CN104094116A - 在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法 - Google Patents

在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法 Download PDF

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Abstract

提供了检测哺乳动物个体中5T4阳性循环肿瘤细胞的方法。提供了诊断哺乳动物个体中5T4阳性癌症的方法。检测或诊断方法表明存在5T4阳性转移性癌症或早期5T4阳性癌症。

Description

在哺乳动物个体中检测5T4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5T4阳性癌症的方法
技术领域
本发明大体上涉及检测哺乳动物个体的5T4阳性循环肿瘤细胞的方法，以及诊断哺乳动物个体的5T4阳性癌症的方法。
背景技术
人5T4抗原在许多癌症类型中表达，并且基本上不存在于正常组织中。近来，已经研发了特异性结合5T4抗原的高亲和性单克隆抗体，并且已经将细胞毒性药物与5T4抗体缀合，来形成用于治疗5T4阳性癌症的抗体药物缀合物(美国专利8,044,178和8,309,094)。随后评估5T4的表达可能是鉴定患有5T4阳性癌症患者的有用方法。一种方法是检测癌症患者循环肿瘤细胞(CTC)上的5T4抗原。
已经在患有上皮源性癌症患者的外周血中观察到超低浓度的循环肿瘤细胞(Kraeft et al.,Clin Cancer Res10:3020-3028,2004)。取样时，这些细胞的数量显示与多组患有渐进性疾病的转移性乳腺癌患者的结果有关(Cristofanilli et al.,N Engl J Med351:781-791,2004)。为此，为了研究这些细胞如何通过血流自动到达遥远的部位并形成转移性疾病，这些细胞的表征具有重要的生物医学意义。因此，鉴定与5T4阳性癌症相关的CTC可能为患者鉴定提供有价值的诊断工具。
目前，主要通过免疫细胞化学标记如EpCam和利用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行核染色，来检测和分析CTC，DAPI是强烈结合DNA的富A-T区的荧光染料。尽管这些方法已经成功地用于计算和区分CTC，但是它们不同于标准的细胞病理学方法，因为它们忽略了诊断病理学所依赖的与标准形态染色的相关性。这给将CTC与通过常规诊断方法获得的其他位点的肿瘤细胞进行比较造成了困难。尽管检测CTC的能力可能有助于癌症的诊断和个体化治疗以及提高治疗效率，但是通过包括标准细胞病理学方法，可能提高对CTC生物学的理解。本领域需要利用详细的高分辨率CTC成像和常规诊断病理学染色方法和明视野显微镜，以使得下列临床应用成为可能：对循环5T4阳性癌细胞进行标准细胞病理学诊断以及促成临床上采用利用5T4阳性CTC进行的诊断。
发明概述
在一实施方案中，本发明提供检测疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体的5T4阳性循环肿瘤细胞的方法，其包括：测试所述个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；将所述血液样品置于基质上；检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；检测所述血液样品中是否存在结合循环肿瘤细胞的第二标记；检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或细胞群子集的第三标记；检测所述血液样品中是否存在选择性结合循环肿瘤细胞的第四标记，所述第四标记是人5T4抗原；以及分析通过第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征循环肿瘤细胞。
在另一实施方案中，检测疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体是否存在5T4阳性循环肿瘤细胞的方法表明，哺乳动物个体存在早期5T4阳性癌症、处于无疾病状态或处于非可度量的疾病状态。
在另一实施方案中，血液样品中循环肿瘤细胞存在与否指示5T4阳性癌症治疗或癌症恢复过程中的治疗管理。
在另一实施方案中，所述细胞群是混合细胞群，所述基质是容纳富集的细胞群的平面基质、微流体装置或盒(cartrige)。
在另一实施方案中，将测试样品置于基质上形成生物单细胞层。
在另一实施方案中，通过细胞核详情、细胞核轮廓、核仁存在与否、细胞质的特质或细胞质的量分析细胞群，其中所述分析使用DAPI。
在另一实施方案中，通过测量具有高核质比的完整细胞、具有低核质比的完整细胞、早期凋亡细胞或晚期凋亡细胞，以及鉴定循环肿瘤细胞，分析细胞群。
在另一实施方案中，所述第一标记、第二标记、第三标记以及第四标记是荧光标记。
在另一实施方案中，所述第一标记是细胞染料，以通过形态、大小或核质比鉴定循环肿瘤细胞。
在另一实施方案中，所述细胞染料是DAPI。
在另一实施方案中，所述细胞染料是瑞氏姬姆萨染料(Wright-Giemsastain)。
在另一实施方案中，所述第二标记或所述第三标记是细胞特异性标记。
在另一实施方案中，所述细胞特异性标记是细胞角蛋白、CD45、M30、趋化因子受体、CXCR1、CXCR4、CD44、CD24、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、EGFR或HuR。
在另一实施方案中，检测第一标记的存在、第二标记的存在、第三标记的存在或第四标记的存在还包括，通过细胞对基质的附着分析细胞群、扫描基质上的细胞群和利用重定位通过数字显微镜对细胞成像。
在另一实施方案中，在血液样品中检测到5T4阳性循环肿瘤细胞表明存在5T4阳性癌症，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌以及睾丸癌。优选地，所述癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及非小细胞肺癌。
在另一实施方案中，本发明提供诊断疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体的5T4阳性癌症的方法，其包括：测试所述个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；将所述血液样品置于基质上；检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；检测所述血液样品中是否存在结合循环肿瘤细胞的第二标记；检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或细胞群子集的第三标记；检测所述血液样品中是否存在选择性结合循环肿瘤细胞的第四标记，其中所述第四标记是人5T4抗原；以及分析和定量通过第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征循环肿瘤细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种方法，其中所述定量循环肿瘤细胞上的人5T4抗原用来产生H得分，其中所述H得分用于选择5T4阳性癌症患者群，以及其中，利用优化的5T44色分析，表征所述循环肿瘤细胞。
在另一实施方案中，本发明提供筛选用于治疗疑似患有癌症的哺乳动物个体的5T4阳性癌症的抗体药物缀合物的方法，包括：给疑似患有癌症的个体施用治疗有效量的抗体药物缀合物；在用药物侯选物治疗前后，测试所述个体的血液样品，其中所述血液样品包含疑似含有5T4阳性循环肿瘤细胞的细胞群；将所述血液样品置于基质上；检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；检测所述血液样品中是否存在结合循环肿瘤细胞的第二标记；检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或细胞群子集的第三标记；检测所述血液样品中是否存在选择性结合循环肿瘤细胞的第四标记，其中所述第四标记是人5T4抗原；以及分析通过第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定，用所述抗体药物缀合物治疗前与用抗体药物缀合物治疗后相比，血液样品中的循环肿瘤细胞，其中与治疗前血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞之比相比，治疗后血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞之比的变化可以指示抗体药物缀合物在减少5T4阳性循环肿瘤细胞方面的功效，其中抗体药物缀合物化合物是抗5T4-A1-mcMMAF。
在另一实施方案中，本发明提供检测疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体的5T4阳性循环肿瘤细胞的方法包括：测试所述个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；将所述血液样品置于基质上；检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记，其中所述第一标记是DAPI；检测所述血液样品中是否存在结合循环肿瘤细胞的第二标记，其中所述第二标记是细胞角蛋白；检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或细胞群子集的第三标记，所述第三标记是CD45；检测所述血液样品中是否存在选择性结合循环肿瘤细胞的第四标记，所述第四标记是人5T4抗原；以及分析通过第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征循环肿瘤细胞。
附图说明
图1a比较计算H得分所用的5T4表达范围。
图1b提供校正细胞系，其描绘了为非小细胞肺癌(NSCLC)中5T4的低、中、高表达所建立的阈值。
图2a显示了用优化的5T44-颜色诊断测定所分析的、来自NSCLC患者样品的单一CTC和CTC簇的5T4表达散布图。
图2b显示了用优化的5T44-颜色诊断分析所分析的来自17个NSCLC患者样品的数据以及利用校正细胞系计算的H得分。
发明详述
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所理解的具有相同的含义。尽管在实施本发明的测试中，可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和请求保护本发明的过程中，会使用下列术语。
5T4指5T4癌胚抗原，包含42 kDa非糖基化核心的72 kDa高度糖基化跨膜糖蛋白(参见US Pat.No.5,869,053)。人5T4表达于许多癌症类型，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌以及睾丸癌。显示高致瘤细胞，也称为癌干细胞或肿瘤起始细胞，具有高水平5T4表达(WO2010/111659)。抗5T4抗体包括特异性结合人5T4抗原的抗体(参见US Pat.No.8,044,178)。
“生物单细胞层”指可以以各种细胞分离或纯化状态存在的血液样品。例如，所述生物单细胞层可以是部分纯化的，并且在红细胞溶解后含有单个核细胞和其他细胞。
“在将样品置于基质前分选细胞群”指从样品例如血液样品中除去细胞群子集。分选可以利用选择性细胞溶解和离心细胞的亚组分(subfraction)进行。分选也可以利用荧光细胞标记和荧光激活细胞分选术进行。针对细胞标记的细胞分选可以作为循环肿瘤细胞的阳性选择或作为除去非肿瘤细胞的阴性选择来进行。
“基质”容纳测试样品，例如为了检测和分析而放置的含有细胞的血液样品。在一方面，基质可以是平面的。在另一方面，基质可以具有一些曲率。
“个体”、“哺乳动物个体”或“患者”指本发明的方法适用的任何哺乳动物患者或个体。“哺乳动物(Mammal)”或“哺乳动物(mammalian)”指人患者和非人灵长动物，以及实验动物，如兔、大鼠以及小鼠，和其他动物。在本发明的示例性实施方案中，为鉴定本发明方法治疗的个体患者，采用可以接受的筛选方法来确定与靶向或疑似疾病或病症(例如，5T4阳性癌症)相关的风险因素，或确定个体的现有疾病或病症的状态。这些筛选方法包括，例如，确定可以与靶向或疑似疾病或病症相关的风险因素的常规病情检查。这些方法和其他常规方法使临床医师可以选择需要利用本发明的方法和处方治疗的患者。
“血液样品(blood sample)”、“血液标本(blood specimen)”、“受试样品(test sample)”以及“血液样品(sample of blood)”交换使用，并且定义为通常通过以下方式从个体取出或采集的一定量的血液：利用医学测试包括诊断分析所用的带有弹性塑料导管的锐利的刚性探针或插管或连接于注射器或导管的钢针进行静脉穿刺或静脉经皮穿刺。
“癌症”、“恶性肿瘤”、“实体瘤”或“高增生病症”作为同义词使用并且指许多特征为不受控的异常的5T4阳性细胞增殖、受影响的5T4阳性细胞局部扩散或通过血流、淋巴系统扩散到身体的其他部分(即转移)的能力的疾病中的任何疾病，以及许多特征结构和/或分子特征中的任意一种。
“第一标记”、“第二标记”、“第三标记”以及“第四标记”通过细胞染料或通过细胞特异性标记鉴定循环肿瘤细胞。所述第一标记是细胞染料，包括但不限于DAPI、瑞氏姬姆萨染料或本领域已知的其他细胞染料。参见，例如，B.F.Atkinson,Atlas of Diagnostic Cytopathology.2ndEdition,W.B.Saunders Company,Ed.,2003，其通过引用整体并入本文。第二标记和第三标记是细胞特异性标记，包括但不限于以下的针对以下分子的标记：细胞角蛋白、CD45、M30、趋化因子受体、CXCR1、CXCR4、CD44、CD24、血管内皮生长因子同种型(VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3)、上皮生长因子受体(EGFR)或mRNA稳定性因子HuR。第四标记指5T4抗原。
这些标记鉴定各种细胞类型，包括造血起源的细胞、上皮细胞上的细胞角蛋白、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、CD44、识别透明质酸的细胞表面受体，趋化因子受体如CXCR1或CXCR4。
本文所用的细胞背景下的“分选”指可以利用例如荧光激活细胞分选仪完成的细胞物理分选以及基于细胞表面标记表达的细胞分析，例如不进行分选的FACS分析。
“通过细胞核详情、细胞核轮廓、核仁存在与否、细胞质的质量或细胞质的量分析细胞群”和“通过测量具有高核质比的完整细胞、具有低核质比的完整细胞、早期凋亡细胞或晚期凋亡细胞分析细胞群并鉴别循环肿瘤细胞”，可以利用B.F.Atkinson的文章中所述的技术和分析方法进行。
“癌症治疗或癌症恢复的管理”指确定癌症进展阶段或特定癌症疗法功效的体内或体外诊断测试。
“循环肿瘤细胞(CTC)”指是广谱细胞角蛋白(pan cytokeratin)阳性且CD45阴性的完整肿瘤细胞或肿瘤细胞簇。CTC还包括5T4阳性但是CD45阴性的细胞、广谱细胞角蛋白和5T4阳性且CD45阴性的细胞以及形态上与恶性细胞一致的细胞。对CTC进行分类和检测的方法以前已有报道(WO2011/028905、WO2011/050103以及US2009/0317836，通过引用并入本文)。
“H得分”是加权得分，其将每一类别(低、中、高)内CTC的百分比乘以它们各自的类别值，然后求和，从而得到0-300的得分。
本领域已知几种检测循环肿瘤细胞的方法。恶性上皮细胞在血液样品中的浓度低，总计106-107个有核细胞中约一个恶性上皮细胞，这使得它们难以检测。已经尝试用几种方法检测并计算CTC，这些方法包括PCR、流式细胞术、基于图像的免疫学方法、免疫磁技术、微流体技术以及微芯片技术。
例如，AdnaTest Breast系统利用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测循环肿瘤细胞(AdnaGen AG,Langenhagen,Germany；OncoVista,Inc.,San Antonio,TX)。该测试以CTC富集方法为特征，该方法利用了专有的涂覆了上皮表面抗原的三种抗体中的一种的免疫磁珠的混合物。然后通过半定量RT-PCR方法间接确定CTC的数量。
CellSearch SystemTM(Veridex LLC,Warren,NJ)是为了检测全血中的CTC而研发的。CellSearch系统涉及将血液样品与铁颗粒混合的技术，所述铁颗粒涂覆了附着于上皮细胞的蛋白。然后通过已经被荧光染料标记的抗体区分上皮细胞与白细胞，从而可以容易地区分并计数癌细胞。
OncoQuickTM(Greiner Bio-One-,Inc.Longwood,FL)是研发用来检测循环肿瘤细胞的另一测试系统。该系统是联合了密度梯度离心和基于免疫的技术的增强型密度梯度系统。
在美国专利申请第2010/0233693A(通过引用并入本文)中描述了计算来自患者的样品中CTC数量的方法，其包括使所述样品流过选择性富集一种或多种循环肿瘤细胞的微流体装置循环肿瘤细胞。微流体装置可以基于大小、亲和性、可变形性或形状富集一种或多种CTC。
在美国专利申请第2010/0255479中描述了利用微通道装置分离和分析CTC的方法。该方法通过用特异性结合细胞的结合伴侣预标记或预混合含有CTC的样品来为从溶液中捕获生物靶作准备，从而增强微通道装置中CTC的捕获。
每一种上述检测循环肿瘤细胞的方法都需要细胞富集步骤。本发明的区别特征是无富集测定，该测定展示了鉴定大多数患有5T4阳性癌症的患者的大量CTC的能力。
本发明一方面大体上涉及检测哺乳动物个体中5T4阳性循环肿瘤细胞(CTC)的方法或诊断哺乳动物个体中早期5T4阳性癌症的方法。本发明还涉及筛选用于治疗哺乳动物个体中5T4阳性癌症的药物候选化合物的方法。
提供了检测哺乳动物个体中5T4阳性CTC的方法，其包括从疑似患有癌症的哺乳动物个体获得包含疑似含有CTC的混合细胞群的血液样品，将血细胞和CTC置于基质上以形成生物单细胞层，检测生物单细胞层中选择性结合有核细胞的第一标记，检测生物单细胞层中结合CTC的第二标记，检测生物单细胞层中结合混合细胞群或所述混合细胞群的子集的第三标记，检测生物单细胞层中选择性结合5T4阳性细胞的第四标记，分析所述第一、第二、第三以及第四标记所检测的细胞群，以鉴定CTC；血液样品中CTC的存在表示，哺乳动物个体中存在5T4阳性癌症或早期5T4阳性癌症。血液样品中CTC的存在与否能够表明哺乳动物个体中存在无疾病状态或非可度量的疾病状态。
所述方法提供细胞附着方案(cell attachment protocol)以鉴定血液样品中上皮来源的细胞，连同检测癌症患者血液中5T4阳性CTC的方法。在这种方案中，在载玻片上分离血液中活的白细胞(WBC)如白细胞(leukocyte)和其他细胞，例如，作为生物单细胞层。白细胞包括但不限于：参与吞噬作用的T-淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜中性粒细胞；和参与炎性反应的嗜碱性粒细胞。
所述方法还提供在特别涂覆的粘附载玻片上的荧光标记的附着的WBC和CTC。用选择性结合有核细胞的第一标记，结合循环肿瘤细胞的第二标记，结合确定为不是所述肿瘤细胞的细胞群或所述细胞群的子集的第三标记，以及选择性结合循环肿瘤细胞的第四标记，对细胞进行荧光标记，其中所述第一标记是DAPI，所述第二标记是细胞角蛋白(CK)，即CTC的关键组分，所述第三标记是CD45，且第四标记是人5T4抗原。然后扫描载玻片的荧光位点，并通过利用算法的高性能计算进行分析，所述算法对第一、第二、第三以及第四标记所检测的细胞参数加权，以鉴定和表征循环肿瘤细胞。
所述方法还提供利用荧光显微镜和细胞附着方案研究5T4阳性癌症患者中CTC的流行性的方法。所述方法的另一优点使得病理学家能重新定位和检查用于病理学确认和表征的感兴趣细胞。在本发明中，所述方案还包括除去盖玻片和/或溶解每一荧光染色的载玻片上的水溶性封片剂(mounting media)，并利用的第二细胞标记如标准瑞氏姬姆萨染料再染色相同的细胞，以提供对CTC形态、大小以及异质性的另外深入了解。可以从形态上评估用高性能计算和细胞附着方案所定位的已知的CK+单独的稀有细胞和稀有细胞簇。尽管CTC荧光图像有助于其经证实的鉴定，但是瑞氏姬姆萨染料提供了有关CTC的额外的细胞学信息。在本发明的另一方面，所述方法可以用于评估特异于疾病状态、细胞类型或细胞状态的不同细胞标记。
检测和表征CTC的能力潜在地助于5T4阳性癌症患者的诊断治疗和个体化治疗。由于它们的稀有性，因此需要专门的方法来研究CTC。本发明提供流体相活检方法，所述方法使得用于从癌症患者获得的血液中的CTC进行详细的形态学表征的标准细胞病理学方法的使用成为可能并提供一系列CTC的细胞学特征的详情，而无需使用基于表面蛋白的富集。将从全血回收的有核细胞置于粘附载玻片上，进行免疫荧光标记，并通过数字显微镜分析5T4阳性CTC。将这些技术与常规染色方法结合，使利用光学镜检鉴定和评估CTC成为可能。利用常规病理学方法观察细胞，CTC在全血制剂中表现出高程度的患者间和患者内多型性，并且用高核质比和低核质比鉴定完整CTC和表现出凋亡标志的CTC。形态观察结果提示，也可以看到存在于原发性肿瘤位点和转移性肿瘤位点中的全系列(fullspectrum)细胞在血液中循环，而且进一步提供可能的研究与转移有关的细胞子集性质的形态分类框架。
自动数字显微镜
将预期的细胞的坐标输入罕见事件成像系统(rare-event imaging system,REIS)，一种全自动扫描数码显微镜系统。REIS的硬件组件和专有的扫描软件详细描述于其他文献(Krivacic et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:10501-10504,2004)。
测量
用软件过滤操作分析检测到的荧光目标，来区分稀有细胞与假阳性细胞。因为细胞通常小于激光点分辨率(20μm)，因此第一滤器通过阈值大小(20μm)以下的所有目标。第二滤器分析不同通道的荧光强度之间的比值，以消除均匀的染料聚集物，其是免疫荧光染色的常见人造物品。
通过吸引生物流体样品，可以将所述样品制备为生物单细胞层，所述生物流体样品包括但不限于来自个体的血液或血液的一部分。在一方面，所述样品是细胞单层。用选择性结合可以位于细胞表面或细胞内的不同类型的生物分子(如蛋白、核酸或其他分子)的荧光材料，例如但不限于标记染料，处理流体样品。本领域已知用于标记许多临床感兴趣的不同细胞类型的合适标记，所述细胞类型包括所选的癌症细胞类型、胎儿细胞或要考虑的其他合适细胞。尤其是可以研发许多其他细胞，如脑细胞、肝细胞以及细菌细胞的标记。响应所选的激发照射，例如通过选定的波长或光谱照射、X射线照射、电子实现的照射(electron-becompleted this.am irradiation)等，所述材料发出特征性输出，如荧光或磷光。特征性冷光通常具有特征性波长或波长光谱范围。尽管染料是主要的标记方法，但是也存在其他技术，包括使用称为量子点的标记和DNA纳米颗粒探针。
在本发明的另一方面，提供获得生物单细胞层中稀有细胞如5T4阳性循环肿瘤细胞(CTC)位置的方法。参见，例如，美国专利申请第2004/0131241号，通过引用将其并入本文。携带至少一个稀有细胞且具有十字测标的载玻片位于第一成像系统的载玻片放置架上，所述十字测标排列于大体上形成直角的位置。限定成像系统的第一坐标空间，并且指定第一坐标空间中十字测标的坐标。限定第二成像系统的第二坐标空间，并且指定第二坐标空间中十字测标的坐标。利用第一坐标空间十字测标指定的坐标，计算坐标变换参数。之后，指定第一坐标空间中至少一个目标的坐标，并且利用坐标转换参数，将所述目标的第一坐标空间坐标转换成第二坐标空间中的唯一坐标。
一旦定位了稀有细胞或CTC，可以除去生物单细胞层的盖玻片，或者溶解每一荧光染色载玻片上的水溶性封片剂。可以利用第二细胞标记，如标准瑞氏姬姆萨染料再染色相同的细胞，从而深刻了解CTC形态、大小以及异质性。可以定位已知的细胞角蛋白阳性(CK+)的单独的稀有细胞和稀有细胞簇，并从形态上对其进行评估。尽管CTC的荧光图像有助于其经证实的鉴定，但是瑞氏姬姆萨染料提供了有关CTC的其他信息。
在另一方面，该方法用于评估疾病、疾病状态、细胞类型或细胞状态特有的不同细胞标记。本发明的方法会有助于CTC的表征。其能在不需要富集的情况下，高质量地证实从5T4阳性癌症患者获得的血液的CTC，并深刻了解CTC的形态和特征。
稀有的转移性CTC的研究提示，许多CTC是凋亡的，并且不能形成转移，并且估计实际上在10,000个播散性癌细胞中仅一个播散性癌细胞能建立转移。因此，这些稀有细胞的检测、形态分类以及分子表征，可能靶向新的且直接的疗法，从而证明CTC的临床意义。
癌症治疗
癌症治疗方法是免疫疗法，其中可以将5T4抗原特异性抗体缀合于合适的药物，如细胞毒性试剂或或细胞抑制剂、免疫抑制剂、放射性同位素、毒素等。可以使用抗体药物缀合物(ADC)将药物送递到患者的5T4阳性肿瘤细胞或癌细胞。用于治疗5T4阳性癌症的ADC在美国专利号8,309,094中已经公开，该专利通过引用并入本文。ADCS的实例是5T4-A1-mcMMAF、5T4-A1-vcMMAE以及5T4-vc-MMAD，其中5T4-A1是特异性结合5T4抗原的人源化抗体，MMAE、MMAE以及MMAD是Auristatin衍生物。已显示Auristatin干扰微管动力学以及核分裂和细胞分裂，并具有抗癌活性。
诊断分析
图1a图示本发明的一种实施方案，其中CTC上5T4抗原的定量用于产生“H得分”，其通过将每一类别内CTC的百分比乘以它们的各自类别值然后求和，得到0-300的得分。如图1b所示，评分系统利用优化的5T44色分析所测定的5T4表达，5T44色分析描述于实施例1中，使用一组基于5T4表达水平而选择的NSCLC细胞系。这些水平通过标准免疫细胞(ICC)染色实验来证实。这些细胞系代表5T4的高(MDA-MB-435和NCI-H226细胞系)、中(NCI-H1975和MDA-MB-361细胞系)以及低(NCI-H522和NCI-H2122细胞系)表达水平。这些细胞系中的每一细胞系中，5T4的平均表达水平用来建立该分析中5T4高、中以及低表达的阈值。
在本发明的另一实施方案中，利用实施例1所述的优化的5T44色诊断分析，筛选癌症患者以获得存在表达5T4抗原的CTC。通过计算和表征CTC，以及确定CTC 5T4靶的表达与原发性肿瘤中5T4表达之间的关联，该分析有助于确定CTC上5T4抗原的表达水平。图2a所述的5T4表达散布图是针对用对照细胞系校准的单一CTC和CTC簇。如2b所示，用优化的5T44色分析，处理17个非小细胞肺癌(NSCLC)患者样品。因此，用本发明的5T4-4色分析确定H得分类别，然后将所述H得分类别用于H得分计算。最后，鉴定表达5T4靶的CTC的诊断分析会用于鉴定可治疗的癌症患者群，并在用ADC如5T4-A1-mcMMAF的治疗过程中，用作监控癌症患者中CTC的手段。
本发明的另一方面是，使用H得分作为基本评分系统来表征CTC上的5T4。如上文所示，H得分是加权得分，其将每一类别内CTC的百分比乘以其各自类别值然后求和，从而产生0-300的得分。如图1a所示，基于个体5T4表达，将CTC分为4类(0-3)。为了计算合理可用的H得分，最少必须存在10个CTC。
对于患者而言，会以两种方式计算H得分：(1)传统H得分(THS)——将每一事件(单一CTC或CTC簇)的平均5T4强度作为单个数据点计数；(2)簇加权H得分(CWHS)——(单一CTC或簇内)每一CTC的平均5T4强度作为单个数据点计数。
利用H得分类别的值和每一类别的CTC百分比，计算H得分的实例如下：H得分类别0(1.5％CTCs)；H得分类别1(15.0％CTCs)；H得分类别2(68％CTCs)；H得分类别3(15.5％CTCs)。H得分＝(1.5×0)+(15.0×2)+(68.0×2)+(15.5×3)＝198。
随后可利用H得分选择具有最大用ADC如5T4-A1-mcMMAF或其他5T4特异性ADC成功治疗概率的患者群。图2b提供利用本发明的5T44色分析计算的17例NSCLC患者中14例患者的H得分。
在其他实施方案中，提供治疗癌症的方法，包括通过用优化的5T44色分析鉴定5T4阳性CTC来鉴定患有5T4阳性癌症的患者；通过确定H得分，将所述患者分类；以及给有需要的患者施用有效量的特异性结合5T4阳性癌症的ADC。而且，在治疗过程中，利用优化的5T44色分析间歇监控患者5T4阳性CTC的存在。与用ADC治疗前血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞的数量相比，检测到用ADC治疗后血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞的数量降低，可以表明抗体药物缀合物化合物在治疗哺乳动物个体中5T4阳性癌症中的效力。
在另一实施方案中，与用抗体药物缀合物治疗后相比，利用优化的5T44色分析分析细胞群，以鉴定和表征用抗体药物缀合物治疗前测试样品中的循环肿瘤细胞，其中与治疗前血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞比值相比，治疗后血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞比值的变化，可以表明抗体药物缀合物在减少5T4阳性循环肿瘤细胞中的功效。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括，通过用优化的5T44色分析鉴定5T4阳性CTC来鉴定患有5T4阳性癌症的患者，以及给所述患者施用有效量的特异性结合5T4阳性癌症的ADC和化疗剂。化疗剂是这样的药物，即并未发现用其治疗癌症是难治的。在一些实施方案中，化疗剂是这样的试剂，即已发现用其治疗癌症是难治的。可以将ADC施用于已经经历治疗(如治疗癌症的外科手术)的患者。在另一实施方案中，其他治疗方法是放射疗法。而且，在治疗过程中，利用优化的5T44色分析，间歇监控患者5T4阳性CTC的存在。
可检测标签
可以通过光谱手段、光化学手段、生化手段、免疫化学手段、电手段、光学手段或化学手段，检测分析所用的具体标签或可检测基团。标签的具体类型并非本发明的关键方面，只要其不明显干扰抗体与分析所用的细胞或循环肿瘤细胞上的细胞标记的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测物理或化学性质的任何物质。分析或免疫分析领域已经充分研发了这类可检测标签，通常，可以将可用于这类方法中的大多数任意标签应用于本发明。因此，标签是可以通过光谱手段、光化学手段、生化手段、免疫化学手段、电手段、光学手段或化学手段检测的任何组合物。可用于本发明的标签包括荧光染料(Invitrogen)、磁珠(例如Dynabeads.TM.)、荧光染料(例如荧光素异硫氰酸酯、德克萨斯红(Texasred)、若丹明等)、放射性标签，和其他显像剂如微泡(用于超声成像)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及ELISA中常用的其他酶)，以及量热标签如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
根据本领域熟知的方法，可以将标签直接或间接偶联于分析的期望组分。如上文所述，可以使用多种标签，标签的选择取决于所需的灵敏度、与化合物缀合的便利性、稳定性要求、可用的仪器以及处理规定。
经常通过间接手段连接非放射性标签。通常，配体分子(例如生物素)与分子共价结合。随后配体结合固有可检测的或共价结合信号系统的抗配体分子(如链霉亲和素)，所述信号系统如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用许多配体和抗配体。如果配体具有天然抗配体，例如生物素、甲状腺素以及皮质醇，其可以与有标签的天然存在的抗配体联用。或者，可以将任何半抗原或抗原化合物与抗体联用。
还可以将所述分子直接与产生信号的化合物缀合，例如通过与酶或荧光团缀合。作为标签的感兴趣的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光染料(Invitrogen)、荧光素和其衍生物、若丹明和其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2,3-dihydrothphalazinediones，例如鲁米诺。有关可用的各种标记系统或产生信号的系统的综述，参见美国专利第4,391,904号，将其在此通过引用并入。
检测标签的方法是本领域技术人员熟知的。因此，例如，如果所述标签是放射性标签，检测的手段包括闪烁计算器或放射自显影中的感光膜。如果所述标签是荧光标签，其可以通过用适当波长的光激发荧光染料并检测所得的荧光进行检测。所述荧光可以通过感光膜、通过使用电子检测器如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增管等可视地检测。相似地，酶标签可以通过为所述酶提供合适的底物并检测所得的反应产物来检测。最后，简单的量热标签可以通过观察与标签有关的颜色来简单检测。
根据本发明的公开，其他实施方案和用途对本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例1
优化的5T44色诊断分析
研发优化的4通道分析，用来鉴定5T4阳性CTC。用4种不同的染料染色CTC，并在4个独立的通道上进行测量。例如，CTC可以用抗CK-(红色)、抗(绿色)、抗5T4-(紫色)染色；而细胞核可以用DAPI染成蓝色。因为有多种颜色的荧光染料(Invitrogen)可以使用，因此可以选择的其他染色组合。
患者和血液样品采集
从转移性癌患者采集样品置于抗凝血试管中，并在24小时内处理。还从正常对照抽取血液样品。
用于CTC检测的血液样品处理
在使用Hemocue WBC系统(HemoCue,Sweden)测量白血细胞(WBC)计数前，将血液样品震荡5分钟。基于WBC计数，将一定体积的血液进行红细胞溶解(氯化铵溶液)。在离心后，将有核细胞重悬浮于PBS并将其作为单细胞层附着于定制的玻璃载玻片上。所述玻璃载玻片与标准显微镜载玻片的大小相同，但是具有专有的涂层，该涂层允许最大程度地保留有生命的细胞。每一载玻片容纳约三百万个有核细胞；因此每一载玻片上接种的细胞的数量，取决于患者的WBC计数。
对本研究而言，为了检测癌症患者的CTC，用4个载玻片作为测试。将针对每一患者产生的剩余载玻片储存于-80℃，用于将来的实验。将每一患者的4个载玻片解冻，接着将细胞用2％多聚甲醛固定、用冷甲醇透性化，并用山羊血清封闭非特异性结合位点。然后将单克隆抗广谱细胞角蛋白抗体(Sigma)和CD45-Alexa荧光染料(Serotec)与载玻片于37℃下温育40分钟。在PBS洗涤后，将山羊抗小鼠抗体-Alexa荧光染料(Invitrogen)与载玻片于37℃孵育20分钟。在PBS洗涤后，随后将抗5T4抗体-Alexa荧光染料与载玻片于37℃孵育20分钟。用DAPI将细胞复染色10分钟，并用含水封片剂封片。
成像和技术分析
用经研发并优化用于快速可靠扫描的定制的荧光扫描显微镜，扫描每一患者的全部4个载玻片。以10×放大率以4种颜色完全扫描每一载玻片，并产生超过6900张图像。将所得的图像提供给分析算法，所述算法基于许多测量结果鉴定可能的候选CTC，所述测量结果包括细胞角蛋白强度、CD45强度、5T4强度以及细胞核和细胞质的形状和大小。然后技术分析者仔细检查算法，产生的可能候选者，并除去明显不是细胞的点(hit)，如染料聚集物。
专业分析和解释
通过基于网络的报告，将所有可能的候选CTC呈递给血液病理学家进行分析和解释，其中，血液病理学家将每一候选细胞列为CTC或排除。如果细胞是细胞角蛋白阳性、5T4阳性、CD45阴性、含有完整DAPI细胞核而没有可鉴定的凋亡变化(起泡、退化的外观)或破坏的外观且在形态上不同于周围的WBC，则将它们分类为CTC。细胞必须具有明显处于四周且含有完整细胞核的细胞质。细胞质可以表现出凋亡变化，如起泡和密度不规则，或外周细胞质边界轻微破坏，但其不可以受到破坏以致其与细胞核的关联成为问题。将图像呈现为数码图像，既可以单一荧光通道显示也能显示合成图像。每一细胞图像用有关相对细胞核大小、荧光强度以及可比较的荧光强度的辅助统计数据来注解。每一CTC候选者与充足的周围WBC一起呈现于视野中，从而允许在所讨论的细胞的细胞形态特征与背景WBC之间进行情景比较(contextual comparison)。
瑞氏姬姆萨染色
从荧光染色的载玻片除去盖玻片，并在PBS中漂洗。然后用瑞氏姬姆萨染料(Fisher Scientific,Kalamazoo,Mich.)将载玻片淹没3分钟。向染料覆盖的载玻片添加1.5 mL、pH 6.8的磷酸盐缓冲液(Fisher Scientific,Kalamazoo,Mich.)，通过轻轻晃动1分钟，将染料和缓冲液混合在一起。然后使混合物在载玻片上停留超过2分钟，之后用去离子水漂洗载玻片并使其空气干燥。
在本发明的优化的5T44色分析的CTC鉴定和表征方法中所用的步骤是：(1)制备载玻片；(2)储存载玻片；(3)解冻并染色载玻片；(4)扫描载玻片；(5)运行算法；以及(6)技术分析和报告。
考虑到临床环境以及早期技术创新和未来自动化，专门研发了CTC分析。所有实验过程遵循已经优化、测试并验证的严格的标准操作程序。用使病理学家能做出决策并随后追踪这些决策的特定界面，已使数据采集和候选者鉴定自动化。
该系统承诺使新研究能进行CTC形态分类分子表征以及应用于癌症患者的现场即时筛检、监控和管理。

Claims (28)

1.检测疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体中5T4阳性循环肿瘤细胞的方法，其包括：
测试来自所述哺乳动物个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；
将所述血液样品置于基质上；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；
检测所述血液样品中是否存在结合所述循环肿瘤细胞的第二标记；
检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或所述细胞群的子集的第三标记；
检测所述血液样品中选择性结合所述循环肿瘤细胞的第四标记的表达水平，其中所述第四标记是人5T4抗原；以及
分析通过所述第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征所述循环肿瘤细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述血液样品中存在所述循环肿瘤细胞表明所述哺乳动物个体中存在早期5T4阳性癌症。
3.权利要求1的方法，其中所述血液样品中不存在所述循环肿瘤细胞表明所述哺乳动物个体处于无疾病状态或非可度量的疾病状态。
4.权利要求1的方法，其中所述血液样品中所述循环肿瘤细胞的存在与否指示5T4阳性癌症治疗或癌症恢复过程中的治疗管理。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞群是混合细胞群。
6.权利要求1的方法，其中所述基质是平面基质。
7.权利要求1的方法，其中所述基质是微流体装置。
8.权利要求1的方法，其中所述基质是容纳富集的细胞群的盒。
9.权利要求1的方法，其中将所述样品置于所述基质上形成生物单细胞层。
10.权利要求1的方法，其中所述第一标记、所述第二标记、所述第三标记或所述第四标记是荧光标记。
11.权利要求1的方法，其中所述第一标记用于通过细胞核详情、细胞核轮廓、核仁的存在与否、细胞质的特质或细胞质的量分析所述细胞群。
12.权利要求11的方法，其中所述分析使用DAPI。
13.权利要求11的方法，其还包括通过测量具有高核质比的完整细胞、具有低核质比的完整细胞、早期凋亡细胞或晚期凋亡细胞分析所述细胞群，并鉴定所述循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇。
14.权利要求1的方法，其中所述第二标记或所述第三标记是细胞特异性标记。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞特异性标记是细胞角蛋白、CD45、M30、趋化因子受体、CXCR1、CXCR4、CD44、CD24、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、EGFR或HuR。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞特异性标记是细胞角蛋白。
17.权利要求15的方法，其中所述细胞特异性标记是CD45。
18.权利要求1的方法，其中所述第一标记是细胞染料，以通过形态、大小或核质比鉴定所述循环肿瘤细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞染料是瑞氏姬姆萨染料。
20.权利要求1的方法，其中检测所述第一标记的存在、所述第二标记的存在、所述第三标记的存在或所述第四标记的存在，还包括通过细胞对所述基质的附着分析所述细胞群、扫描所述基质上的所述细胞群以及用重定位通过数字显微镜使所述细胞成像。
21.权利要求1的方法，其中在所述血液样品中检测到5T4阳性循环肿瘤细胞指示5T4阳性癌症。
22.权利要求21的方法，其中所述5T4阳性癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌以及睾丸癌。
23.诊断疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体中5T4阳性循环肿瘤细胞的方法，其包括：
测试来自所述哺乳动物个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；
将所述血液样品置于基质上；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；
检测所述血液样品中是否存在结合所述循环肿瘤细胞的第二标记；
检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或所述细胞群的子集的第三标记；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合所述循环肿瘤细胞的第四标记，其中所述第四标记是人5T4抗原；以及
分析和定量通过所述第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征所述循环肿瘤细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述定量所述循环肿瘤细胞上的人5T4抗原用于产生H得分，其中所述H得分用于选择5T4阳性癌症患者群。
25.筛选用于治疗疑似患有癌症的哺乳动物个体中5T4阳性癌症的抗体药物缀合物的活性或功效的方法，包括：
给所述哺乳动物个体施用治疗有效量的抗体药物缀合物；
测试来自所述哺乳动物个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；
将所述血液样品置于基质上；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记；
检测所述血液样品中是否存在结合循环肿瘤细胞的第二标记；
检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或细胞群子集的第三标记；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合所述循环肿瘤细胞的第四标记，其中，所述第四标记是人5T4抗原；以及
分析通过所述第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征，用所述抗体药物缀合物治疗前与用所述抗体药物缀合物治疗后相比，所述血液样品中的所述循环肿瘤细胞，
其中与治疗前所述血液样品中5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞之比相比，治疗后所述血液样品中所述5T4阳性循环肿瘤细胞与5T4阴性循环肿瘤细胞之比的变化可以指示所述抗体药物缀合物在减少5T4阳性循环肿瘤细胞方面的功效。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体药物缀合物是抗5T4-A1-mcMMAF。
27.检测疑似患有5T4阳性癌症的哺乳动物个体中5T4阳性循环肿瘤细胞的方法：
测试所述哺乳动物个体的血液样品，其中所述血液样品包含细胞群；
将所述血液样品置于基质上；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合有核细胞的第一标记，其中所述第一标记是DAPI；
检测所述血液样品中是否存在结合所述循环肿瘤细胞的第二标记，其中所述第二标记是细胞角蛋白；
检测所述血液样品中是否存在结合确定为不是肿瘤细胞的细胞群或所述细胞群的子集的第三标记，其中所述第三标记是CD45；
检测所述血液样品中是否存在选择性结合所述循环肿瘤细胞的第四标记，其中所述第四标记是人5T4抗原；以及
分析和定量通过所述第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，以鉴定和表征所述循环肿瘤细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述分析通过所述第一、第二、第三以及第四标记所检测到的细胞群，用于确定将哺乳动物个体纳入或排除于对5T4阳性癌症的治疗。
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