JP5889883B2 - 血液中の循環黒色腫細胞を使用して黒色腫患者の臨床成果を予測する方法。 - Google Patents

血液中の循環黒色腫細胞を使用して黒色腫患者の臨床成果を予測する方法。 Download PDF

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Description

進行した黒色腫の治療は、その異質組織病理学、及び腫瘍進行中に蓄積される構成の変化によって複雑なものとなっている。転移性乳癌又は結腸直腸癌の患者の循環腫瘍細胞の計数及び特徴付けは、臨床的に重要性の高い独立した予後及び予測情報を提供することが示されており、患者管理の監視に使用することができる。
循環腫瘍細胞(CTC)は、原発癌(治癒が可能な疾患段階)と転移性疾患(多くの悪性腫瘍において死亡の主要因であり続けている)との間の重要な関連を示してきた。臨床研究により、CTCは転移性乳癌において予後及び予測の強力なバイオマーカーであることが示されており、前立腺癌及び結腸直腸癌においても同様の結果が報告されている。これらのデータは、CTCが、潜在する生物学的促進性転移性癌を表わすことを示しており、これらの細胞を更に細胞分析及び分子分析することにより、転移の分子調節及び治療に対する反応について、新しい洞察を明らかにできることを示唆している。
患者の血液中の循環黒色腫細胞(CMC)を取得し、計数し、特徴付けするために、CTCを取得し、計数し、特徴付けする方法が改良された。2008年10月20日に出願された米国特許出願第12/254188号の血液中の循環黒色腫細胞の自動計数及び特徴付けを参照されたい。本出願は、参照により本明細書に組み込まれる。この方法によってCMCを取得し、計数し、特徴付けした場合でも、転移性黒色腫を持つ患者の短期間生存に関する予測値は未知であった。本発明は、転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法を提供する。
全血からの既知数のスパイクされたSK−Mel 28細胞の回収。健常ドナー検体中にスパイクされたSK−Mel 28細胞(即ち、0個、5個、18個、72個、280個及び1183個の細胞が、各細胞レベルの合計5つの異なる検体で2日のそれぞれに5人の健常ドナーからの7.5mLの血液中にスパイクされた)。スパイクされた細胞の数を、観察された回収細胞の数に対してプロットした。 列A〜Eは、CellTracks Analyzer II(登録商標)ソフトウエアによって、黒色腫患者からの検体中のDAPI信号とPE信号の両方を有する対象として識別された対象を表す。サムネイル画像は、右から左に、Ki67 FITC信号、CD45 APC又はCD34 APC信号、DAPI信号、HMW−MAA PE信号、及びDAPI信号(紫)とHMW−MAA(緑)信号のオーバーレイを表す。列Aの細胞は、CD45及び/又はCD34を発現するので黒色腫細胞として除外され、列B及びCの細胞は、Ki67を発現しない黒色腫細胞として分類され、列D及びEの細胞は、Ki67を発現する黒色腫細胞として分類される。 黒色腫患者からの7.5mLの血液から得られたCellTracks Analyzer II(登録商標)からの典型的なCMC画像の一覧。 55人の健常ドナーの7.5mLの血液中と44人の転移性黒色腫患者からの79個の検体中とのCMCの有病率(パネルA)。 55人の健常ドナーの7.5mLの血液中と16人の黒色腫患者からの19個の検体中のCMCを示すKi67の百分率(パネルB)。 全血7.5mlあたり2個未満の循環黒色腫細胞を含む群の転移性黒色腫を持つ患者と、全血7.5mlあたり2以上の循環黒色腫細胞を含む群の患者の全生存率のカプラン−マイヤー推定量。全生存時間は各採血時から計算された。平均生存期間は、2個未満のCMCを含む群では12.1ヶ月であり、それに対して2個以上のCMCを含む人の場合は2.0ヶ月である(ログランク検定によりP=0.001。7.5mlあたり2細胞以上の患者の死亡危険率が3.2)。
本発明は、転移性黒色腫を有する患者の全生存率を予測する方法であって、
a)転移性黒色腫を持つ患者から7.5mLの血液検体を取得することであって、前記検体が、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む、ことと、
b)前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
c)前記希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
d)前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
e)前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
数が2以上の場合に、前記患者の全生存率が低くなると予測し、
循環黒色腫細胞の数が2未満の場合に、前記患者の全生存率が高くなると予測する、方法を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「濃縮する」は、ステップ(a)の血液検体からCMCを分離することを意味する。濃縮する方法は、磁気粒子に結合された抗CD146の使用を含むがこれに限定されない。好ましい方法は、磁気ビーズに結合された黒色腫細胞上に存在する抗原に対する抗体を使用して血液検体から細胞を取得することである。用語「確認すること」は、分離された細胞がCMCや他の細胞組成であるかどうかを判定することを意味する。確認方法は、黒色腫細胞に固有の核酸色素又はモノクローナル抗体の使用を含むがこれらに限定されない。好ましい確認方法は、様々な蛍光標識モノクローナル抗体でCMCを染色することであり、好ましい抗体は、白血球と内皮細胞とを排除するCD45 & CD34と、黒色腫細胞を識別する高分子量黒色腫関連抗原HMW−MAAである。用語「分析すること」は、取得したCMCを評価して、CMCが、HMW−MAAやMART−1(T細胞によって認識された黒色腫抗原)などの様々な黒色腫固有マーカ及びKi−67などの他のマーカを示すかどうかを判定することを意味する。好ましい分析方法は、CMCがKi−67及び/又はHMW−MAAを示すかどうかを判定することを意味する。用語「評価すること」は、自動画像分析を含むがこれに限定されない方法を使用して検体中に何個のCMCがあるかを決定することを意味する。好ましい評価方法は、CellTracks Analyzer II(登録商標)を使用する。
本発明は、以下の方法及び実施例によって実証される。これらの実施例及び方法は、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の方法は、本発明の実施を容易にするために提供される
患者及び採血。血液は、健常ボランティアと、黒色腫を持つ患者とから、真空にされた10mL血液CellSave保存用採血チューブ(Veridex LLC,Raritan,NJ)に抜き取られ、72時間以内に処理された。
患者は全員、研究倫理委員会認定プロトコルを使用してUniversity of Oxford at the Churchill Hospitalの腫瘍内科学部から登録された。全ての患者が文書によるインフォームドコンセントを提出した。44人(男性25人と女性19人の)の患者を登録し、年齢は31〜81歳(平均59歳)であった。最初の採血時に、39/44(86%)が転移性疾患を持ち、5人の患者が、非切除のステージIIIの疾病を持っていた。転移性疾患を持つ患者の38/44(78%)は内臓疾病を持ち、5/44(11%)は内臓障害がなく、1人の患者に関しては転移部が記録されなかった。経過観察の中央値は、10.1ヶ月であった。血液は、常に、静脈内治療の投与の前又は最低7日後に癌患者から抜き取られた。55人の健常ボランティアを対照として含み、採血時に分かっている病気や発熱はなく、悪性疾患の履歴もなかった。
細胞培養と細胞スパイク。黒色腫細胞株SK−Mel28を、10%ウシ胎児血清を追加したRPMI 1640を含むフラスコ内で培養し、その後でトリプシン処理なしに収穫した。細胞懸濁液は、トリパンブルー排除によって評価されるような生存率が90%を超えたときだけ使用された。実際の細胞数を決定するために、200μLの緩衝剤と合計約20,000個のビーズを含む20μLの蛍光ビーズ(Beckman−Coulter,Inc.,Miami,FL)を、50μLのSK−Mel28細胞のLアリコットに添加した。SK−Mel28細胞を検出のためにPEと結合した抗HMW−MAAで染色した。検体の100%が吸引されるまでビーズだけを収容した複製チューブをフローサイトメーター(FACSCalibur;BD Biosciences,San Jose,CA)上に延ばした。これにより、20μL中にあるビーズの数を正確に推定できた。次に、実験チューブを、各チューブ内のビーズが10,000個になるまでフローサイトメーターで3部試験した。単位体積当たりの既知のビーズ数を使用してSK−Mel28細胞の数を決定した。
検体調製7.5mLの血液を、15mL CellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)検体チューブに移して6.5mLの緩衝剤と混ぜ、10分間800gで遠心分離し、次に自動検体調製のためにCellTracksAutoprep(登録商標)(Veridex LLC)上に置いた。試薬は、黒色腫細胞の取得と検出のために最適化され、黒色腫細胞と内皮細胞の両方を免疫磁気的に濃縮するためにCD146抗体で被覆された強磁性流体と、取得効率を最大にするための取得強化試薬と、黒色腫細胞を識別するために高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)(クローン9.2.27,Veridex LLC)に結合するフィコエリトリン結合抗体と、白血球(CD45,clone HI30,Veridex LLC)と内皮細胞(CD34,クローン581,BD Biosciences)を識別するための2つのアロフィコシアニン共役抗体の混合物と、Ki−67タンパク質(クローンB56,BD Biosciences,San Jose,CA)を識別するためのFITC結合抗体と、有核細胞を識別する核色素4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)と、細胞を洗浄し、透過化処理し、そして再懸濁するための緩衝剤とからなる。最終処理段階で、細胞をMagNest(登録商標)Cell Presentation Device(Veridex LLC)中に再懸濁させた。CellTracks Analyzer II(登録商標)を使用する分析の準備のため、MagNest装置によって生成された磁界により、磁性標識付き細胞をカートリッジの分析面全体に均一に分散させる。
検体分析。MagNestを、CellTracks AnalyzerII(登録商標)4色半自動蛍光顕微鏡上に置く。4つの蛍光フィルタキューブごとのカートリッジの表面全体をカバーする画像フレームを取得する。PE並びにDAPI陽性イベントを含む画像を、細胞螢光と形態に基づいてユーザによるイベントの分類のために一覧で示す。黒色腫細胞として定義される対象の基準には、円から楕円の形態、可視核(DAPI陽性)、HMW−MAAの陽性染色、及びCD45とCD34の陰性染色が挙げられる。黒色腫細胞をKI67+細胞とKi67−細胞に分けた。細胞計数の結果は、常に、血液7.5mL当たりの細胞数として表される。
黒色腫細胞検出の精度、感度及び直線性。精度、直線性及び感度の実験のために、SK−Mel28細胞を、異なる6つの細胞レベル(0、5、18、72、280及び1183)でCellSave保存チューブ内に収集された7.5mLの血液中にスパイクした。血液中にスパイクされた細胞の正確な数を、フローサイトメトリーによって求めた。血液をスパイクした24時間後に、検体をCellTracks AutoPrep(登録商標)で処理し、CellTracks Analyzer II(登録商標)で分析した。各細胞レベルに合計5つの異なる検体で2日間別々に検体試験を行った。
統計分析
主要評価項目は、検査日から何らかの原因による死亡日までの時間として測定される全生存時間であった。追跡調査までに死亡したか調査終了時にまだ生きていた患者は、生きていることがわかっている最後の期日又は調査終了日に打ち切られた。患者1人当たり複数の検体がある場合は、生存分析には最後の検体を使用した。カプラン−マイヤー法を使用して全生存率を計算し、生存プロットを作成した。コックス回帰モデルを使用して、死亡の危険率(HR)を決定した。結果をSPSS 16.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)で分析した。
(実施例1)
スパイクされた組織培養黒色腫細胞株(SK−Mel28)の回収
この実施例では、SK−Mel28細胞がスパイクされた全血を使用した分析操作について述べる。この調査に使用されたプロトコルは以下の通りであった。健常ボランティアから全血をCellSaveチューブに引き入れ、組織培養黒色腫SK−Mel28細胞をスパイクした。様々な数のSK−Mel28細胞を血液にスパイクし、回収を測定した。健康ドナー検体(即ち、0、5、18、72、280及び1183個の細胞)中にスパイクされたSK−Mel28細胞の予想数を、検体中に観察されたSK−Mel28細胞の実数に対してプロットし、図1に示し、結果を表1にまとめた。5 SK−Mel28スパイクにおいて、スパイクされた細胞の平均回収率は88%であり、88%と比べて最高スパイクにおける平均回収率は74%であった。ピアソンR相関係数は0.99であった。予想通り、変動係数(CV)は、スパイクされた細胞の数が減少するほど増大し、1,183細胞スパイクの7%から5細胞スパイクの31%までに及ぶ。SK−Mel28細胞の回収は、64〜120%であり、細胞数が少ない場合には減少しなかった。
循環黒色腫細胞の識別HMW−MAA PE及びHMW−MAA PE、DAPI、CD45/CD34 APC及びKi67のオーバーレイのサムネイル画像を、検討のためにオペレータに示す。CMCに必要な特徴は、核の存在、HMW−MAAの発現、細胞形態、及びCD45発現の又はCD34発現の欠如である。図2は、評価者に示される1人の黒色腫患者からの6つのイベントを示す。パネルAは、DAPIとHMW−MAAで染色し、CD34及び/又はCD45でも染色した細胞を示し、したがってCMCとして分類されない。パネルB、C、D及びEは、DAPIとHMW−MAAで染色した細胞を示すが、CD34又はCD45ではそうではないのでCMCとして分類される。パネルB及びCにおけるCMCは、Ki67を示さず、一方、パネルD及びEにおけるCMCはKi67を示す。パネルBにおけるCMCが2つの核を含み、Ki67で染色しなく、一方パネルDにおけるCMCは、盛んに分裂しているように見え、実際にKi67を示すことに注意されたい。CMCのサイズと、その核と細胞質との比率は、黒色腫患者内のCMC間と黒色腫患者間とで極めて大きく異なる。図3は、特徴的に円から楕円の形状と無傷の核とを有する様々な患者からのCMC画像の一覧を示す。細胞サイズは、4μm〜30μmまで幅広く変化した。小さい細胞集合と多核CMCも観察された。
(実施例2)
健常ボランティアと黒色腫患者とにおける循環黒色腫細胞の頻度
この実施例では、健常ボランティアと黒色腫患者の循環黒色腫細胞の頻度について述べる。健常ドナーからの55個の血液検体と転移性黒色腫を持つ44人の患者からの79個の検体でCMCを計数した。図4では、パネルAが、対照群と患者の7.5mLの血液中に検出されたCMCの数を示す。CMCが検出された17人の患者からの19個の検体で、Ki67発現の評価を判定した。Ki67+CMCの割合は、34〜100%二及び、平均84%であった(SD25)。図4のパネルBは、Ki67発現と、これらの検体中に検出されたCMCの数を示す。55人の健常ドナーでは、3つの細胞がCMCとして分類され、3つは全てKi67を発現しなかった。
(実施例3)
黒色腫患者における循環黒色腫細胞及び全生存率。
対照群内の人には誰も2つ以上のCMCが検出されず、このカットオフは、患者群を区別するために選択された。CMCが2個未満の患者の平均生存時間は、12.1ヶ月(95%信頼区間で9.7〜14.4)であり、CMCが2以上の患者の平均生存時間の2.0ヶ月よりかなり長かった(95%信頼区間で0〜4.9)(図5)。ログランクpは0.001であった。死亡危険率は、コックス回帰により3.2(95%信頼区間で1.6〜6.5)であった。採血後1ヶ月以内に死亡した4人の患者のCMC数は比較的高かった(2、8、10及び8043 CMC/7.5ml)。
〔実施の態様〕
(1) 転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法であって、
(a)転移性黒色腫を持つ患者から7.5mLの血液検体を取得することであって、前記検体が、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む、ことと、
(b)前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
(c)希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
(d)前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
(e)前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
前記数が2以上の場合に、前記患者の全生存率が低くなると予測し、
循環黒色腫細胞の数が2未満の場合に、前記患者の全生存率が高くなると予測する、方法。
(2) 前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子CD146である、実施態様2に記載の方法。
(4) 前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、FISH手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記構造的完全性が、核酸色素、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、実施態様1に記載の方法。
(6) 前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、実施態様5に記載の方法。
(7) 前記特異的抗体がCD45及びCD34である、実施態様6に記載の方法。
(8) CD45及びCD34を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、実施態様5に記載の方法。
(9) FITC標識された抗−Ki67が追加されて、循環内の活性細胞周期のCMCの割合を測定する、実施態様1に記載の方法。
(10) 低い全生存率が、2ヶ月以下である、実施態様1に記載の方法。
(11) 高い全生存率が、12ヶ月である、実施態様1に記載の方法。

Claims (9)

  1. 転移性黒色腫を持つ患者から得た7.5mLの血液検体であって、循環黒色腫細胞を含む疑いのある混合細胞集団を含む血液検体において、転移性黒色腫を持つ患者の全生存率を予測する方法であって、
    (a)前記検体の画分を濃縮することであって、前記画分が前記循環黒色腫細胞を含む、ことと、
    (b)希少細胞の構造的完全性が無傷であることを確認することと、
    (c)前記無傷の希少細胞を分析することであって、前記分析することが疾患進行との相関を示す、ことと、
    (d)前記血液検体中の循環黒色腫細胞の数を評価することとを含み、
    前記数が2以上の場合に、前記患者の全生存率が平均生存時間で2ヶ月であると予測し、
    循環黒色腫細胞の数が2未満の場合に、前記患者の全生存率が平均生存時間で12ヶ月であると予測する、方法。
  2. 前記画分が、前記黒色腫細胞に特異的に結合する生物学的特異的なリガンドに結合した常磁性体粒子を、他の群を実質的に除外して区別するよう、外部的に印加される磁場を用いた免疫磁気的な濃縮によって得られる、請求項1に記載の方法。
  3. 前記生物学的特異的なリガンドが黒色腫細胞接着分子CD146である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記構造的完全性が、免疫細胞化学的手順、FISH手順、フローサイトメトリー手順、画像サイトメトリー手順、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される手順によって測定される、請求項1に記載の方法。
  5. 前記構造的完全性が、核酸色素、高分子量黒色腫関連抗原に特異的なモノクローナル抗体によって判断される、請求項1に記載の方法。
  6. 前記構造的完全性が、白血球及び内皮特異的抗体を使用して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外することによって更に確認される、請求項5に記載の方法。
  7. 前記特異的抗体がCD45及びCD34である、請求項6に記載の方法。
  8. CD45及びCD34を更に含有して、共濃縮された白血球及び循環内皮細胞を除外する、請求項5に記載の方法。
  9. FITC標識された抗−Ki67が追加されて、循環内の活性細胞周期のCMCの割合を測定する、請求項1に記載の方法。
JP2013514334A 2010-06-08 2011-06-08 血液中の循環黒色腫細胞を使用して黒色腫患者の臨床成果を予測する方法。 Expired - Fee Related JP5889883B2 (ja)

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