BR102020013625A2

BR102020013625A2 - Aptâmero modificado, sistema aptaimunológico, painel aptaimunológico, kit, método e uso no diagnóstico de câncer de próstata

Info

Publication number: BR102020013625A2
Application number: BR102020013625-9A
Authority: BR
Inventors: Luiz Ricardo Goulart Filho; Vivian Alonso Goulart; Aline Gomes De Souza; Karina Marangoni; Esther Campos Fernández; Emília Rezende Vaz
Original assignee: Universidade Federal de Uberlândia; Imunoscan Engenharia Molecular Ltda
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2022-01-11
Also published as: WO2022000065A4; WO2022000065A1

Abstract

aptâmero modificado, sistema aptaimunológico, painel aptaimunológico, kit, método e uso no diagnóstico de câncer de próstata. a presente invenção descreve novos aptâmeros modificados e um sistema aptaimunológico compreendendo ao menos um dos referidos aptâmeros modificados r4 e/ou d4 combinado com ao menos um anticorpo específico, painéis aptaimunológicos compreendendo o referido sistema, kit; método de diagnóstico ou prognóstico e seus usos para identificar biomarcadores do câncer de próstata em células tumorais circulantes de amostras biológicas. a partir da análise destes biomarcadores por citometria de fluxo, é possível discriminar pacientes com câncer de próstata de uma maneira superior ao antígeno prostático específico, que atualmente é o biomarcador padrão-ouro no câncer de próstata. assim, o sistema aptaimunológico da presente invenção apresenta um menor índice de falsos positivos e falsos negativos, o que é útil na triagem, diagnóstico, prognóstico e monitoramento terapêutico do câncer de próstata para aprimorar seu manejo clínico.

Description

APTÂMERO MODIFICADO, SISTEMA APTAIMUNOLÓGICO, PAINEL APTAIMUNOLÓGICO, KIT, MÉTODO E USO NO DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DE PRÓSTATA

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a uma ferramenta que auxilia nos procedimentos clinicos de pacientes com câncer de próstata através de novos aptâmeros modificados e sistema baseado na combinação desses novos aptâmeros com anticorpos especificos que apresentam capacidade de identificar células tumorais da próstata utilizando a técnica de citometria de fluxo para análise de amostras biológicas. Em particular, a ferramenta serve para auxiliar no diagnóstico de câncer de próstata, mas também na triagem, prognóstico e monitoramento de respostas a tratamentos.

Fundamentos da Invenção

[002] O câncer de próstata é bastante frequente, tendo representado 10% dos novos casos de câncer nos Estados Unidos no ano de 2019 (HOWLADER et al., 2019). No Brasil, a incidência prevista para 2020 é de 66.000 novos casos, sendo o segundo tipo de câncer mais comum nos homens (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA, 2019).

[003] Atualmente, o câncer de próstata é rastreado pelo exame do antígeno prostático específico (PSA, do inglês Prostate-Specific Antigen) no soro sanguíneo, complementado pelo exame de toque retal. O resultado positivo no PSA, precisa ser confirmado pelo exame histopatológico a partir de uma biópsia invasiva do tecido prostático, guiada por ultrassom. Após um resultado negativo na biópsia, pode ser feita adicionalmente uma ressonância magnética multiparamétrica (TRUONG; FRYE, 2017) . Assim, o exame de PSA é hoje a técnica padrão ouro na prática clínica do câncer de próstata. Entretanto, não é um teste conclusivo, pois precisa de técnicas complementares que validem seu resultado (VELONAS et al., 2013).

[004] Além disso, valores de PSA elevados, ou seja, maiores que 4,0 ng/mL, podem levar a resultados falsos positivos que indicam presença de câncer quando não há. Ao mesmo tempo, resultados abaixo do valor de referência podem apresentar falsos negativos, não detectando casos reais de câncer (ILIC et al., 2013). Ainda, no período entre 2009 e 2015 nos Estados Unidos, todos os pacientes diagnosticados com câncer de próstata em estadiamento local ou loco-regional mostraram sobrevivência relativa de cinco anos, enquanto que apenas cerca de 30% dos pacientes diagnosticados em estadiamento avançado apresentaram uma supervivência relativa a cinco anos (HOWLADER et al., 2019) . Com isso, é necessária a detecção precoce de câncer de próstata, com testes mais específicos e sensíveis do que o PSA.

[005] Novas abordagens chamadas de biópsias líquidas analisam os componentes do tumor liberados nos fluidos corporais, como sangue, urina, sêmen, saliva e outras secreções. As biópsias líquidas são capazes de representar o estado atual do câncer em um indivíduo (KREBS et al., 2014) e sua amostragem é menos invasiva que as biópsias teciduais, que são cirúrgicas. Entre outros constituintes, os tumores liberam células que podem ser detectadas, por exemplo, no sangue do indivíduo acometido (ALLARD et al., 2005). Essas células são conhecidas como células tumorais circulantes (CTCs). A expressão de marcadores (também chamados de antígenos) de superfície em CTCs e sua quantificação já foram estudadas como fatores para o monitoramento clínico de vários tipos de câncer, principalmente a partir da marcação imunológica, usando anticorpos.

[006] A presença de CTCs em amostras de sangue é muito rara, na ordem de várias CTCs em dezenas de bilhões de células sanguíneas. Para detectar as CTCs, muitas abordagens enriquecem primeiramente as amostras com a população de CTCs para depois analisá-las. O enriquecimento de CTCs é feito atualmente com base na diferença nas características físicas (tamanho, morfologia, densidade, carga, etc.) ou na expressão de antígenos de superfície presentes na membrana plasmática. Assim, um dos problemas que as tecnologias de enriquecimento enfrentam é a alta heterogeneidade destas células, pois podem apresentar variabilidade tanto nas características físicas, quanto na expressão destes antígenos.

[007] Por exemplo, a patente CN110004062A apresenta uma interessante estratégia de enriquecimento negativo de CTCs em sangue por eliminação de outros tipos celulares. Diante disso, as hemácias são lisadas e um anel magnético giratório com anticorpos anti-CD45 captura os leucócitos para seu descarte, desta forma, concentrando com um alto rendimento todos os tipos de CTCs.

[008] As CTCs expressam na sua membrana plasmática diversos antígenos de diferenciação ou desdiferenciação celular e em diferentes graus, segundo a etapa de transição epitélio-mesenquimal (EMT, do inglês epithelial-mesenchymal transition) na qual se encontram. Estes antígenos proporcionam às células um fenótipo híbrido entre as epiteliais (com características diferenciadas) e as mesenquimais (com características desdiferenciadas).

[009] Durante a metástase, que acontece nas fases mais avançadas do câncer, a EMT permite que as CTCs do tumor primário extravasem para a corrente sanguínea e invadam outros tecidos, formando nichos celulares que darão lugar a tumores secundários após um processo de transição inverso (MET, de inglês mesenchymal-epithelial transition). À medida que a doença progride e os nichos metastáticos proliferam, são liberadas cada vez mais e mais CTCs, tanto do tumor primário quanto dos secundários. Estas CTCs podem ser capturadas na corrente sanguínea e fornecer informações relevantes acerca do quadro clínico atual dos pacientes.

[010] A presente invenção abrange a utilização tanto de anticorpos ligantes de antígenos epiteliais, como EpCAM, quanto de anticorpos ligantes de antígenos mesenquimais, como CD44 e CD133, que são indicativos de células tronco tumorais. EpCAM é uma glicoproteína de transmembrana expressa em células epiteliais normais e de forma exacerbada em carcinomas, com um papel relevante na formação de estruturas adesivas e na polaridade celular, sendo correlacionada com pior sobrevida global, mau prognóstico e maior risco de recorrência (HUANG et al., 2018) . CD133 é também conhecido como proeminina-1, uma glicoproteína de transmembrana presente em células tronco tumorais e não tumorais. Sua alta expressão em tumores é considerada como fator de prognóstico ruim e é responsável pela inibição de apoptose, a angiogênese e a proliferação celular nos processos de tumorigênese, metástase e quimioresistência (BARZEGAR BEHROOZ; SYAHIR; AHMAD, 2019) . CD44 é um receptor de adesão que se encontra na superfície das células e é altamente expresso em vários tipos de tumores, onde regula a migração e invasão celular durante o processo de metástase (SENBANJO; CHELLAIAH, 2017). Além destes antígenos, CD45 também faz parte desta invenção excluindo da análise as células de origem leucocitária através da ausência da sua expressão. Na presente invenção, esses antígenos são identificados por anticorpos.

[011] Por outra parte, a presente invenção abrange os aptâmeros D4 e R4 que foram modificados a partir do aptâmero original A4 (SOUZA et al., 2016) e se ligam especificamente a antígenos ainda não identificados na membrana plasmática de células tumorais da próstata. Os aptâmeros são biomoléculas de tipo oligonucleotídeos de fita simples ou peptídeos, formadas pela ligação de vários nucleotídeos ou aminoácidos, respectivamente, e com a capacidade de se ligar de maneira específica a moléculas alvo de maneira similar aos anticorpos monoclonais. A técnica de evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX, do inglês systematic evolution of ligands by exponential enrichment) é usada para selecionar aptâmeros a partir de um conjunto de sequências aleatórias de oligonucleotídeos ou aminoácidos.

[012] Comparado aos anticorpos, os aptâmeros de oligonucleotídeos apresentam melhor penetração tecidual por seu menor tamanho, maior especificidade, maior reprodutibilidade, versatilidade e durabilidade devido a sua síntese química, que ainda facilita sua produção, modificação, manipulação e estocagem, além da baixa imunogenicidade que aumenta o sucesso em terapias, entre outras vantagens (ZHAO; TAN; FANG, 2015).

[013] Diante da problemática do câncer de próstata, a presente invenção propõe o uso conjunto dos aptâmeros de natureza oligonucleotídica D4 e/ou R4 com os anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45 ou anti-CD44 e anti-CD133, como marcadores para triagem, diagnóstico, prognóstico e monitoramento terapêutico do câncer de próstata a partir da identificação desses biomarcadores por citometria de fluxo convencional em amostras biológicas, como fluídos corporais ou biópsias teciduais.

[014] Em um contexto mais amplo, o pedido de patente US2008206757A1 refere-se, entre outros, a um método de enriquecimento de CTCs a partir de amostras de sangue de indivíduos com qualquer tipo de câncer para sua posterior análise clínica. Este método de enriquecimento, similar ao utilizado na presente invenção, compreende etapas de centrifugação, lavagem em tampões, lise ou depleção de eritrócitos e incubação com anticorpos ou outras moléculas ligantes para separar as células de interesse ou descartar aquelas indesejáveis. Entre essas moléculas ligantes, o referido pedido de patente não menciona os aptâmeros, nem os anticorpos anti-CD133 ou anti-EpCAM, como na presente invenção. Por outro lado, propõe o uso dos anticorpos anti-CD44 e anti-CD45 e anticorpos ligantes de moléculas de adesão diferentes a EpCAM de forma combinada com muitos outros anticorpos. Entretanto, diferentemente da presente invenção, esta proposta usa anticorpos acoplados a beads magnéticas para facilitar a separação das células na amostra enriquecida, inclui uma etapa de filtração com uma prensa de tipo francesa e utiliza uma amostra de sangue armazenada a temperatura ambiente, a qual pode ser analisada em até 4 dias.

[015] A principal desvantagem desse modelo, frente ao apresentado neste pedido, é o comprometimento da integridade das células devido ao tempo de armazenamento das amostras e às etapas de enriquecimento por métodos físicos. O custo elevado das beads magnéticas acopladas a anticorpos e da prensa francesa são outras das desvantagens do modelo apresentado na patente US2008206757A1.

[016] Outro método e dispositivo para o enriquecimento e análise de CTCs em amostras de sangue de pacientes com câncer é o proposto na patente CN107449713A, que também limita-se apenas ao uso de anticorpos: anti-CD45 para a remoção de leucócitos, anti-EpCAM para a concentração de CTCs com perfil epitelial, anti-vimentina para as CTCs com perfil mesenquimal e anti-pancitoqueratina para a confirmação do enriquecimento de CTCs.

[017] O sistema de detecção de CTCs apresentado pela patente CN106645726A compreende a lise dos eritrócitos de amostras de sangue, o uso de um suporte adsorvente de CTCs a partir da ligação destas ao anticorpo monoclonal anti-EpCAM ou anti-EGFR, a filtração da solução resultante, a fixação das células, a marcação fluorescente nuclear das células com o corante DAPI ou Hoechst 33258, a marcação das células tumorais com anticorpos anti-CK8/CK18/CK19, anti-PanCK, anti-vimentina ou anti-plastina-3 acoplados a quantum dots, a marcação de leucócitos com anticorpos anti-CD45, anti-CD15 ou anti-CD33 acoplados a quantum dots e a avaliação da marcação por um operador através de um microscópio de fluorescência.

[018] Este sistema alega uma menor taxa de perda de CTCs devido à combinação do suporte adsorvente e a filtração e uma maior qualidade da marcação pelo uso de quantum dots, cuja fluorescência é mais brilhante e estável que a dos fluorocromos comumente usados. Entretanto, o uso de sistemas físicos de separação compromete a integridade das células, e a avaliação das marcações por um técnico pode induzir a resultados variáveis devido à subjetividade da análise.

[019] A patente US8329422B2 refere-se a métodos e reagentes para a análise de CTCs, aglomerados ou fragmentos de células por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, para a triagem, monitoramento e diagnóstico de tumores. Esta patente já rendeu a plataforma comercial CellSearch, que quantifica as CTCs provenientes de sangue periférico para o prognóstico de câncer de próstata metastático resistente a castração, dentre outros tumores metastáticos, e é o único sistema aprovado pela Food and Drug Administration para esta finalidade (DE WIT; VAN DALUM; TERSTAPPEN, 2014) .

[020] No CellSearch é necessário dispor de vários dispositivos e softwares para o processamento das amostras e sua posterior análise. Estes dispositivos usam anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45 de maneira similar à presente invenção, mas adicionam os anticorpos citoplasmáticos (marcadores internos, não de membrana plasmática) anti-citoquinas 8, 18 e 19 e o corante nuclear DAPI para a identificação das CTCs prostáticas por microscópio de fluorescência. A partir da identificação de cinco CTCs nas amostras destes pacientes, considera-se um prognóstico desfavorável, com baixa sobrevida global. Mas um ponto importante a considerar é que o CellSearch não detecta CTCs em pacientes com câncer de próstata localizado; seu uso apenas foi aprovado para pacientes com metástase (MEYER et al., 2016).

[021] Entretanto, o maior erro do sistema é a identificação de fragmentos de CTCs como células inteiras, resultando em uma grande variabilidade na contagem de CTCs (KRAAN et al., 2011) . Ainda, o CellSearch precisa de caros dispositivos exclusivos do fabricante para o processamento e análise das amostras. Isso cria uma total dependência do fabricante e faz com que nem todos os laboratórios clínicos possam instalar este sistema, sendo necessário o transporte de amostras até laboratórios de referência para o seu processamento. Assim, este transporte pode agravar o dano celular e interferir na análise e resultado da amostra.

[022] Aptâmeros de superficie celular já têm sido propostos para a detecção de células tumorais: de forma individual, como o aptâmero ligante de CD133 para carcinoma indiferenciado da tireoide descrito na patente CN109536503A, ou de forma conjunta, como na patente US2011124015A1 e nos sistemas multiplex das patentes WO2013185078A1 ou JP2017079634A. Esta última propõe uma interessante estratégia de detecção de CTCs a partir da amplificação de sinais luminescentes baseada na hibridação de aptâmeros complexados nos quais participa um aptâmero de captura de CTCs ligante de EpCAM.

[023] No entanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve o aptâmeros modificados tal como descritos no presente pedido de patente, bem como não descreve nem sugere o uso combinado dos aptâmeros especificos aqui descritos com anticorpos em um método de diagnóstico de câncer de próstata. Adicionalmente, o método de diagnóstico aqui proposto necessita apenas de etapas que envolvam uma ultracentrífuga refrigerada e um citômetro de fluxo com no minimo quatro filtros ópticos para o processamento e análise das amostras. Esta característica evita a dependência de centros de referência, o que reduz o tempo desde a coleta até a análise e, assim, a degradação e variabilidade das amostras. Além disso, comparado com a baixa especificidade do teste do PSA e sua moderada sensibilidade (HARVEY et al., 2009), o presente teste de biopsia líquida tem uma maior acurácia, apresentando um melhor desempenho diagnóstico.

[024] Diante disso, atendendo às deficiências da tecnologia atual, a presente invenção combina anticorpos bem estabelecidos com aptâmeros de superfície celular modificados, para desenvolver um sistema de marcação de CTCs da próstata confiável, rápido, de baixo custo, fácil de popularizar entre os pacientes e de operação e equipamentos simples.

Breve descrição dos desenhos

[025] A Figura 1 apresenta as sequências e as conformações bi- e tridimensionais mais prováveis dos aptâmeros R4 e D4 modificados, com seus potenciais domínios de ligação correspondentes.

[026] A Figura 2 ilustra o diagrama de fluxo do processamento da amostra, até a etapa de leitura da fluorescência em citômetro de fluxo.

[027] A Figura 3 mostra a estratégia de análise dos dados por citometria de fluxo.

[028] A Figura 4 apresenta os grupos de indivíduos saudáveis e de pacientes com câncer de próstata segundo as variáveis analisadas no painel 1 com o aptâmero R4, o cutoff que melhor os diferencia e sua correspondente curva ROC.

[029] A Figura 5 apresenta os grupos de indivíduos saudáveis e de pacientes com câncer de próstata segundo as variáveis analisadas no painel 1 com o aptâmero D4, o cutoff que melhor os diferencia e sua correspondente curva ROC.

[030] A Figura 6 apresenta os grupos de indivíduos saudáveis e de pacientes com câncer de próstata segundo as variáveis analisadas no painel 2 com o aptâmero R4, o cutoff que melhor os diferencia e sua correspondente curva ROC.

[031] A Figura 7 apresenta os grupos de indivíduos saudáveis e de pacientes com câncer de próstata segundo as variáveis analisadas no painel 2 com o aptâmero D4, o cutoff que melhor os diferencia e sua correspondente curva ROC.

[032] A Figura 8 apresenta uma comparação preliminar de um grupo de indivíduos saudáveis controle e outro de pacientes tratados com câncer de próstata segundo a variável percentagem de células CD45- EpCAM+ que representa a marcação dos anticorpos usados para enriquecimento de CTCs na plataforma CellSearch e também o painel 1 sem os aptâmeros.

[033] A Figura 9 apresenta uma comparação preliminar de um grupo de indivíduos saudáveis controle e dois grupos de pacientes com câncer de próstata (um tratado e outro não tratado) segundo a variável percentagem de células CD45- EpCAM+ R4+ que representa o painel 1 com o aptâmero R4, proposto pela presente invenção.

Descrição da Invenção

[034] A presente invenção propõe novos aptâmeros modificados e um sistema aptaimunológico que compreende a combinação de ao menos um dos aptâmeros modificados e ao menos um anticorpo específico, em que os aptâmeros são de natureza oligonucleotídica em sua forma de RNA e/ou de DNA.

[035] O presente pedido de patente descreve novos aptâmeros modificado em sua forma de RNA ou de DNA que, ao ser combinado com anticorpos específicos, identifica células tumorais circulantes de câncer de próstata em amostras biológicas.

[036] Os aptâmeros R4 e D4 são aptâmeros modificados contendo 28 bases nitrogenadas (SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, respectivamente) que tem relação com uma parte da sequência do aptâmero de DNA A4 divulgado por SOUZA et al. (SOUZA et al., 2016) . Os aptâmeros modificados R4 e D4 descritos no presente pedido apresentam as bases nitrogenadas ligadas a um radical fosfato e a uma pentose, ribose no caso do aptâmero de RNA e 2' desoxirribose no caso do aptâmero de DNA. Adicionalmente, foram modificados com uma molécula de biotina acoplada na extremidade 5' para permitir sua ligação a moléculas de estreptavidina acopladas a um fluorocromo e um nucleotídeo monofosfato 2'desoxitimidina invertido, unido por uma ligação 3'-3', na extremidade 3', para evitar a degradação pelas exonucleases 3' e a extensão pelas polimerases de DNA. Assim, os aptâmeros usados na presente invenção apresentam um total de 29 nucleotídeos e são denominados de R4 e D4 (SEQ ID No. 3 e SEQ ID No 4, respectivamente), em que R4 é o aptâmero de RNA que compreende a SEQ ID NO. 1 e modificado compreende a SEQ ID No. 3, com adição de um monofosfato 2'desoxitimidina invertido na extremidade 3', e D4 é o aptâmero de DNA e compreende a SEQ ID NO. 2 e modificado compreende a SEQ ID No. 4, com adição de um monofosfato 2'desoxitimidina invertido na extremidade 3' . Os referidos aptâmeros apresentam as estruturas secundárias e tridimensionais tal como ilustradas na Figura 1. Estas modificações são particularmente preferíveis, mas também podem ser suscetíveis de outras, como por exemplo a marcação direta com fluorescência a partir da adição na extremidade 5' de um fluorocromo.

[037] Portanto, as sequências de aptâmero modificadas são formadas por ribonucleotídeos (r) (R4) e desoxirribonucleotídeos (d) (D4), modificadas no extremo 5' por uma biotina e no extremo 3' por uma timina invertida.

[038] Sequência do aptâmero de RNA R4 (5’ → 3') Biotina5'rArGrCrCrGrArGrArGrGrUrArArGrCrArArArArCrCrAr CrGrCrCrCrGdT5'.

[039] Nesse caso, o aptâmero modificado R4 compreende 28 ribonucleotídeos (bases nitrogenadas ligadas a uma molécula de ribose e a um radical fosfato) (SEQ ID NO 1) e a adição de um desoxirribonucleotídeo invertido na extremidade 3', posição 29 (SEQ ID No 3) . Mais particularmente o desoxirribonucleotídeo invertido compreende uma Timina como base nitrogenada.

[040] Sequência do aptâmero de DNA D4 (5'→ 3') Biotina5'dAdGdCdCdGdAdGdAdGdGdUdAdAdGdCdAdAdAdAdCdCdAd CdGdCdCdCdGdT5'.
Nesse caso, o aptâmero modificado D4 compreende 28 desoxirribonucleotídeos (bases nitrogenadas ligadas a uma molécula de desoxirribose e a um radical fosfato) (SEQ ID No 2) e a adição de um esoxirribonucleotídeo invertido na extremidade 3', posição 29 (SEQ ID No 4) . Mais particularmente o desoxirribonucleotídeo invertido compreende uma Timina como base nitrogenada. Além disso, a referida sequência compreende uma substituição no nucleotídeo da posição 11, onde a base nitrogenada Timina (especifica de uma sequência de DNA) foi substituída pela Uracila (específica de uma sequência de RNA), isto é, substituindo uma desoxitimidina monofosfato por uma desoxiuridina monofosfato.

[041] Na figura 1, aparece destacado em amarelo o potencial domínio de ligação à proteína alvo dos aptâmeros R4 e D4 (PBD, do inglês protein binding domain). Estes PDBs compartilham uma estrutura de alça em forma de grampo na conformação secundária mais provável de ambos aptâmeros R4 e D4 (Figura 1, B e E). Desta maneira, os aptâmeros apresentam uma conformação tridimensional (Figura 1, C e F) que permite o reconhecimento do seu alvo.

[042] Os aptâmeros D4 e R4 são combinados com dois painéis de anticorpos para analisar as marcações e assim identificar células tumorais de amostras de indivíduos por citometria de fluxo. O painel aptaimunológico 1 está formado por um dos aptâmeros combinado com os anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45 e o painel aptaimunológico 2, por um dos aptâmeros combinado com os anticorpos anti-CD44 e anti-CD133. No painel 1, é usada a marcação positiva do anticorpo anti-EpCAM que se liga em moléculas de adesão de células epiteliais e a marcação negativa do anticorpo pan-leucocitário CD45 para analisar a marcação positiva de D4 ou R4 em uma população de células epiteliais não leucocitárias. No painel 2, é usada a marcação positiva dos anticorpos anti-CD44 e anti-CD133 que ligam a células tronco tumorais para analisar a marcação positiva de D4 ou R4 nesta população celular.

[043] Dessa forma, a presente invenção descreve um sistema aptaimunológico compreendendo o aptâmero modificado R4, aptâmero modificado de RNA que compreende a SEQ ID NO. 1, e/ou o aptâmero modificado D4, aptâmero modificado de DNA que compreende a SEQ ID NO. 2; e em que ainda compreende anticorpos específicos, preferencialmente, anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45 ou anti-CD44 e anti-CD133. O sistema aptaimunológico pode estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou pode compreender os seus elementos separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas, as quais serão combinadas de acordo com o uso desejado.

[044] Assim, a(s) composição(ões) descrita compreende os painéis aptaimunológicos 1 e 2 que incluem, por sua vez, uma combinação dos aptâmeros R4 ou D4 e dos anticorpos anti-EpCAM, anti-CD45, anti-CD44 e/ou anti-CD133 com seus respectivos controles.

[045] A invenção descreve, adicionalmente, o uso desse sistema aptaimunológico, baseado na quantificação de CTCs da próstata identificadas em uma amostra biológica por ao menos um dos painéis aptaimunológicos 1 e 2 e no grau de expressão dos alvos dos aptâmeros, a partir da intensidade média de fluorescência nas mesmas células, para indicar a presença de células tumorais circulantes da próstata no indivíduo.

[046] Ao indicar a presença de células tumorais circulantes da próstata no indivíduo com maior vantagem técnica em relação ao exame PSA, o uso do sistema aptaimunológico é útil para auxílio no diagnóstico, triagem, análise de disposição à doença, prognóstico, predição do melhor tratamento, farmacogenômica e monitoramento do tratamento.

[047] A presente invenção proporciona ainda um kit para a detecção de células circulantes de câncer de próstata compreendendo os elementos e instruções de uso necessárias para a detecção das referidas células de câncer de próstata em amostra tecidual ou líquida de um paciente, preferencialmente de sangue periférico. Os elementos incluem o referido sistema aptaimunológico ou ao menos um dos dois painéis aptaimunológicos 1 e 2 com seus respectivos controles e as marcações personalizadas para o citômetro de fluxo de cada usuário. O Kit compreende ainda um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou o(s) aptâmero(s) pode ainda ser marcado diretamente com a adição de um fluorocromo na extremidade 5'. O(s) anticorpo(s) também pode estar marcado com fluorocromo diferente. O Kit pode adicionalmente compreender ao menos um tubo de coleta, os tampões de lise de hemácias, bloqueio e lavagem, sem estarem limitados aos mesmos. Mais particularmente, ao menos um tubo de coleta a vácuo com EDTA, tampão de lise de hemácias com cloreto de amônia com ou sem fixador celular, tampão de bloqueio com plasma humano inativado de sangue tipo AB, tampão fosfato com albumina sérica bovina e azida básica como solução de lavagem e/ou corante de viabilidade com fluorescência diferente dos usados nos painéis.

[048] Estes elementos serão caracterizados nos próximos parágrafos, sem estarem limitados aos mesmos, podendo ser substituídos por um técnico no assunto por elementos equivalentes.

[049] Ainda a presente invenção descreve um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata. As seguintes etapas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8) explicam o processamento das amostras biológicas dos pacientes, de tal maneira que permitem a um técnico no assunto desenvolver a presente invenção proporcionando um método para detectar e quantificar CTCs de câncer de próstata, atribuindo-lhes um valor clínico que permite um melhor gerenciamento médico desta doença. O referido método compreende as etapas de:

[050] (1) A primeira etapa é a coleta da amostra, podendo ser esta uma biópsia tecidual ou líquida (de um fluido corporal), mas preferivelmente a amostra trata-se de sangue periférico por ser uma amostra pouco invasiva, de fácil acesso e operação, e amplamente aceita entre os pacientes. Para a coleta da amostra de sangue periférico, a punção venosa deve ser realizada na fossa cubital do braço, usando tubos para coleta a vácuo com EDTA de 4 mL, de preferência. O primeiro volume coletado, aproximadamente 1 mL, deve ser descartado em um tubo, pois pode conter células epiteliais da pele que interferem na análise da amostra. Assim, um segundo tubo de coleta deve ser usado, mantendo a agulha no braço e trocando os tubos. Este segundo tubo deve conter 4 mL de sangue e deve ser mantido a temperatura ambiente por duas horas, no máximo, até continuar seu processamento na seguinte etapa.

[051] (2) A segunda etapa consiste no isolamento da camada de células mononucleares do sangue periférico. O sangue do segundo tubo deve ser homogeneizado, invertendo várias vezes o tubo suavemente, e em seguida colocado em uma ultracentrífuga a temperatura ambiente durante 15 minutos a uma velocidade de 200 g. Após a centrifugação, a camada de células mononucleares do sangue periférico, também chamada de anel leucocitário, deve ser transferida a um tubo de citometria. O método de separação do anel leucocitário não é limitado a este e podem ser usadas outras técnicas que combinam por exemplo a centrifugação por gradiente de densidade ou a filtragem.

[052] (3) A terceira etapa envolve a lise das hemácias. Esta lise pode ser realizada com tampões desenvolvidos in-house ou disponíveis comercialmente, com cloreto de amônia como componente principal e sem fixadores para manter as células vivas na hora da análise, ou com fixadores como o formaldeído para aumentar a estabilidade das células e facilitar a logística, dependendo das condições de cada laboratório. De preferência, a suspensão celular resultante deve ser lavada duas vezes e estas lavagens devem ser feitas com solução de lavagem (composta por albumina sérica bovina (BSA, do inglês bovine serum albumin) 1% e azida básica 0,1% (m/v) em tampão fosfato (PBS, do inglês phosphate buffer solution) com pH 7,4 e filtrada por membrana de 0,22 μm) após centrifugação de 5 minutos a 200g e temperatura ambiente.

[053] (4) A quarta etapa é o bloqueio de ligações inespecíficas da porção Fc dos anticorpos usados nos painéis com os receptores de superfície das células da amostra. Neste passo, a suspensão celular deve ser incubada por 15 minutos com uma solução de bloqueio com plasma humano inativado de sangue tipo AB 10% (v/v) na solução de lavagem ou uma solução de bloqueio comercial equivalente.

[054] (5) A quinta etapa compreende incubar separadamente a suspensão celular no tampão de bloqueio com o painel aptaimunológico 1 ou 2 e o corante de viabilidade e em seguida lavar com solução de lavagem. Assim, essa etapa é a primeira incubação por 30 minutos a 4°C da suspensão celular na solução de bloqueio com os painéis de aptâmeros e anticorpos que devem ser adicionados em diferentes tubos, segundo as seguintes combinações:

[055] Tubo sem marcação: não adicionar nada.

[056] Tubo painel 1: aptâmero (R4 ou D4), anti-EpCAM e anti-CD45.

[057] Tubo controle painel 1: estreptavidina, isotipo de anti-EpCAM e isotipo de anti-CD45.

[058] Tubo painel 2: aptâmero (R4 ou D4), anti-CD44 e anti-CD133.

[059] Tubo controle painel 2: estreptavidina, isotipo de anti-CD44 e isotipo de anti-CD133.

[060] Os anticorpos, seus correspondentes isotipos e a estreptavidina estão marcados com diferentes fluorocromos, de acordo com os filtros do citômetro de fluxo. Exceto no tubo sem marcação, deve ser adicionado um corante de viabilidade com pico de emissão diferente aos fluorocromos já utilizados. Desta maneira, o citômetro de fluxo usado deve ser capaz de ler pelo menos quatro fluorocromos diferentes. Depois da incubação, a suspensão celular deve ser lavada duas vezes com a solução de lavagem após centrifugação de 5 minutos a 200g e 4 °C.

[061] (6) A sexta etapa compreende marcar indiretamente os aptâmeros com seu ligante estreptavidina e em seguida lavar com solução de lavagem. Essa etapa, portanto, requer a adição de estreptavidina marcada aos tubos com aptâmeros (Tubo aptâmero + painel 1 e Tubo aptâmero + painel 2) e sua incubação por 30 minutos a 4 °C. A marcação indireta dos aptâmeros é preferida na presente invenção, mas no caso de marcação direta dos aptâmeros com fluorocromos, esta etapa deve ser omitida. Após a incubação, a suspensão celular deve ser lavada duas vezes com a solução de lavagem após centrifugação de 5 minutos a 200g, à 4 °C.

[062] (7) A sétima etapa corresponde à leitura da fluorescência no citômetro de fluxo. Uma vez ressuspendidas as células, as amostras são lidas no citômetro de fluxo a partir da determinação de uma janela que deve considerar uma população de até 500.000 leucócitos identificados segundo seu tamanho e granulosidade, desprezando os debris celulares.

[063] (8) A oitava etapa é a análise dos dados obtidos na citometria de fluxo. Dentro desses 500.000 leucócitos, são selecionadas as células únicas (singlets), com relação de área e altura do seu tamanho próxima a 1, excluindo os doublets. Dentro dos singlets, são selecionadas as células vivas pela fluorescência do corante de viabilidade. Dentro das células vivas, são selecionadas individualmente por histograma as marcações específicas de cada painel, segundo os correspondentes controles (estreptavidina e isotipos).

[064] No painel 1, são selecionadas as células com marcação negativa para CD45, dentro desta população são selecionadas as células com marcação positiva para EpCAM e dentro desta subpopulação são selecionadas as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4). No painel 2, são selecionadas as células com marcação positiva para CD133, dentro desta população são selecionadas as células com marcação positiva para CD44 e dentro desta subpopulação são selecionadas as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4).

[065] De preferência, o resultado é a percentagem de células selecionadas em cada painel. O resultado também pode ser o grau de expressão do alvo dos aptâmeros nas mesmas células, calculado a partir da intensidade média de fluorescência. Portanto, a presente invenção também inclui como resultado um índice calculado a partir de expressões matemáticas que usam esses dois parâmetros. O resultado indica a presença de CTCs de origem prostática, servindo como diagnóstico para o câncer de próstata.

[066] Durante o processamento das amostras na presente invenção, as CTCs podem ser submetidas a outros meios de detecção, tais como exame microscópico de fluorescência. Além disso, as CTCs podem ser separadas, por exemplo, por citômetros de fluxo com sorting celular ou por aplicação de beads magnéticas acopladas a estreptavidina, e obtidas como amostras para pesquisa básica para a análise de marcadores adicionais ou outras aplicações clínicas, tais como triagem, análise de disposição à doença, prognóstico, predição do melhor tratamento (tratamento personalizado), farmacogenômica, monitoramento do tratamento, e inclusive desenvolvimento de tratamentos com direcionamento de drogas ou outros agentes terapêuticos.

[067] Dado que a presente invenção é apresentada com certo grau de detalhamento, esta é suscetível de quaisquer modificações, adaptações e aplicações adicionais por um técnico no assunto de acordo com os princípios dos métodos, materiais e usos expostos neste documento. Assim, as reivindicações anexas e o próprio relatório cobrem quaisquer modificações, adaptações e aplicações adicionais abrangidas no escopo da presente invenção.

[068] Daqui em diante, são ressaltados, apenas a título de exemplo, os resultados com os procedimentos que permitem uma melhor compreensão dos materiais, métodos e usos apresentados. Contudo, a presente invenção não é limitada aos seguintes exemplos de concretizações.

Exemplos de Concretizações da Invenção Exemplo 1: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE PERIFÉRICO PARA A ANÁLISE DOS PAINÉIS 1 E 2 POR CITOMETRIA DE FLUXO

[069] O protocolo de pesquisa com Certificado de Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) 71108817.2.0000.5152 foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas com Seres Humanos da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Todos os pacientes convidados a participar do estudo assinaram o correspondente termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) antes de doar as amostras de sangue no Serviço de Urologia do Hospital de Clínicas da UFU para serem encaminhadas ao Laboratório de Nanobiotecnologia do Instituto de Biotecnologia da UFU, onde foram processadas e analisadas.

[070] O critério de inclusão para os pacientes com câncer de próstata foi o diagnóstico de câncer de próstata e para os controles, ausência do diagnóstico de câncer de próstata, o que incluiu indivíduos saudáveis ou com outras doenças da próstata como hiperplasia benigna ou prostatites. Diagnóstico anterior de qualquer tipo de câncer foi o critério de exclusão para todos os participantes da pesquisa.

[071] Amostras de sangue periférico de 34 indivíduos foram coletadas em tubos a vácuo com EDTA para 4 mL (Vacuette Greiner Bio-One, Americana, SP, Brasil) no Hospital de Clínicas da UFU, segundo o protocolo de pesquisa com Certificado de Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) 71108817.2.0000.5152, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas com Seres Humanos da UFU. Dessas amostras, 20 eram de controles e 14 de pacientes com câncer de próstata.

[072] Após homogeneizar e centrifugar os tubos com as amostras a 200 g por 15 minutos a temperatura ambiente, o anel leucocitário de cada amostra foi coletado e dividido em sete tubos para citometria de 5 mL (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha), colocando 90 μL em cada um. A solução de lise de hemácias BD Pharm Lyse (Franklin Lakes, NJ, EUA) foi adicionada (2 mL por tubo) e vortexada para sua incubação por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 200 g por 5 minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado por inversão. O pellet de cada tubo foi ressuspendido duas vezes com 2 mL de solução de lavagem in-house (tampão PBS 1x, pH 7,4, 1% BSA e 0,1% azida básica), homogeneizado e centrifugado a 200 g por 5 minutos a temperatura ambiente.

[073] O pellet foi então ressuspendido em cada tubo teste com 90 μL da solução de lavagem e 10 μL de plasma humano inativado de sangue tipo AB, como solução de bloqueio, e incubado por 15 minutos a temperatura ambiente. Após o bloqueio, foram adicionados os marcadores: o corante de viabilidade (Fixable Viability Stain 620 (FVS620), BD, Franklin Lakes, NJ, EUA), os aptâmeros e os anticorpos nos tubos correspondentes. Os aptâmeros R4 e D4 foram sintetizados (IDT, Coralville, IA, EUA) com suas respectivas sequências e modificações (Figura 1 A e D) e liofilizados. Para seu uso, os aptâmeros foram ressuspendidos em água de injeção até uma solução estoque com uma concentração de 100 μM. Para a marcação dos aptâmeros, foi utilizada estreptavidina ligada ao fluorocromo FITC (SAv-FITC, 405201, BioLegend, San Diego, CA, EUA). Os anticorpos também foram todos adquiridos da empresa BioLegend.

[074] Após homogeneizar os tubos, os marcadores foram incubados a 4 °C por 30 minutos no escuro da seguinte maneira. O primeiro tubo (Tubo 1) foi incubado sem marcadores, servindo como controle. O segundo tubo (Tubo 2) foi incubado com 0,1 μL de FVS620, 0,2 μL de R4, 0,25 μL de EpCAM-APC (324208) e 0,25 μL de CD45-PE (368510). O terceiro tubo (Tubo 3) foi incubado com 0,1 μL de FVS620, 0,2 μL de D4, 0,25 μL de EpCAM-APC (324208) e 0,25 μL de CD45-PE (368510). O quarto tubo (Tubo 4) foi incubado com 0,1 μL de FVS620; 0,2 μL de SAv-FITC, 0,25 μL do isotipo de EpCAM IgG2bK-APC (400322) e 0,25 μL do isotipo de CD45 IgG1K-PE (400114) . O quinto tubo (Tubo 5) foi incubado com 0,1 μL de FVS620, 0,2 μL de R4, 0,25 μL de CD44-APC (338806) e 0,25 μL de CD133-PE (372804). O sexto tubo (Tubo 6) foi incubado com 0,1 μL de FVS620, 0,2 μL de D4, 0,25 μL de CD44-APC (338806) e 0,25 μL de CD133-PE (372804). O sétimo tubo (Tubo 7) foi incubado com 0,1 μL de FVS620; 0,2 μL de SAv-FITC, 0,25 μL do isotipo de CD44 IgG1K-APC, (400120) e 0,25 μL do isotipo de CD133 IgG1K-PE (400114). Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 200 g por 5 minutos a 4 °C e o sobrenadante descartado por inversão. O pellet de cada tubo foi ressuspendido duas vezes com 2 mL da solução de lavagem, homogeneizado e centrifugado a 200 g por 5 minutos a 4 °C. Todos os tubos foram ressuspendidos em 100 μL de solução de lavagem.

[075] O primeiro, quarto e sétimo tubo foram mantidos no escuro. O segundo, terceiro, quinto e sexto tubo foram homogeneizados e incubados a 4 °C por 30 minutos no escuro com 0,2 μL de SAv-FITC. Após a incubação, estes tubos foram centrifugados a 200 g por 5 minutos a 4 °C e o sobrenadante descartado por inversão. O pellet de cada tubo foi ressuspendido duas vezes com 2 mL da solução de lavagem, homogeneizado e centrifugado a 200 g por 5 minutos a 4 °C. Estes tubos foram ressuspendidos em 100 μL da solução de lavagem e mantidos no escuro. Assim, as amostras estão prontas para sua análise. A figura 2 representa o diagrama de fluxo para o processamento destas amostras.

Exemplo 2: ANÁLISE DOS DADOS CITOMÉTRICOS DOS PAINÉIS 1 E 2

[076] Para a análise da marcação por citometria de fluxo, foi usado o citômetro Accuri C6 (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) com o laser azul de 488 nm e os filtros 533/30, 585/40 e 670 LP para ler fluorescência de FITC (FL-1), PE (FL-2) e FVS620 (FL-3) respectivamente, e com o laser vermelho de 640 nm e o filtro 670 LP para ler a fluorescência de APC (FL-4) .

[077] A figura 3 ilustra de maneira geral como foi feita esta análise no programa FlowJo, versão X 10.0.7r2 para Windows. Primeiramente, foi selecionada uma população de 500 mil leucócitos a partir dos dados citométricos do primeiro tubo, identificada segundo seu tamanho e granulosidade, desprezando os debris celulares. Desta população, foram selecionados os singlets, como aqueles leucócitos com relação entre a área e altura do seu tamanho próxima a 1, excluindo os doublets. Dentro dos singlets, foram selecionadas as células vivas pela fluorescência do FVS620, a partir da ausência de marcação nos dados do primeiro tubo. Estas populações foram aplicadas nos dados citométricos dos outros tubos, do segundo ao sétimo (Figura 3A) .

[078] Dentro das células vivas do segundo ao sétimo tubo, foram determinadas individualmente por histograma as marcações específicas de cada painel. A partir das marcações dos isotipos dos anticorpos e da SAv-FITC do quarto tubo, foram estabelecidas as marcações de CD45 e EpCAM e dos alvos dos aptâmeros no segundo e no terceiro tubo (Painel 1): foram identificadas as células negativas para CD45, dentro destas células foram identificadas as células positivas para EpCAM e dentro desta subpopulação, foram identificadas as células com marcação positiva para os aptâmeros (no segundo tubo para R4 e no terceiro para D4) (Figura 3B).

[079] A partir das marcações dos isotipos dos anticorpos e da SAv-FITC do sétimo tubo, foram estabelecidas as marcações de CD133 e CD44 e dos alvos dos aptâmeros no quinto e no sexto tubo (Painel 2): foram identificadas as células positivas para CD133, dentro destas células foram identificadas as células positivas para CD44 e dentro desta subpopulação, foram identificadas as células com marcação positiva para os aptâmeros (no quinto tubo para R4 e no sexto para D4) (Figura 3C).

[080] A partir desta análise foram obtidos os dados da percentagem de células marcadas com cada um dos aptâmeros em cada painel (do painel 1, células CD45- EpCAM+ R4/D4+ e do painel 2, células CD133+ CD44+ R4/D4+) e dessas células, os dados da intensidade média da florescência (MFI, do inglês Mean Fluorescence Intensity) e da intensidade mediana da fluorescência (MDFI, do inglês Median Fluorescence Intensity) de cada aptâmero.

[081] A comparação entre os tipos de amostra foi feita pelo teste de Mann-Whitney para variáveis não paramétricas e pelo teste t não pareado para variáveis paramétricas. O melhor ponto de corte (cutoff) das variáveis foi calculado em base à análise da curva ROC (do inglês Receiver Operating Characteristic). O desempenho diagnóstico das variáveis foi determinado pelo teste exato de Fisher com o método de Wilson-Brown para calcular os intervalos de confiança de 95% (IC de 95%). Todas as análises estatísticas foram desenvolvidas no programa Graph Pad Prism, versão 7.0 para Windows, considerando o valor de p menor que 0,05 como significante.

Exemplo 3: RESULTADOS DA MARCAÇÃO DO PAINEL 1

[082] A informação obtida das células marcadas com o painel 1 foi a percentagem das células negativas para CD45 e positivas para EpCAM marcadas com a fluorescência dos aptâmeros R4 e D4, separadamente, e suas respectivas intensidades em termos de média (MFI) e mediana (MDFI) expressas em unidades arbitrárias (u. a.) (Tabela 1).

[083] A diferença das variáveis entre os grupos de indivíduos analisados, controles e pacientes, está representada na figura 4 A, C e E para o aptâmero R4 e na figura 5 A, C e E para o aptâmero D4 no painel 1. As barras representam a média e o desvio padrão em cada grupo, sendo a linha vermelha o valor do cutoff (plotado à direita do eixo Y) , usado para a curva ROC representada à direita (Figura 4 B, D e F e Figura 5 B, D e F). As variáveis que apresentaram diferença estatística entre os grupos foram aquelas relacionadas ao aptâmero R4: % de células R4+ (0,0033), MFI de R4 (0,0249) e MFDI de R4 (0,0164).

[084] Tabela 1: Percentagem de células positivas para o alvo do aptâmero R4 ou D4 e seu grau de expressão na população de células CD45- EpCAM+.

[085] As melhores curvas ROC dos cutoffs definidos para as variáveis analisadas no painel 1, com área sob a curva ROC (AUC, do inglês area under the curve ROC) maior que 0,7, foram na seguinte ordem as de % R4 + , MDFI de R4 e MFI de R4 (Figura 4 B, F e D). Portanto, o teste diagnóstico para câncer de próstata resultante da análise da variável % R4+ no painel 1 seria o mais preciso.

[086] O teste exato de Fisher mostrou que os parâmetros diagnósticos para o câncer de próstata % R4+, MFI e MDFI de R4 em células CD45- EpCAM+ foram estatisticamente significantes (destacados em negrito na Tabela 2). Estes parâmetros apresentaram a mesma sensibilidade, sendo a percentagem de células R4+ o parâmetro mais específico.

[087] Tabela 2: Desempenho diagnóstico dos aptâmeros R4 e D4 em células CD45- EpCAM+ para o câncer de próstata.

[088] A performance das variáveis relacionadas ao aptâmero R4 no painel 1 em testes diagnósticos em um contexto de rastreamento (ou screening) de câncer de próstata seria a mesma para os cutoffs avaliados se apenas considerarmos a sensibilidade. Entretanto, para a variável % R4+ a razão de verossimilhança é maior e consequentemente a acurácia do teste diagnóstico também. Já para o contexto onde é preciso um teste confirmatório para decidir a realização de um procedimento invasivo, por exemplo uma prostatectomia radical, o resultado da variável % R4+ seria o mais indicado para tomar a decisão. Assim, a chance de falsos positivos seria menor evitando sobretratamentos lesivos ou biópsias desnecessárias.

Exemplo 4: RESULTADOS DA MARCAÇÃO DO PAINEL 2

[089] Os dados extraídos das células incubadas com o painel 2 consistiram na percentagem da população de células positivas simultaneamente para CD133 e CD44 e que foram marcadas com a fluorescência de cada aptâmero e suas respectivas intensidades média e mediana em u. a. (Tabela 3).

[090] Tabela 3: Percentagem de células positivas para R4 ou D4 e o grau de expressão do alvo de cada aptâmeros na população de células CD133+ CD44+.

[091] As figuras 6 e 7 (A, C e E) representam a diferença das variáveis entre os indivíduos controles e pacientes do painel 2, para o aptâmero R4 e D4, respectivamente. As barras representam a média e o desvio padrão em cada grupo, sendo a linha vermelha o valor do cutoff (plotado à direita do eixo Y) da curva ROC representada à direita (Figuras 6 e 7, B, D e F). A diferença entre os grupos foi estatisticamente significante para a percentagem de células R4+ (0,03), MFI de R4 (0,047) e MFI de D4 (0,0026). Assim, os valores da percentagem de células R4+ e da MFI de R4 foram estatisticamente significantes nos dois painéis apresentados.

[092] A melhor curva ROC do painel 2 foi a da variável MFI de D4, com AUC 0,8 (Figura 7 D), superando às variáveis do painel 1. Também mostraram uma boa curva ROC as variáveis % R4+, e MFI de R4 para o painel 2 (Figura 6 B e D), as quais também mostram um bom desempenho no painel 1.

[093] Os parâmetros diagnósticos para o câncer de próstata MFI de R4, % D4+, MFI e MDFI de D4 em células CD133+ CD44+ foram estatisticamente significantes segundo o teste exato de Fisher (destacados em negrito na Tabela 4). A sensibilidade da variável MFI de D4 em células CD133+ CD44+ foi a maior dos dois painéis seguida pela MFI de R4 em células CD133+ CD44+. A especificidade da MFI de D4 em células CD133+ CD44+ também foi superior à das outras variáveis do mesmo painel e igual à da % de células R4+ em células CD45- EpCAM+.

[094] Tabela 4: Desempenho diagnóstico dos aptâmeros R4 e D4 em células CD133+ CD44+ para o câncer de próstata.

[095] Nas amostras analisadas, a variável MFI de D4 no painel 2 revelou-se como o melhor parâmetro diagnóstico para o câncer de próstata, inclusive com a maior razão de verossimilhança e acurácia. Esta variável poderia ser usada tanto para o rastreamento de câncer de próstata, quanto para a diferenciação de tumores indolentes, com baixo potencial de disseminação, e tumores com comportamentos mais agressivos.

Exemplo 5: RESULTADO SOMENTE USANDO ANTICORPOS DA PLATAFORMA COMERCIAL CELLSEARCH COMPARADO COM RESULTADO USANDO PLATAFORMA PROPOSTA NO PRESENTE PEDIDO.

[096] A Figura 8 mostra o resultado de um teste realizado usando os anticorpos para enriquecimento de CTCs da plataforma comercial CellSearch, aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration - agência regulatória nos EUA), mostrando a porcentagem de células CD45- e EpCAM+ que seriam detectadas usando um método semelhante ao proposto pela presente invenção.

[097] Fica claro na análise dos dados apresentados na FIGURA 8 que usando os anticorpos para enriquecimento do CellSearch na metodologia desenvolvida, não fomos capazes de diferenciar os pacientes controle sem câncer de próstata dos pacientes com câncer de próstata. Além da necessidade de usar equipamentos exclusivos da plataforma CellSearch que envolvem o uso de técnicas mais complexas e uma combinação maior de anticorpos, o CellSearch não detecta CTCs em pacientes com câncer de próstata localizado; nem muito menos detecta quando usado em um método de diagnóstico simplificado e de baixo-custo como o proposto pelo presente pedido de patente.

[098] Por outro lado, quando usamos o sistema aptaimunológico proposto com um dos painéis aqui descritos, como no exemplo demonstrado na Figura 9 onde usamos o aptâmero modificado D4 com anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45 (painel 1), conseguimos identificar os pacientes tratados livres de doença residual mínima, dos paciente tratados com metástase, bem como fazer o diagnóstico de pacientes não tratados mas com câncer de próstata. O cutoff das variáveis foi calculado em base à análise da curva ROC (OR= 28.6 (IC95%=1.3-600); P<0.03).

[099] Isso demonstra a capacidade do sistema aptaimunológico proposto de ser usado não somente no diagnóstico de câncer de próstata, mas também para o prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento, ajudando assim na tomada de decisão para escolha da melhor terapia a ser usada.

[100] Portanto, o presente sistema aptaimunológico mostrou potencial diagnóstico superior ao PSA, o biomarcador de referência para o câncer de próstata. As variáveis analisadas neste sistema poderiam ser aplicadas para diminuir o sobrediagnóstico no rastreamento do câncer de próstata que chega até 67% de falsos positivos em casos de pacientes com hiperplasia benigna da próstata ou prostatites e PSA maiores que 4,0 ng/mL (LOEB et al., 2014) e até cerca de 30% de falsos negativos em pacientes com câncer de próstata que não são diagnosticados pelo PSA (TRICOLI; SCHOENFELDT; CONLEY, 2004).

[101] Comparando o PSA com a MFI de D4 em células CD133+ CD44+ D4+ que apresentou apenas 21,43% de falsos positivos e 15% de falsos negativos, esta variável demonstrou ser um biomarcador mais efetivo para a detecção de câncer de próstata. Deste modo, o uso clínico do presente sistema aptaimunológico otimizaria os recursos financeiros destinados ao câncer de próstata nos sistemas de saúde, tanto públicos quanto privados, diminuiria a mortalidade desta doença e melhoraria a qualidade de vida dos pacientes.

[102] Desta forma o presente pedido de patente descreve aptâmeros modificados e um sistema aptaimunológico que compreende os referidos aptâmeros modificados R4 e/ou D4 combinado com ao menos um anticorpo específico, para uso em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata. O aptâmero modificado, R4 é um aptâmero modificado de RNA que compreende a SEQ ID NO. 1 e o aptâmero modificado D4 é um aptâmero modificado de DNA e compreende a SEQ ID NO. 2, em que os aptâmeros foram modificados com uma molécula de biotina acoplada na extremidade 5' e um nucleotídeo monofosfato 2'desoxitimidina invertido na extremidade 3' (SEQ ID No 3 e SEQ ID No 4, respectivamente).

[103] Em uma modalidade ao menos um anticorpo específico é selecionado do grupo que consiste de: anticorpos anti-EpCAM; anti-CD45; anti-CD44; e anti-CD133. Preferencialmente, anticorpo anti-EpCAM e anti-CD45 ou anticorpo anti-CD44 e anti-CD133. O sistema ainda compreende a adição de um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou os aptâmeros podem ainda ser marcado diretamente com a adição de um fluorocromo na extremidade 5'. Os anticorpos também estão marcados com fluorocromos diferentes, de acordo com os filtros do citômetro de fluxo.

[104] O referido sistema aptaimunológico pode estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou pode compreender os seus elementos separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas, as quais serão combinadas de acordo com o uso desejado.

[105] Em outra modalidade o presente pedido de patente descreve o Painel aptaimunológico que compreende o sistema aptaimunológico supramencionado e seus respectivos controles para uso em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata. O referido painel aptaimunológico consistindo do painel 1 e/ou painel 2, em que o painel 1 compreende o aptâmero modificado R4 ou D4 combinado com os anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45, marcados com diferentes fluorocromos e o painel 2 compreende o aptâmero modificado R4 ou D4 combinado com os anticorpos anti-CD44 e anti-CD133 marcados com diferentes fluorocromos. Os respectivos controles compreendem: no painel 1 estreptavidina, isotipo de anti-EpCAM e isotipo de anti-CD45 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes e no painel 2 estreptavidina, isotipo de anti-CD44 e isotipo de anti-CD133 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes.

[106] Em outra modalidade o presente pedido descreve o Kit para a detecção de células circulantes de câncer de próstata em amostra tecidual ou líquida de um paciente em que compreende o referido sistema aptaimunológico supramencionado e instruções de uso. O referido Kit pode compreender ao menos um dos painéis aptaimunológicos supramencionados, painel 1 e/ou painel 2 e instruções de uso. O referido Kit pode compreender ainda um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou os aptâmeros podem ainda ser marcado diretamente com a adição de um fluorocromo na extremidade 5'. Os anticorpos também podem estar marcados com fluorocromos diferentes. Adicionalmente os elementos que compõem o referido Kit podem estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas, as quais serão combinadas de acordo com o uso desejado. Adicionalmente o referido Kit ainda pode compreender ao menos um tubo de coleta a vácuo com EDTA, tampão de lise de hemácias com cloreto de amônia e com ou sem fixador celular, tampão de bloqueio com plasma humano inativado de sangue tipo AB, tampão fosfato com albumina sérica bovina e azida básica como solução de lavagem e corante de viabilidade com fluorescência diferente dos usados nos painéis.

[107] Em ainda outra modalidade se descreve o método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata que compreende etapas de processamento e análise de amostras de indivíduos humanos com o uso do referido sistema aptaimunológico; ou uso de ao menos um dos referidos painéis aptaimunológicos; ou uso do referido kit, podendo a amostra ser uma biópsia tecidual ou líquida de um fluido corporal, mas preferivelmente em que a amostra se trata de sangue periférico.

[108] O Método, preferencialmente compreende as etapas sequenciais de:
isolar a camada de células mononucleares da amostra de sangue periférico após sua centrifugação ou após outro método adequado de separação do anel leucocitário;
transferir a camada de células mononucleares para um tubo de citometria;
lisar as hemácias e em seguida lavar a suspensão celular resultante usando, respectivamente, um tampão de lise cou ou sem fixador e uma solução de lavagem;
bloquear as ligações inespecíficas da porção Fc dos anticorpos usados nos painéis, pela incubação da suspensão celular com uma solução de bloqueio;
incubar separadamente a suspensão celular no tampão de bloqueio com os painéis aptaimunológicos e o corante de viabilidade e em seguida lavar com solução de lavagem;
marcar indiretamente os aptâmeros com seu ligante estreptavidina e em seguida lavar com uma solução de lavagem;
ler a fluorescência de leucócitos das amostras processadas, a partir da identificação dos mesmos por seu tamanho e granulosidade em um citômetro de fluxo.

[109] O método compreende, adicionalmente, após a leitura em citômetro de fluxo, analisar os dados da citometria obtidos para identificação de células tumorais circulantes (CTCs) da próstata, em que compreende:
selecionar os singlets, dentre os singlets selecionar as células vivas, e dentre as células vivas selecionar individualmente por histograma as marcações específicas de cada painel, segundo seus controles correspondentes;
no painel aptaimunológico 1, selecionar as células com marcação negativa para CD45 e dentre elas, selecionar as células com marcação positiva para EpCAM e dentre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4);
no painel aptaimunológico 2, selecionar as células com marcação positiva para CD133 e dentre elas, selecionar as células com marcação positiva para CD44 e de entre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4).

[110] O método, durante o processamento das amostras, as CTCs podem ser submetidas a outros meios de detecção, tais como exame microscópico de fluorescência.

[111] Em ainda outra modalidade do presente pedido de patente se descreve o uso do referido sistema aptaimunológico, do referido painel aptaimunológico, ou do referido Kit em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata.

[112] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.

[113] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente invenção, equivalentes aos aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

Claims

Aptâmero modificado caracterizado pelo fato de que é o aptâmero de RNA modificado R4 que compreende a SEQ ID NO. 1 ou é o aptâmero de DNA modificado D4 que compreende a SEQ ID NO. 2.
Aptâmero modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o referido aptâmero ser modificado com uma molécula de biotina acoplada na extremidade 5' e um nucleotídeo monofosfato 2'desoxitimidina invertido na extremidade 3' .
Sistema aptaimunológico caracterizado pelo fato de que compreende o aptâmero modificado R4 e/ou D4 tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, combinado com ao menos um anticorpo específico, para uso em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata.
Sistema aptaimunológico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ao menos um anticorpo específico é selecionado do grupo que consiste de: anticorpos anti-EpCAM; anti-CD45; anti-CD44; e anti-CD133.
Sistema aptaimunológico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ao menos um anticorpo são, preferencialmente, anticorpo anti-EpCAM e anti-CD45 ou anticorpo anti-CD44 e anti-CD133.
Sistema aptaimunológico, de acordo com qualquer uma das reivindicação 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o sistema ainda compreende a adição de um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou os aptâmeros podem ainda ser marcado diretamente com a adição de um fluorocromo na extremidade 5'.
Sistema aptaimunológico, de acordo com qualquer uma das reivindicação 3 a 5, caracterizado pelo fato de que os anticorpos também estão marcados com fluorocromos diferentes, de acordo com os filtros do citômetro de fluxo.
Sistema aptaimunológico, de acordo com qualquer uma das reivindicação 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o sistema aptaimunológico pode estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou pode compreender os seus elementos separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas, as quais serão combinadas de acordo com o uso desejado.
Painel aptaimunológico caracterizado pelo fato de que compreende o sistema aptaimunológico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 8 e seus respectivos controles para uso em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata.
Painel aptaimunológico de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de que consiste do painel 1 e/ou painel 2, em que o painel 1 compreende o aptâmero modificado R4 ou D4 combinado com os anticorpos anti-EpCAM e anti-CD45, marcados com diferentes fluorocromos e o painel 2 compreende o aptâmero modificado R4 ou D4 combinado com os anticorpos anti-CD44 e anti-CD133 marcados com diferentes fluorocromos.
Painel aptaimunológico de acordo com qualquer uma das a reivindicação 9 ou 10 caracterizado pelo fato de que os respectivos controles compreendem: no painel 1 estreptavidina, isotipo de anti-EpCAM e isotipo de anti-CD45 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes e no painel 2 estreptavidina, isotipo de anti-CD44 e isotipo de anti-CD133 marcados com os mesmos fluorocromos dos seus correspondentes.
Kit para a detecção de células circulantes de câncer de próstata em amostra tecidual ou líquida de um paciente caracterizado pelo fato de que compreende o sistema aptaimunológico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 8 e instruções de uso.
Kit para a detecção de células circulantes de câncer de próstata em amostra tecidual ou líquida de um paciente caracterizado pelo fato de que compreende ao menos um dos painéis aptaimunológicos tal como definidos em qualquer uma das reivindicações 9 a 11 e instruções de uso.
Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um complexo ligante de biotina, mais particularmente a estreptavidina marcada com um fluorocromo ou o(s) aptâmero(s) pode ainda ser marcado diretamente com a adição de um fluorocromo na extremidade 5', o(s) anticorpo(s) também pode estar marcado com fluorocromo diferente.
Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que os elementos do kit podem estar na forma de uma composição ou composição farmacêutica, ou separados em mais de uma composição ou composições farmacêuticas, as quais serão combinadas de acordo com o uso desejado.
Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que pode compreender ainda ao menos um tubo de coleta a vácuo com EDTA, tampão de lise de hemácias com cloreto de amônia com ou sem fixador celular, tampão de bloqueio com plasma humano inativado de sangue tipo AB, tampão fosfato com albumina sérica bovina e azida básica como solução de lavagem e/ou corante de viabilidade com fluorescência diferente dos usados nos painéis.
Método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata caracterizado pelo fato de que compreende etapas de processamento e análise de amostras de indivíduos humanos com o uso do sistema aptaimunológico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 8; ou uso de ao menos um dos painéis aptaimunológicos tal como definidos em qualquer uma das reivindicações 9 a 11; ou uso do kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 16, podendo a amostra ser uma biópsia tecidual ou líquida de um fluido corporal, mas preferivelmente em que a amostra se trata de sangue periférico.
Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de:
isolar a camada de células mononucleares da amostra de sangue periférico após sua centrifugação ou após outro método adequado de separação do anel leucocitário;
transferir a camada de células mononucleares para um tubo de citometria;
lisar as hemácias e em seguida lavar a suspensão celular resultante usando, respectivamente, um tampão de lise com ou sem fixador e uma solução de lavagem;
bloquear as ligações inespecíficas da porção Fc dos anticorpos usados nos painéis, pela incubação da suspensão celular com uma solução de bloqueio;
incubar separadamente a suspensão celular no tampão de bloqueio com os painéis aptaimunológicos e o corante de viabilidade e em seguida lavar com solução de lavagem;
marcar indiretamente os aptâmeros com seu ligante estreptavidina e em seguida lavar com uma solução de lavagem;
ler a fluorescência de leucócitos das amostras processadas, a partir da identificação dos mesmos por seu tamanho e granulosidade em um citômetro de fluxo.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, após a leitura em citômetro de fluxo, analisar os dados da citometria obtidos para identificação de células tumorais circulantes (CTCs) da próstata.
Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a identificação de células tumorais circulantes (CTCs) da próstata compreende:
selecionar os singlets, dentre os singlets selecionar as células vivas, e dentre as células vivas selecionar individualmente por histograma as marcações específicas de cada painel, segundo seus controles correspondentes;
no painel aptaimunológico 1, selecionar as células com marcação negativa para CD45 e dentre elas, selecionar as células com marcação positiva para EpCAM e dentre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4);
no painel aptaimunológico 2, selecionar as células com marcação positiva para CD133 e dentre elas, selecionar as células com marcação positiva para CD44 e de entre estas selecionar as células com marcação positiva para os aptâmeros (R4 ou D4).
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que, durante o processamento das amostras, as CTCs podem ser submetidas a outros meios de detecção, tais como exame microscópico de fluorescência.
Uso do aptâmero modificado conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, do sistema aptaimunológico conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 3 a 8, do painel aptaimunológico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11 ou do kit conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 12 a 16 caracterizado pelo fato de que é em um método de diagnóstico, prognóstico, predição do melhor tratamento e/ou monitoramento do tratamento do câncer de próstata.