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство для применения в лечении 5Т4-положительного рака (патенты США №8044178 и 8309094). Из этого следует, что оценка экспрессии 5Т4 может представлять собой полезный подход для идентификации пациентов с 5Т4-положительным раком. Один подход будет состоять в выявлении антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках (СТС) у пациентов с раковым заболеванием.
Циркулирующие опухолевые клетки были обнаружены в периферической крови пациентов с раками эпителиального происхождения в ультранизких концентрациях (Kraeft et al., Clin Cancer Res 10: 3020-3028, 2004). Было показано, что число этих клеток коррелирует с результатом для групп пациентов с метастатическим раком молочной железы с прогрессирующим на момент взятия образцов заболеванием (Cristofanilli et al., N Engl J Med 351: 781-791, 2004). По этой причине их характеристика представляет значительный биомедицинский интерес для понимания того, как эти клетки могут перемещаться по кровотоку к анатомически отдаленным районам и вызывать метастатическое заболевание. Следовательно, определение СТС, ассоциированных с 5Т4-положительным раком, может обеспечить ценное диагностическое средство для идентификации пациента.
В настоящее время СТС выявляют и анализируют, главным образом, с помощью иммуноцитохимических маркеров, таких как EpCam, и путем применения окрашивания ядер DAPI (4ʹ,6-диамидино-2-фенилиндол), флуоресцентного красителя, который прочно связывается с А-Т-богатыми областями ДНК. Хотя эти подходы были успешными при подсчете и распознавании СТС, они отличаются от стандартных цитопатологических подходов, так как они пренебрегают корреляцией со стандартным морфологическим окрашиванием, от которого зависит диагностическая патология. Это создает трудности при сравнении СТС с опухолевыми клетками из других очагов, полученными путем рутинных диагностических процедур. Хотя способность выявлять СТС потенциально может помочь в диагностике и индивидуализированном лечении рака и способствовать эффективности лечения, понимание биологии СТС может быть усовершенствовано путем включения стандартных цитопатологических методов. В данной области техники существует необходимость применения детальной визуализации СТС с высоким разрешением с традиционными методами диагностики патологии окрашиванием и светлопольной микроскопией для подтверждения потенциальной возможности выполнения стандартной цитопатологической диагностики циркулирующих 5Т4-положительных клеток карциномы и ускорения внедрения клинической диагностики с использованием 5Т4-положительных СТС.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении способ детектирования наличия или отсутствия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, указывает на наличие ранней стадии 5Т4-положительного рака, на состояние отсутствия болезни или на состояние неопределяемого заболевания у млекопитающего.
В другом воплощении наличие или отсутствие циркулирующих опухолевых клеток в образце крови служит контролем лечения во время лечения 5Т4-положительного рака или выздоровления от рака.
В другом воплощении популяция клеток представляет собой смешанную популяцию клеток, подложка представляет собой плоскую подложку, микроструйное устройство или картридж, который несет обогащенную популяцию клеток.
В другом воплощении закрепление тестируемого образца на подложке формирует биологический монослой.
В другом воплощении популяцию клеток анализируют по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы, где указанный анализ проводят с использованием DAPI.
В другом воплощении популяцию клеток анализируют путем определения интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавания циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении первый маркер, второй маркер, третий маркер и четвертый маркер представляют собой флуоресцентные маркеры.
В другом воплощении первый маркер представляет собой цитологический краситель для распознавания циркулирующих опухолевых клеток по морфологии, размеру или ядерно-цитоплазматическому отношению.
В другом воплощении цитологический краситель представляет собой DAPI.
В другом воплощении цитологический краситель представляет собой краситель Райта-Гимзы (Wright-Giemsa).
В другом воплощении второй маркер или третий маркер представляет собой клеточноспецифичный маркер.
В другом воплощении клеточноспецифичный маркер представляет собой цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1 (С-Х-С хемокиновый рецептор 1), CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 (рецептор фактора роста эндотелия сосудов-1), VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) или HuR (человеческий антиген R).
В другом воплощении детектирование наличия первого маркера, наличия второго маркера, наличия третьего маркера или наличия четвертого маркера дополнительно включает анализ популяции клеток путем прикрепления клеток к подложке, сканирование популяции клеток на подложке и визуализацию клеток путем цифровой микроскопии с использованием перемещения.
В другом воплощении детектирование 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из карцином мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, колоректальной карциномы, карцином эндометрия, почки, печени, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и семенника. Предпочтительно, указанный рак выбран из группы, состоящей из колоректальной карциномы, карцином молочной железы, поджелудочной железы и немелкоклеточной карциномы легкого.
В другом воплощении в изобретении предложен способ диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего, который предположительно имеет 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ и количественная оценка популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении в изобретении предложен способ, где указанное количественное определение человеческого антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках применяют для генерирования Η-индекса (H-score), где указанный Η-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком, и где указанные циркулирующие опухолевые клетки охарактеризованы с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4.
В другом воплощении в изобретении предложен способ скрининга конъюгата антитело-лекарственное средство для лечения 5Т4-положительного рака у млекопитающего, который предположительно имеет рак, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство субъекту, предположительно имеющему рак; тестирование образца крови от субъекта до или после лечения лекарственным средством-кандидатом, где образец крови содержит популяцию клеток, предположительно содержащую 5Т4-положительные циркулирующие опухолевые клетки; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство по сравнению с образцом крови после лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство, где изменение в соотношении 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после лечения по сравнению с соотношением 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения может показывать эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство в уменьшении 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток, где указанное соединение-конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой aHTH-5T4-A1-mcMMAF.
В другом воплощении в изобретении предложен способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, где указанный первый маркер представляет собой DAPI; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный второй маркер представляет собой цитокератин; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки, где указанный третий маркер представляет собой CD45; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1а показано сравнение диапазона экспрессии 5Т4, применяемое в расчете Н-индекса.
На Фиг. 1б представлены калибровочные клеточные линии, отображающие пороговые значения, установленные для низкого, среднего и высокого уровня экспрессии 5Т4 при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC).
На Фиг. 2а показана диаграмма разброса данных экспрессии 5Т4 как для единичных СТС, так и для кластеров СТС в образцах от пациентов с NSCLC, проанализированных с помощью оптимизированного 4-цветного диагностического анализа 5Т4.
На Фиг. 2б показаны данные по 17 образцам от пациентов с NSCLC, проанализированных с помощью оптимизированного 5Т4 4-цветного диагностического анализа и Η-индексы, рассчитанные с использованием калибровочных клеточных линий.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, похожие или эквивалентные таковым, описанным здесь, могут быть применены на практике для тестирования настоящего изобретения, предпочтительными материалами и способами являются описанные здесь. В описании и формуле настоящего изобретения будет применяться следующая терминология.
5Т4 относится к онкофетальному антигену 5Т4, 72 кДа сильногликозилированному трансмембранному гликопротеину, содержащему 42 кДа негликозилированный кор (смотрите патент США №5869053). Человеческий 5Т4 экспрессируется при многочисленных типах рака, включая карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, ободочной кишки, эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек, но не ограничиваясь ими. Было показано, что высокоонкогенные клетки, также называемые раковыми стволовыми клетками или клетками, инициирующими опухоль, имеют высокие уровни экспрессии 5Т4 (WO2010/111659). Антитела против 5Т4 включают антитела, которые специфически связываются с человеческим антигеном 5Т4 (смотрите патент США No.8044178).
Термин "биологический монослой" относится к образцу крови, который может находиться на различных стадиях выделения или очистки клеток. Например, биологический монослой может быть частично очищенным и содержать одноядерные и другие клетки, после того как прошел лизис эритроцитов.
Выражение "сортировка популяции клеток перед закреплением образца на подложке" относится к удалению субпопуляции популяции клеток из образца, например образца крови. Сортировка может осуществляться путем избирательного лизиса клеток и центрифугирования субфракции клеток. Также сортировка может осуществляться с использованием флуоресцентного маркера клеток и сортировки клеток с активированной флуоресценцией. Сортировка клеток по клеточным маркерам может осуществляться в форме положительного отбора на циркулирующие опухолевые клетки или в форме отрицательного отбора для удаления неопухолевых клеток.
"Подложка" держит тестируемый образец, например образец крови, содержащий клетки, закрепленные для детектирования и анализа. В одном аспекте подложка может быть плоской. Еще в одном аспекте подложка может иметь некоторую кривизну.
Термины "субъект", "млекопитающее" или "пациент" относятся к любому пациенту-млекопитающему или субъекту, к которому можно применять способы по данному изобретению. "Млекопитающее" относится к пациентам-людям и приматам, не являющимся людьми, а также к экспериментальным животным, таким как кролики, крысы и мыши, и другим животным. В иллюстративном воплощении настоящего изобретения для идентификации субъектов-пациентов, подлежащих лечению в соответствии со способами по данному изобретению, применяют общепринятые способы скрининга для определения факторов риска, ассоциированных с целевым или предполагаемым заболеванием или состоянием, например 5Т4-положительным раком, или для определения статуса существующего заболевания или состояния у субъекта. Эти способы скрининга включают, например, общепринятые обследования для определения факторов риска, которые могут быть ассоциированы с целевым или предполагаемым заболеванием или состоянием. Эти и другие рутинные способы позволяют клиническому специалисту отобрать пациентов, нуждающихся в терапии с применением способов и композиций по данному изобретению.
Термины "образец крови", "препарат крови", "тестируемый образец" и "проба крови" применяют взаимозаменяемо, и они определены как количество крови, взятой или полученной от субъекта, обычно путем венепункции или чрескожного прокалывания вены острым негнущимся тонким зондом или канюлей, несущими гибкий пластиковый катетер, или стальной иглой, соединенной со шприцом или катетером, для применения в медицинских тестах, включая диагностические анализы.
"Рак", "злокачественная опухоль", "солидная опухоль" или "гиперпролиферативное заболевание" применяют как термины-синонимы, и они относятся к любому из ряда заболеваний, которые характеризуются неконтролируемой, патологической пролиферацией 5Т4-положительных клеток, способностью пораженных 5Т4-положительных клеток распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему к другим частям тела (то есть метастазировать), а также любым из ряда характерных структурных и/или молекулярных признаков.
"Первый маркер", "второй маркер", "третий маркер" и "четвертый маркер" распознают циркулирующую опухолевую клетку по цитологическому окрашиванию или по клеточноспецифичному маркеру. Первый маркер представляет собой цитологический краситель, включая DAPI, краситель Райта-Гимзы или другие цитологические красители, известные в данной области техники, но не ограничиваясь ими. Смотри, например, B.F. Atkinson, Atlas of Diagnostic Cytopathology. 2nd Edition, W.B. Saunders Company, Ed., 2003, включенный сюда посредством ссылки во всей своей полноте. Второй и третий маркеры представляют собой клеточноспецифичные маркеры, включая маркеры на цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1, CXCR4, CD44, CD24, изоформы рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3), рецептор эпителиального фактора роста (EGFR) или фактор стабильности иРНК HuR, но не ограничиваясь ими. Четвертый маркер относится к антигену 5Т4.
Эти маркеры распознают различные типы клеток, включая клетки гематопоэтического происхождения, цитокератины на эпителиальных клетках, клетки рака молочной железы, клетки рака предстательной железы, CD44, рецепторы клеточной поверхности, распознающие гиалуроновую кислоту, хемокиновые рецепторы, такие как CXCR1 или CXCR4.
Термин "сортировка" в отношении клеток, как он используется здесь, относится как к механической сортировке клеток, что может быть выполнено с применением, например, клеточного сортера с активацией флуоресценции, так и к анализу клеток на основании экспрессии маркеров клеточной поверхности, например анализа FACS (сортировка клеток с активацией флуоресценции) в отсутствие сортировки.
"Анализ популяции клеток по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы" и "анализ популяции клеток путем оценки интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавания циркулирующих опухолевых клеток" может осуществляться с применением методик и аналитических методов как описано в В.F. Atkinson, там же.
"Контроль терапии рака или выздоровления от рака" относится к диагностическим тестам in vivo или in vitro для определения стадии развития рака или эффективности определенного способа лечения рака.
Термин "циркулирующие опухолевые клетки (СТС)" относится к интактным опухолевым клеткам или кластерам опухолевых клеток, которые являются положительными по пан-цитокератину и отрицательными по CD45. СТС также включают клетки, которые являются положительными по 5Т4 и отрицательными по CD45; клетки, которые являются положительными как по пан-цитокератину, так и по 5Т4, и отрицательными по CD45; и клетки, которые морфологически совместимы со злокачественными клетками. Способы для классификации и детектирования СТС были описаны ранее (WO 2011/028905, WO 2011/050103 и US 2009/0317836, включены сюда посредством ссылки).
"Η-индекс" представляет собой взвешенный показатель, который суммирует процентное содержание СТС внутри каждой категории (низкой, средней и высокой), умноженное на их относительные величины категории, с получением показателя от 0 до 300.
В данной области техники известно несколько способов детектирования циркулирующих опухолевых клеток. Низкий уровень концентрации злокачественных эпителиальных клеток в образцах крови, приблизительно одна на 106-107 всех ядросодержащих клеток, делает их трудными для детектирования. Были попытки выявлять и подсчитывать несколькими методами, включая ПЦР (полимеразная цепная реакция), проточную цитометрию, основанные на визуализации иммунологические подходы, иммуномагнитные методы, микроструйные методы и технологию микрочипов.
Например, в системе AdnaTest Breast Cancer® применяется полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) для детектирования циркулирующих опухолевых клеток (AdnaGen AG, Langenhagen, Germany; OncoVista, Inc., San Antonio, TX). Характерной чертой этого теста является процедура СТС-обогащения, в которой применяется запатентованная смесь иммуномагнитных шариков, покрытых одним из трех антител к антигенам поверхности эпителия. Затем число СТС опосредованно определяют с помощью метода полуколичественной RT-PCR.
CellSearch System™ (Veridex LLC, Warren, NJ) была разработана для целей детектирования СТС в цельной крови. CellSearch system включает метод смешивания образца крови с железными частицами, покрытыми антителом, которое связывается с эпителиальными клетками. Затем эпителиальные клетки отличают от лейкоцитов антителами, которые были помечены флуоресцентным красителем таким образом, чтобы раковые клетки можно было легко отличить и подсчитать.
OncoQuick™ (Greiner Bio-One-, Inc. Longwood, FL) представляет собой другую систему тестирования, которая была разработана для детектирования циркулирующих опухолевых клеток. Эта система представляет собой усиленную систему градиента плотности, которая совмещает центрифугирование в градиенте плотности и методы, основанные на иммунологических.
Способ подсчета числа СТС в пробе от пациента, включающий пропускание указанной пробы через микроструйное устройство, которое избирательно обогащает одной или более чем одной циркулирующей опухолевой клеткой, описан в заявке на патент США №2010/0233693, включенной сюда посредством ссылки. Микроструйное устройство может обогатить одной или более чем одной СТС на основании размера, сродства, способности к деформации или формы.
Способ выделения и анализа СТС с использованием микроканального устройства описан в заявке на патент США №2010/0255479. Этот способ подходит для захвата биологических мишеней из раствора путем предварительного мечения или предварительного смешивания образца, содержащего СТС, с партнером связывания, который специфически связывается с клетками, усиливая захват СТС в микроканальном устройстве.
Каждый из вышеупомянутых способов детектирования циркулирующих опухолевых клеток требует этапа обогащения клетками. Отличительная особенность настоящего изобретения состоит в анализе без обогащения, который демонстрирует способность распознавать значительные количества СТС у большинства пациентов с 5Т4-положительным раком.
Один аспект настоящего изобретения в целом относится к способу детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) у млекопитающего или способу диагностики ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу скрининга соединения-кандидата лекарственного средства у млекопитающего для лечения 5Т4-положительного рака.
Предложен способ для детектирования 5Т4-положительных СТС у млекопитающего, который включает получение от млекопитающего, предположительно имеющего рак, образца крови, содержащего смешанную популяцию клеток, предположительно содержащую СТС, закрепление клеток крови и СТС на подложке для формирования биологического монослоя, детектирование в биологическом монослое первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, детектирование в биологическом монослое второго маркера, который связывается с СТС, детектирование в биологическом монослое третьего маркера, который связывается со смешанной популяцией клеток или субпопуляцией смешанной популяции клеток, детектирование в биологическом монослое четвертого маркера, который избирательно связывается с 5Т4-положительными клетками, анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров для распознавания СТС; наличие СТС в образце крови, указывающее на наличие 5Т4-положительного рака или ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего. Наличие или отсутствие СТС в образце крови может указывать на наличие состояния отсутствия заболевания или состояния неопределяемого заболевания у млекопитающего.
Способ обеспечивает протокол прикрепления клеток для распознавания клеток эпителиального происхождения в образце крови в сочетании со способом детектирования 5Т4-положительных СТС в крови пациентов с раком. В этом протоколе живые белые клетки крови (WBC), например лейкоциты, и другие клетки в крови, отделяют на предметное стекло, например, в виде биологического монослоя. Лейкоциты включают Т-лимфоциты; моноциты, эозинофилы и нейтрофилы, вовлеченные в фагоцитоз; и, базофилы, вовлеченные в воспалительную реакцию, но не ограничиваются ими.
Этот способ дополнительно обеспечивает флуоресцентное мечение прикрепленных WBC и CTC на адгезивные предметные стекла со специальным покрытием. Клетки флуоресцентно метят первым маркером, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, где указанный маркер представляет собой DAPI, вторым маркером, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный второй маркер представляет собой цитокератин (СК), неотъемлемый компонент СТС, с третьим маркером, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки, где указанный третий маркер представляет собой CD45, и четвертым маркером, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4. Затем предметное стекло сканируют на сайты флуоресценции и анализируют с помощью высокопроизводительного вычислительного процесса, который использует алгоритмы, которые оценивают клеточные параметры, определенные при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
Этот способ дополнительно обеспечивает способы, использующие флуоресцентную микроскопию, и протокол прикрепления клеток для исследования распространенности СТС у пациентов с 5Т4-положительным раком. Дополнительное преимущество этого способа предоставляет патоморфологу возможность перемещать и изучать интересующие клетки для патологического подтверждения и характеристики. В настоящем изобретении протокол дополнительно включает удаление покровного стекла и/или растворение водорастворимой закрепляющей среды на каждом флуоресцентно меченом предметном стекле и повторное окрашивание тех же самых клеток с использованием второго клеточного маркера, например стандартного красителя Райта-Гимзы, для обеспечения дополнительных возможностей проникновения в морфологию, размер и гетерогенность СТС. Известные CK+-индивидуальные редкие клетки и кластеры редких клеток, которые были локализованы путем высокопроизводительного вычислительного процесса и протокола прикрепления клеток, могут быть оценены морфологически. Хотя флуоресцентные изображения СТС помогли в подтверждении их распознавания, окрашивание Райта-Гимзы обеспечило дополнительную цитологическую информацию о СТС. В дополнительном аспекте изобретения способ может быть применен для оценки различных клеточных маркеров, которые являются специфическими либо для состояния заболевания, для клеточного типа, либо для состояния клеток.
Способность детектировать и характеризовать СТС потенциально может помочь в диагностике и индивидуализированном лечении пациентов с 5Т4-положительным раком. Вследствие их редкости, для исследования СТС требуются специальные способы. В настоящем изобретении предложен подход биопсии жидкой фазы (fluid phase biopsy), который дает возможность применения стандартных цитопатологических способов для детальной морфологической характеристики СТС в крови, полученной от пациентов с раком, и обеспечивает детали цитологических характеристик спектра СТС без применения обогащения, основанного на белках поверхности. Ядросодержащие клетки, выделенные из цельной крови, помещают на адгезивные предметные стекла, иммунофлуоресцентно метят и анализируют на наличие 5Т4-положительных СТС путем цифровой микроскопии. Сочетание этих методов с методами рутинного окрашивания дает возможность идентификации и оценки СТС с использованием световой микроскопии. Как показано с использованием общепринятых патоморфологических способов для наблюдения за этими клетками, СТС демонстрируют высокую степень плеоморфизма между пациентами (inter-patient) и у одного пациента (intra-patient) в препаратах цельной крови, и распознают интактные СТС как с высоким, так и с низким ядерно-цитоплазматическим отношением наряду с СТС, проявляющими признаки апоптоза. Морфологические наблюдения позволяют предположить, что полный спектр клеток, присутствующих в первичных и метастатических очагах опухоли, также можно наблюдать циркулирующими в крови, а также обеспечивают возможную основу морфологической классификации, в пределах которой можно изучать свойства субпопуляций клеток, вовлеченных в метастазирование.
Автоматизированная цифровая микроскопия. Координаты
предполагаемых клеток загружают в систему визуализации редких событий (rare-event imaging system, REIS), полностью автоматизированную систему сканирующей цифровой микроскопии. Компоненты аппаратного обеспечения REIS и запатентованное сканирующее программное обеспечение были детально описаны в другом источнике (Krivacic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10501-10504, 2004).
Измерения. Детектированные флуоресцентные объекты анализируют с помощью программного отбора для дифференцировки редких клеток от ложно положительных. Поскольку эти клетки обычно мельче, чем разрешение лазерного пятна (20 мкм), первый фильтр пропускает все объекты, которые меньше порога размера (20 мкм). Второй фильтр анализирует соотношение между интенсивностями флуоресценции от различных каналов для элиминации гомогенных агрегатов красителя, обычного артефакта иммунофлуоресцентного окрашивания.
Образец может быть подготовлен в виде биологического монослоя путем раскатки образца биологической жидкости, включая кровь или части крови от субъекта, но не ограничиваясь ими. В одном аспекте образец представляет собой монослой клеток. Жидкий образец обрабатывают флуоресцентным веществом, таким как маркерный краситель, который избирательно связывается с различными типами биологических молекул, которые могут находиться на поверхности или внутри клетки, такими как белки, нуклеиновые кислоты или другие молекулы, но не ограничиваясь им. Подходящие маркеры известны в данной области техники для маркировки нескольких различных типов клеток, представляющих клинический интерес, включая выбранные типы раковых клеток, эмбриональных клеток или других подходящих для рассмотрения клеток. Маркеры для многочисленных других клеток, таких как клетки мозга, клетки печени, а также клетки бактерий, могут быть разработаны среди других. Вещество испускает характерный сигнал, такой как флуоресценция или фосфоресценция, в ответ на выбранное возбуждающее облучение, такое как облучение с выбранной длиной волны или спектром света, рентгеновского облучения, облучение электронным пучком или тому подобное. Характерная люминесценция обычно имеет характерную длину волны или спектральный диапазон длин волн. В то время как окрашивание представляет собой преобладающий способ мечения, существуют другие методы, включая применение маркеров, известных как квантовые точки и зонды нано-частиц ДНК.
В другом аспекте изобретения предложен способ определения расположения редкой клетки, например 5Т4-положительной циркулирующей опухолевой клетки (СТС), внутри биологического монослоя. Смотри, например, заявку США №2004/0131241, включенную сюда посредством ссылки. Предметное стекло, которое несет по меньшей мере одну редкую клетку и имеет визирные метки, расположенные в положениях, которые образуют по существу правильный угол, помещают в держатель предметных стекол первой системы визуализации. Определяют первое координатное пространство системы визуализации, и обозначают координаты визирных меток в первом координатном пространстве. Определяют второе координатное пространство второй системы визуализации, и обозначают координаты визирных меток во втором координатном пространстве. Используя обозначенные координаты визирных меток первого координатного пространства, рассчитывают параметры преобразования координат. После этого обозначают координаты по меньшей мере одного объекта в первом координатном пространстве, и координаты этого объекта в первом координатном пространстве преобразуют в однозначно определяемые координаты во втором координатном пространстве, используя параметры преобразования координат.
Как только редкая клетка или СТС была локализована, покровное стекло может быть удалено с биологического слоя, или водорастворимая закрепляющая среда может быть растворена на каждом флуоресцентно окрашенном предметном стекле. Те же самые клетки могут быть повторно окрашены с использованием второго клеточного маркера, например стандартного окрашивания Райта-Гимзы для обеспечения проникновения в морфологию, размер и гетерогенность СТС. Известные цитокератин-положительные (CK+) единичные редкие клетки и кластеры редких клеток могут быть локализованы и оценены морфологически. Хотя флуоресцентные изображения СТС помогли в подтверждении их идентификации, окрашивание Райта-Гимзы обеспечило дополнительную информацию о СТС.
В дополнительном аспекте этот процесс может быть использован для оценки различных клеточных маркеров, которые являются специфическими или для заболевания, или для болезненного состояния, или для клеточного типа, или для состояния клетки. Способы по настоящему изобретению помогут характеризовать СТС. Они дают возможность высококачественной верификации СТС из крови, полученной от пациентов с 5Т4-положительным раком без обогащения, и обеспечивают возможность проникновения в морфологию и характеристики СТС.
Поиск редких метастатических СТС позволяет предположить, что многие СТС являются апоптотическими и неспособными к формированию метастазов и даже, по приблизительным подсчетам, только 1 диссеминированная раковая клетка из 10000 может образовывать метастазы. Таким образом, детектирование, морфологическая классификация и молекулярная характеристика этих редких клеток может иметь целью новые и направленные способы терапии, демонстрируя клиническую значимость СТС.
Лечение рака
Способ лечения рака представляет собой иммунотерапию, где антитела, специфические к антигену 5Т4, могут быть конъюгированы с подходящим лекарственным средством, таким как цитотоксический или цитостатический агент, иммуносупрессирующий агент, радиоизотоп, токсин или им подобные. Конъюгат антиген-лекарственное средство (ADC) может быть использован для доставки лекарственного средства к 5Т4-положительной опухолевой клетке или раковой клетке у пациента. ADC для лечения 5Т4-положительных раков были описаны в патенте США №8309094, включенном сюда посредством ссылки. Примерами ADC являются 5T4-A1-mcMMAF, 5T4-A1-vcMMAE и 5T4-VC-MMAD, где 5Т4-А1 представляет собой гуманизированное антитело, которое специфически связывается с антигеном 5Т4, и ММАЕ, ММАЕ и MMAD представляют собой производные ауристатина. Было показано, что ауристатины нарушают динамику микротрубочек, деление ядра и клетки и обладают противораковой активностью.
Диагностический анализ
Одно воплощение настоящего изобретения проиллюстрировано на Фиг. 1а, где количественное определение антигена 5Т4 на СТС применяют для генерации "Η-индекса" путем суммирования процентных отношений СТС в пределах каждой категории, умноженных на их относительные величины категории, получая показатель от 0 до 300. Как показано на Фиг. 1б, в системе оценки используют экспрессию 5Т4 как определено путем оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4, описанного в примере 1, с использованием панели клеточных линий NSCLC, выбранных на основании уровней экспрессии 5Т4. Эти уровни были подтверждены с помощью стандартных экспериментов по иммуноцитологическому (ICC) окрашиванию. Эти клеточные линии представляют высокий (клеточные линии MDA-MB-435 и NCI-H226), средний (клеточные линии NCI-H1975 и MDA-MB-361) и низкий (клеточные линии NCI-Н522 и NCI-H2122) уровни экспрессии 5Т4. Средний уровень экспрессии 5Т4 в каждой из этих линий применяли для установки пороговых уровней для высокой, средней и низкой экспрессии 5Т4 в этом анализе.
В другом воплощении настоящего изобретения, проводят скрининг пациентов с раком на наличие СТС, которые экспрессируют антиген 5Т4, с использованием оптимизированного 4-цветного диагностического анализа 5Т4, описанного в примере 1. Этот анализ поможет определить уровень экспрессии антигена 5Т4 на СТС путем пересчета и характеристики СТС, а также определения корреляции между экспрессией мишени 5Т4 в СТС и экспрессии 5Т4 в первичной опухоли. Диаграмма разброса данных экспрессии 5Т4, показанная на Фиг. 2а, представлена как для единичных СТС, так и для кластеров СТС, как откалибровано по контрольным клеточным линиям. Как показано на Фиг. 2б, 17 образцов от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC) были обработаны с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4. Таким образом, 4-цветный анализ 5Т4 по настоящему изобретению применяют для определения категории Η-индекса, что впоследствии используют в расчете Η-индекса. В конечном счете, диагностический анализ, распознающий СТС, экспрессирующие мишень 5Т4, будут применять для распознавания популяции пациентов с раком, поддающихся лечению, и как средство мониторинга СТС у пациентов с раком во время лечения ADC, таким как 5T4-A1-mcMMAF.
Еще один аспект настоящего изобретения состоит в применении Н-индекса как предварительной системы количественных показателей для характеристики 5Т4 на СТС. Как указано выше, Η-индекс представляет собой взвешенный показатель, который суммирует процентные отношения СТС в пределах каждой категории, умноженные на их относительные величины категории с получением показателя от 0 до 300. СТС подразделяют на 4 категории (0-3) на основании индивидуальной экспрессии 5Т4, как показано на Фиг. 1а. Должно присутствовать как минимум по 10 СТС для того, чтобы подсчитать достаточно полезный Н-индекс.
Для пациентов Η-индексы будут подсчитывать двумя способами: (1) Традиционный Η-индекс (THS) - средняя интенсивность 5Т4 каждого события (единичной СТС или кластера СТС) рассчитывают как одну единицу данных; (2) кластер-взвешенный Η-индекс (Cluster-Weighted Η-Score, CWHS) - среднюю 5Т4-интенсивность каждой СТС (единичной или внутри кластера) рассчитывают как одну точку данных.
Пример расчета Η-индекса с использованием величин для категории Н-индекса и % СТС на категорию представляет собой следующее: Н-индекс Категория 0 (1,5% СТС); Н-индекс Категория 1 (15,0% СТС); Н-индекс Категория 2 (68% СТС); Н-индекс Категория 3 (15,5% СТС). Η индекс=(1,5×0)+(15,0×2)+(68,0×2)+(15,5×3)=198.
Затем Н-индекс может быть применен для выбора популяции пациентов, которая будет иметь наиболее высокую вероятность успеха в лечении с помощью ADC, такого как 5T4-A1-mcMMAF или других 5Т4-специфических ADC. На Фиг. 2б показан расчет Η-индекса для 14 из 17 NSCLC пациентов с применением 4-цветного анализа 5Т4 по настоящему изобретению.
В других воплощениях предложены способы лечения рака, включающие идентификацию пациента, у которого есть 5Т4-положительный рак, путем распознавания 5Т4-положительных СТС с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4, определение категории указанного пациента путем определения Η-индекса, и введения пациенту, нуждающемуся в таком введении, эффективного количества ADC, которое специфически связывается с 5Т4-положительным раком. Более того, на протяжении лечения пациентов проверяют через промежутки времени на наличие 5Т4-положительных СТС с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4. Детектирование уменьшенного числа 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после лечения ADC по сравнению с числом 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения ADC может показывать эффективность соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство в лечении 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
В другом воплощении анализ популяции клеток с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток в тестируемых образцах до лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство по сравнению с таковыми после обработки конъюгатом антитело-лекарственное средство, где изменение соотношения 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после обработки по сравнению с соотношением 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения может показывать эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство в отношении уменьшения количества 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
В некоторых воплощениях способ лечения рака включает идентификацию пациента, который имеет 5Т4-положительный рак, путем распознавания 5Т4-положительных СТС с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 и введения указанному пациенту эффективного количества ADC, который специфически связывается с 5Т4-положительным раком, в комбинации с химиотерапевтическим агентом. Химиотерапевтический агент является таким, к лечению которым, как оказалось, рак не является устойчивым. В некоторых воплощениях химиотерапевтический агент является таким, к лечению которым, как оказалось, рак является устойчивым. ADC может быть введен пациенту, который также перенес лечение, такое как хирургическое вмешательство, для лечения рака. В другом воплощении дополнительный способ лечения представляет собой радиотерапию. Более того, в течение лечения через некоторые промежутки времени у пациента контролируют наличие 5Т4-положительных СТС с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4.
Детектируемая метка
Специфическая метка или детектируемая группа, применяемая в анализе, может быть детектируемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Конкретный тип метки не является критическим аспектом данного изобретения при условии, что она существенно не препятствует специфическому связыванию антитела с клеточным маркером на клетке или циркулирующей опухолевой клетке, применяемой в анализе. Детектируемая группа может представлять собой любое вещество, имеющее детектируемое физическое или химическое свойство. Такие детектируемые метки являются хорошо развитыми в области данных анализов или иммунологических анализов и, в целом, в большинстве случаев любую метку, полезную в таких способах, можно использовать в настоящем изобретении. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Полезные метки по настоящему изобретению включают AlexaFlour® флуоресцентные красители (Invitrogen), магнитные шарики (например, Dynabeads.TM.), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцианат, техасский красный, родамин и им подобные), радиоактивные метки, другие агенты визуализации, такие как микропузырьки (для ультразвуковой визуализации), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно применяемые в ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или пластиковые (например полистироловые, полипропиленовые, латексные и им подобные) шарики.
Метки могут быть соединены прямо или опосредованно с желаемым компонентом анализа в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Как указано выше, можно использовать широкое разнообразие меток, при этом выбор метки зависит от требуемой чувствительности, легкости конъюгирования с соединением, требований стабильности, доступной аппаратуры и средств удаления.
Нерадиоактивные метки часто прикрепляют опосредованными способами. Обычно молекула лиганда (например биотин) ковалентно связана с молекулой. Затем лиганд связывается с молекулой анти-лиганда (например, стрептавидина), который либо является детектируемым по своей природе или ковалентно связан с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентным соединением или хемилюминесцентным соединением. Можно применять несколько лигандов и анти-лигандов. Если у лиганда есть природный анти-лиганд, например биотин, тироксин и кортизол, он может быть применен в сочетании с меченым встречающимся в природе анти-лигандом. Альтернативно любое гаптеновое или антигенное соединение можно применять в комбинации с антителом.
Молекулы также могут быть конъюгированы прямо с соединениями, генерирующими сигнал, например, путем конъюгирования с ферментом или флуорофором. Ферменты, представляющие интерес в качестве меток, прежде всего будут гидролазами, в особенности фосфатазами, эстеразами и гликозидазами или оксидоредуктазами, в особенности пероксидазами. Флуоресцентные соединения включают AlexaFlour® флуоресцентные красители (Invitrogen), флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и им подобные. Хемилюминисцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол. Обзор различных систем мечения или сигнал-образующих систем, которые можно использовать, смотри в патенте США №4391904, включенном сюда посредством ссылки.
Средства детектирования меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Так, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, средства для детектирования включают сцинтилляционный счетчик или фотографическую пленку, как в авторадиографии. Если метка представляет собой флуоресцентную метку, она может быть детектирована по возбуждению флуорохрома с соответствующей длинной световой волны и детектированию возникающей в результате флуоресценции. Флуоресценция может быть детектирована визуально, посредством фотографической пленки, путем применения электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (CCD) или фотоумножители и им подобные. Подобным образом, ферментативные метки могут быть детектированы путем обеспечения соответствующих подложков для фермента и детектирования образующегося в результате продукта реакции. Наконец, простые калориметрические метки могут быть детектированы путем простого наблюдения цвета, ассоциированного с меткой.
Другие воплощения и применения будут очевидны специалисту в данной области техники в свете настоящего описания.
Пример 1
Оптимизированный 4-цветный диагностический анализ 5Т4 Оптимизированный 4-канальный анализ был разработан для идентификации 5Т4-положительных СТС.СТС были окрашены четырьмя различными красителями и измерены по четырем отдельным каналам. Например, СТС могут быть окрашены анти-CK-AlexaFluor ®555 (красный); анти-CD45-AlexaFluor 488 ® (зеленый); aHTH-5T4-AlexaFluor 660® (пурпурный); и клеточные ядра окрашивают DAPI в голубой цвет. Поскольку AlexaFlour ® флуоресцентные красители (Invitrogen) доступны во многих цветах, доступны альтернативные окрашивающие комбинации.
Пациенты и получение образцов крови
Образцы получали от пациентов с метастатическим раком в пробирки для крови с антикоагулянтом и обрабатывали в течение 24 часов. Образцы крови также получали от нормальных контролей.
Обработка образцов крови для детектирования СТС
Образцы крови встряхивали в течение 5 минут, перед тем подсчитывали число белых клеток крови (WBC) с использованием системы Hemocue WBC (HemoCue, Sweden). На основании подсчета WBC объем крови подвергали лизису эритроцитов (раствор хлорида аммония). После центрифугирования ядросодержащие клетки ресуспендировали в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и прикрепляли в виде монослоя на стеклянные предметные стекла, выполненные на заказ. Стеклянные предметные стекла имеют такой же размер, как стандартные предметные стекла для микроскопии, но имеют запатентованное покрытие, которое позволяет максимально сохранять живые клетки. Каждое предметное стекло несет приблизительно три миллиона ядросодержащих клеток, таким образом, число клеток, помещенных на предметное стекло, зависит от числа WBC пациента.
Для детектирования СТС у пациентов с раковым заболеванием в данном исследовании в качестве теста использовали четыре предметных стекла. Оставшиеся предметные стекла, изготовленные для каждого пациента, хранили при -80°С для дальнейших экспериментов. Четыре предметных стекла от каждого пациента размораживали, затем клетки фиксировали 2% параформальдегидом, пермеабилизировали холодным метанолом, и сайты неспецифического связывания блокировали сывороткой козы. Затем предметные стекла инкубировали с моноклональными антителами против пан-цитокератина (Sigma) и флуоресцентным красителем CD45-Alexa (Serotec) в течение 40 минут при 37°С. После промывок PBS предметные стекла инкубировали с антителами козы против антител мыши-Alexa Fluorescent dye (Invitrogen) в течение 20 минут при 37°С. Затем, после промывок PBS, предметные стекла инкубировали с анти-5Т4-антитело-А1еха Fluorescent dye в течение 20 минут при 37°С. Клетки подвергали контрастному окрашиванию DAPI в течение 10 минут и закрепляли водной средой для закрепления.
Визуализация и технический анализ
Все четыре предметных стекла от каждого пациента сканировали с применением изготовленного на заказ флуоресцентного сканирующего микроскопа, который был разработан и оптимизирован для быстрого достоверного сканирования. Каждое предметное стекло полностью сканировали при 10-кратном увеличении в четырех цветах, и было получено свыше 6900 изображений. Полученные в результате изображения подвергали алгоритму анализа, который распознает вероятных кандидатов СТС на основании многочисленных параметров, включая интенсивность цитокератина, интенсивность CD45, интенсивность 5Т4, а также форму и размер ядра и цитоплазмы. Затем технический аналитик анализировал выдвинутых алгоритмом вероятных кандидатов и удалял кандидатов, которые с очевидностью не являются клетками, такие как агрегаты красителя. Профессиональный анализ и интерпретация
Все вероятные СТС-кандидаты были представлены гематопатологу для анализа и интерпретации посредством отчета на веб-основе, где гематопатолог включает или исключает каждую клетку-кандидат как СТС. Клетки были классифицированы как СТС, если они были положительны по цитокератину, положительны по 5Т4, отрицательны по CD45, содержали интактное по DAPI ядро без идентифицируемых апоптотических изменений (пузырения, дегенеративных внешних признаков) или нарушенного внешнего вида, и являлись морфологически отличными от окружающих WBC. Клетки должны иметь цитоплазму, которая является явно периферической, и внутри которой содержится цельное ядро. Цитоплазма может демонстрировать апоптотические изменения, такие как пузырение и неравномерная плотность или умеренное разрушение на периферической границе цитоплазмы, но не должна быть настолько разрушена, что ее связь с ядром находится под вопросом. Изображения были представлены в виде цифровых изображений с возможностью рассмотрения индивидуального флуоресцентного канала, также как и составного изображения. Каждое изображение клетки снабжали примечаниями с дополнительными статистическими данными, отражающими относительный размер ядра, интенсивности флуоресценции и сравнительные интенсивности флуоресценции. Каждый СТС-кандидат был представлен в поле зрения с достаточным числом окружающих WBC, чтобы предоставить возможность для контекстуального сравнения между цитоморфологическими признаками рассматриваемой клетки в сравнении с фоновыми WBC.
Окрашивание Райта-Гимзы. Покровные стекла удаляли с флуоресцентно окрашенных предметных стекол и смачивали в PBS. Затем предметное стекло заливали красителем Райта-Гимзы (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) на 3 минуты. Добавляли 1,5 мл фосфатного буфера pH 6,8 (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) к покрытому красителем предметного стеклу, и краситель и буфер смешивали путем осторожного покачивания в течение 1 минуты. Затем смесь оставляли на предметном стекле еще на 2 минуты перед тем, как предметное стекло смачивали деионизованной водой и оставляли сохнуть на воздухе.
Этапы оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 по настоящему изобретению, применяемые в процессе идентификации и характеристики СТС, представляют собой: (1) подготовку предметных стекол; (2) хранение предметных стекол; (3) размораживание и окрашивание предметных стекол; (4) сканирование предметных стекол; (5) алгоритмы прогона; и (6) технический анализ и отчеты.
Анализ СТС был специально разработан с учетом клинического контекста, а также необходимости в своевременных технологических инновациях и будущей автоматизации. Все лабораторные процессы следуют строгим стандартным технологическим процедурам, которые были оптимизированы, протестированы и подтверждены. Сбор данных и идентификация кандидатов были автоматизированы с применением специфического интерфейса, что обеспечивают возможность получения решения патоморфолога и последующего отслеживания этих решений.
Эта система является перспективной для обеспечения возможности нового исследования морфологической классификации молекулярной характеристики СТС, а также применений для скрининга в месте наблюдения за пациентом, мониторинга и ведения пациентов с раковым заболеванием.

Claims (52)

1. Способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера;
детектирование наличия или отсутствия в образце крови экспрессии на клетке второго маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера;
детектирования в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
2. Способ по п. 1, где обнаружение наличия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
3. Способ по п. 1, где обнаружение отсутствия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на отсутствие заболевания или на неизмеряемые проявления заболевания у млекопитающего.
4. Способ по п. 1, где обнаружение наличие или отсутствие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови служит контролем лечения во время лечения 5Т4-положительного рака или выздоровления от рака.
5. Способ по п. 1, где популяция клеток представляет собой смешанную популяцию клеток.
6. Способ по п. 1, где подложка представляет собой плоскую подложку.
7. Способ по п. 1, где подложка представляет собой микроструйное устройство.
8. Способ по п. 1, где закрепление образца крови на подложке приводит к формированию биологического монослоя.
9. Способ по п. 1, где первый маркер, второй маркер, третий маркер или четвертый маркер детектируют с использованием флуоресценции.
10. Способ по п. 1, где первый маркер применяют в анализе популяции клеток по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы.
11. Способ по п. 10, где первый маркер представляет собой DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол).
12. Способ по п. 10, дополнительно включающий анализ популяции клеток путем определения интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавание циркулирующих опухолевых клеток и кластеров циркулирующих опухолевых клеток.
13. Способ по п. 1, где второй маркер или третий маркер представляет собой клеточноспецифичный маркер.
14. Способ по п. 13, где клеточноспецифичный маркер представляет собой цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1 (С-Х-С хемокиновый рецептор 1), CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 (рецептор фактора роста эндотелия сосудов-1), VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) или HuR (человеческий антиген R).
15. Способ по п. 14, где второй маркер представляет собой цитокератин.
16. Способ по п. 14, где третий маркер представляет собой CD45.
17. Способ по п. 1, дополнительно включающий цитологическое окрашивание для распознавания циркулирующей опухолевой клетки по морфологии, размеру или ядерно-цитоплазматическому отношению.
18. Способ по п. 17, где цитологический краситель представляет собой краситель Райта-Гимзы.
19. Способ по п. 1, дополнительно включающий анализ популяции клеток по прикреплению клеток к подложке, сканирование популяции клеток на подложке и визуализацию клеток посредством цифровой микроскопии с использованием перемещения.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий количественную оценку 5Т4-антигена человека на циркулирующих опухолевых клетках для генерирования Н-индекса, где указанный Н-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком.
21. Способ по п. 1, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствие четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
22. Способ по п. 1, где детектирование наличия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
23. Способ по п. 22, где 5Т4-положительный рак выбран из группы, состоящей из карцином мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек.
24. Способ диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке второго маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующей опухолевой клетки.
25. Способ по п. 24, где количественное измерение человеческого антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках используют для генерирования Н-индекса (H-score), который применяют для выбора группы пациентов с 5Т4-положительным раком.
26. Способ по п. 24, где первый маркер представляет собой DAPI, второй маркер представляет собой цитокератин и третий маркер представляет собой CD45.
27. Способ по п. 24, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствия четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
28. Способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование наличия или отсутствия в образце крови ядросодержащих клеток с использованием первого маркера, где первый маркер представляет собой DAPI;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке второго маркера, где второй маркер представляет собой цитокератин;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера, где третий маркер представляет собой CD45;
определение в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
29. Способ по п. 28, где количественную оценку 5Т4-антигена человека на циркулирующих опухолевых клетках используют для генерирования Н-индекса, где указанный Н-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком.
30. Способ по п. 28, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствия четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
31. Способ по п. 28, где анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток используют для определения включения млекопитающих в лечение 5Т4-положительного рака или исключения из него.
RU2014127474A 2012-01-24 2013-01-22 Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего RU2646498C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261590066P 2012-01-24 2012-01-24
US61/590,066 2012-01-24
US201361753665P 2013-01-17 2013-01-17
US61/753,665 2013-01-17
PCT/IB2013/050547 WO2013111054A1 (en) 2012-01-24 2013-01-22 Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014127474A RU2014127474A (ru) 2016-03-20
RU2646498C2 true RU2646498C2 (ru) 2018-03-05

Family

ID=47844410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014127474A RU2646498C2 (ru) 2012-01-24 2013-01-22 Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10254286B2 (ru)
EP (1) EP2807485B1 (ru)
JP (1) JP6254951B2 (ru)
KR (1) KR101716555B1 (ru)
CN (1) CN104094116B (ru)
AU (2) AU2013213301A1 (ru)
BR (1) BR112014018192A8 (ru)
CA (1) CA2861437C (ru)
ES (1) ES2724232T3 (ru)
HK (1) HK1202923A1 (ru)
IL (1) IL233543B (ru)
IN (1) IN2014DN07019A (ru)
MX (1) MX361058B (ru)
RU (1) RU2646498C2 (ru)
WO (1) WO2013111054A1 (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102782498A (zh) 2009-10-21 2012-11-14 斯克里普斯研究所 用非稀有细胞检测稀有细胞的方法
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
EP3090264B1 (en) * 2013-12-30 2020-02-12 The Scripps Research Institute Circulating tumor cell diagnostics for lung cancer
US10527624B2 (en) 2014-01-27 2020-01-07 Epic Sciences, Inc. Circulating tumor cell diagnostics for prostate cancer biomarkers
EA201691682A1 (ru) * 2014-02-21 2017-02-28 Эпик Сайенсиз, Инк. Способы анализирования редких циркулирующих в крови клеток
WO2015155345A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune Limited Antibodies and antibody-drug conjugates
EA201692223A1 (ru) * 2014-05-09 2017-04-28 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Композиции и способы жидкостной биопсии меланомы
CA2959072A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
WO2016172160A1 (en) * 2015-04-21 2016-10-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for prostate cancer analysis
US10371610B2 (en) 2016-02-23 2019-08-06 Noul Co., Ltd. Contact-type patch, staining method using the same, and manufacturing method thereof
KR102406596B1 (ko) * 2016-02-23 2022-06-10 노을 주식회사 패치를 이용하는 ctc 진단 방법 및 장치
KR20170099737A (ko) 2016-02-23 2017-09-01 노을 주식회사 접촉식 염색 패치 및 이를 이용하는 염색 방법
KR102045068B1 (ko) * 2016-02-23 2019-11-15 노을 주식회사 중합 효소 연쇄 반응 패치, 이를 이용하는 진단 방법 및 장치
EP3606963B1 (en) 2017-04-03 2023-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to steap-1
CN111033238A (zh) * 2017-06-27 2020-04-17 定量癌症诊断有限责任公司 定量的液体活检诊断系统与方法
CN107918013A (zh) * 2017-09-25 2018-04-17 浙江天科高新技术发展有限公司 化学发光酶免测定循环肿瘤细胞中K‑Ras蛋白的方法及试剂盒
JP2019195304A (ja) 2018-05-10 2019-11-14 学校法人順天堂 画像解析方法、装置、コンピュータプログラム、及び深層学習アルゴリズムの生成方法
US20220002429A1 (en) * 2018-10-24 2022-01-06 Northwestern University Tumor cell aggregation inhibitors' for treating cancer
JP7381003B2 (ja) * 2019-04-26 2023-11-15 学校法人順天堂 疾患解析を支援する方法、装置、及びコンピュータプログラム、並びにコンピュータアルゴリズムを訓練する方法、装置、及びプログラム
US20230175073A1 (en) 2021-12-07 2023-06-08 Epic Sciences, Inc. Enhanced characterization of breast cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007089911A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 The Scripps Research Institute Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject
WO2010070276A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-24 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
EP0403559A1 (en) 1988-03-04 1990-12-27 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
US5869053A (en) 1988-03-04 1999-02-09 Cancer Research Campaign Technology, Ltd. 5T4 antigen from human trophoblasts
AU747602B2 (en) 1997-06-04 2002-05-16 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector
EP1242456B1 (en) 1999-11-18 2008-10-15 Oxford Biomedica (UK) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules
GB0126378D0 (en) 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
US7305112B2 (en) 2002-10-15 2007-12-04 The Scripps Research Institute Method of converting rare cell scanner image coordinates to microscope coordinates using reticle marks on a sample media
SV2007002227A (es) * 2004-09-10 2007-03-20 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/calicheamicina ref. 040000-0317637
NZ571208A (en) 2006-03-10 2011-12-22 Wyeth Corp Anti-5T4 antibodies and uses thereof
WO2008131048A2 (en) 2007-04-16 2008-10-30 Cellpoint Diagnotics, Inc. Devices and methods for diagnosing, prognosing, or theranosing a condition by enriching rare cells
EP2411808B1 (en) 2009-03-24 2015-11-11 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
WO2010111659A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Wyeth Llc Tumor-initiating cells and methods for using same
CN102482703A (zh) 2009-09-03 2012-05-30 斯克里普斯研究所 对循环肿瘤细胞进行分类的方法
CN102782498A (zh) 2009-10-21 2012-11-14 斯克里普斯研究所 用非稀有细胞检测稀有细胞的方法
JP2013526852A (ja) * 2010-04-06 2013-06-27 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス 疾患に対する循環バイオマーカー
BR112013000433A2 (pt) * 2010-07-07 2016-05-17 Univ Michigan diagnóstico e tratamento de câncer de mama
KR101529810B1 (ko) 2011-04-01 2015-06-26 와이어쓰 엘엘씨 항체-약물 접합체

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007089911A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 The Scripps Research Institute Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject
WO2010070276A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-24 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MYERS K.A. et al. Metastasis-associated 5T4 antigen disrupts cell-cell contacts and induces cellular motility in epithelial cells// International Journal of Cancer Volume 68, Issue 1, pages 84-92, 27 September 1996 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найдено в Интернет: 3.0.CO;2-6/epdf"http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0215(19960927)68:1<84::AID-IJC15>3.0.CO;2-6/epdf. *
ZHAO Y et al. 5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors// Cell Mol Immunol. 2007 Apr;4(2):99-104 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найденов Интернет: http://www.cm.ustc.edu.cn/4/2/99.pdf . *
ZHAO Y et al. 5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors// Cell Mol Immunol. 2007 Apr;4(2):99-104 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найденов Интернет: http://www.cm.ustc.edu.cn/4/2/99.pdf . MYERS K.A. et al. Metastasis-associated 5T4 antigen disrupts cell-cell contacts and induces cellular motility in epithelial cells// International Journal of Cancer Volume 68, Issue 1, pages 84-92, 27 September 1996 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найдено в Интернет: 3.0.CO;2-6/epdf"http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0215(19960927)68:1<84::AID-IJC15>3.0.CO;2-6/epdf. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014127474A (ru) 2016-03-20
AU2013213301A1 (en) 2014-07-17
MX2014008928A (es) 2014-10-24
CA2861437A1 (en) 2013-08-01
CN104094116B (zh) 2017-05-31
EP2807485B1 (en) 2019-03-13
JP6254951B2 (ja) 2017-12-27
US10254286B2 (en) 2019-04-09
CN104094116A (zh) 2014-10-08
HK1202923A1 (en) 2015-10-09
MX361058B (es) 2018-11-23
WO2013111054A1 (en) 2013-08-01
ES2724232T3 (es) 2019-09-09
CA2861437C (en) 2018-08-21
KR101716555B1 (ko) 2017-03-14
BR112014018192A8 (pt) 2021-03-02
JP2015507190A (ja) 2015-03-05
KR20140100580A (ko) 2014-08-14
IL233543B (en) 2018-02-28
US20150017661A1 (en) 2015-01-15
EP2807485A1 (en) 2014-12-03
AU2018220154A1 (en) 2018-09-13
IL233543A0 (en) 2014-08-31
IN2014DN07019A (ru) 2015-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2646498C2 (ru) Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего
Lustberg et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients
JP2018185316A (ja) 循環腫瘍細胞の検出方法および哺乳類対象における癌の診断方法
US6960449B2 (en) Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use
KR101604649B1 (ko) 혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화
CN101036055B (zh) 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗
US8088715B2 (en) Detection of circulating tumor cells in peripheral blood with an automated scanning fluorescence microscope
KR20170094523A (ko) 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법
US20080113350A1 (en) Blood test to monitor the genetic changes of progressive cancer using immunomagnetic enrichment and fluorescence in situ hybridization (FISH)
US20050250155A1 (en) Multiple marker characterization of single cells
MX2014006884A (es) Aparato, sistema y metodo para identificar celulas tumorales circulantes.
WO1999044064A1 (en) Method and compositions for differential detection of primary tumor cells and metastatic cells
US20170192003A1 (en) Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma
JP6936231B2 (ja) 転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）患者における治療選択のためのバイオマーカーとしてのアンドロゲン受容体バリアント７
KR20240033068A (ko) 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(caml)의 변화를 이용한 암 치료 반응의 예측 및/또는 모니터링 방법
WO2010047682A1 (en) Monitoring serial changs in circulating breast cancer cells in mice
EP3140656B1 (en) Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma
TW202127033A (zh) 癌幹細胞之生物標誌
CN1502044A (zh) 癌症诊断方法