CN111996260A - 一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途 - Google Patents
一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，该生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa‑miR‑628‑3p/hsa‑miR‑941和hsa‑miR‑584‑5p/hsa‑mir‑106b‑3p，作为区分肝细胞癌和非肝细胞癌的生物标志物。本发明首次提出并验证了血液外囊泡miRNA作为生物标志物表达水平区分肝癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，对于肝癌早期诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及疾病早期检测技术领域，尤其涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂。
背景技术
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和混合细胞癌，其中75％-85％为肝细胞癌。由于肝细胞癌的侵袭性、生长快、起病隐匿，多数患者确诊时已为晚期，手术的效果大大降低，可供选择的治疗方法也很少。肝细胞癌的预后较差，患者五年生存率小于10％且复发率较高，可手术切除的早期患者五年生存率大幅度提高接近70％。肝细胞癌的主要危险因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、非酒精性脂肪肝疾病、黄曲霉毒素、饮酒等，在我国关键的决定因素是慢性HBV感染和黄曲霉毒素暴露。同时，80％-90％的肝细胞癌病例是发生在肝硬化背景下。并且对肝细胞癌伴随HBV感染和肝硬化的患者进行筛查和监测可以降低肝细胞癌患者的死亡率。因此，如何准确高效的对早期肝细胞癌患者进行鉴别诊断在临床上具有重要意义。
目前，肝细胞癌的诊断方法有胸部影像学、内窥镜超声引导下细针穿刺活检(EUS-FNA)以及甲胎蛋白(AFP)检测等，但这些方法的检测效果在对肝细胞癌诊断时均有一定的局限性。胸部影像学检查方法包括超声造影(CEUS)、CT、核磁共振成像(MRI)和PET-CT等，但影像学检测方法的灵敏度和特异性有限，CT和MRI仅当结节大于1-2cm时诊断价值较高。据报道对于大于2cm的肿瘤MRI的准确率为90％，在小于2cm的肿瘤中准确率降低到33％。而EUS-FNA是一种侵入性检测方法容易引起腹腔内的感染、出血和肿瘤扩散。AFP是基于血液的肿瘤标志物被广泛用于肝细胞癌的早诊和预后，据报道血清中AFP水平大于200ng/mL时对于伴随肝硬化的肝细胞癌患者诊断具有很高的特异性，但只有三分一的肝细胞癌患者血清AFP水平大于100ng/mL，而且AFP诊断的敏感性较低常漏诊早期小肿瘤的患者，无法作为有效的鉴别诊断标志物。因此，急需开发基于微创诊断方法的肿瘤标志物来提高肝细胞癌早期鉴别诊断的效果。
胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由多种不同细胞释放到细胞外的囊泡，可分为多种类型。其中，一类小型胞外囊泡，又称外泌体，是一种直径约30-150nm的膜性囊泡。胞外囊泡是由核酸、蛋白质、脂质等组成几乎存在于所有的生物体液中。外周血中游离的胞外囊泡作为一种重要液体活检形式已得到广泛的关注和深入研究，近期，研究显示来源于血液胞外囊泡的miRNA被认为是一种潜在的诊断标志物应用于肝细胞癌的早期诊断。Won Sohn等人的研究证实与慢性乙肝和肝硬化组相比肝细胞癌患者血清胞外囊泡miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224表达是显著性升高的。而Lin huajun等人的研究表明在与HBV感染和肝硬化组相比肝细胞癌患者血浆胞外囊泡miR-26a、miR-29c、miR-21表达是显著性下调的。然而，这些研究样本量较小、检测胞外囊泡miRNA的数量较少、或缺少独立的验证试验、基于芯片或RT-PCR技术无法发现胞外囊泡中未知的miRNA，导致缺乏来源于血液胞外囊泡的miRNA作为有效的生物标志物对肝细胞癌进行早期鉴别诊断。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提出一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，利用血液外囊泡miRNA作为生物标志物区分非肝细胞癌和肝细胞癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，能够辅助肝癌早期诊断。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合。
进一步地，所述hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合生物标志物在肝细胞癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。
进一步地，所述对照样本为非肝细胞癌患者样本。
本发明还涉及一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如上所述的任一种检测试剂。
本发明还涉及一种基于hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p生物标志物的肝细胞癌和非肝细胞癌分类模型，所述模型包括：
其中，Risk-Score为非肝细胞癌和肝细胞癌的风险预测值；x为log2(hsa-miR-628-3p表达量和hsa-miR-941表达量比值)；y为log2(hsa-miR-584-5p表达量和hsa-mir-106b-3p表达量比值)。
本发明还涉及一种使用如上所述检测试剂在制备通过如下方法进行肝癌早期诊断的试剂盒中的用途，其中所述方法包括以下步骤：
S1、采集影像学检测结果疑似为肝细胞癌患者的外周血样本，提取外周血样本中的胞外囊泡并检测外周血胞外囊泡中miRNA的存在；
S2、测量所述检测试剂所对应生物标志物的表达值；
S3、将获得的表达值带入如上所述的模型中，计算得到疑似患者所患为肝细胞癌或非肝细胞癌的风险预测值。
进一步地，所述步骤S2包括使用small RNA测序获得生物标志物的表达值。
本发明的有益效果为：
采用本发明所述用于肝癌早期诊断的生物标志物检测试剂能够从疑似患者外周血中针对性的获取胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p，能够建立具有高特异性和高敏感性预测的肝细胞癌和非肝细胞癌分类模型，在区分非肝细胞癌和肝细胞癌患者的应用中具有高敏感性和高阴性预测值，特别是可用于结合影像学检测提高肝癌早诊敏感性、降低假阴性。
附图说明
图1为血液胞外囊泡电镜结果。
图2为血液胞外囊泡特征性蛋白表达。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。
本发明涉及到的所有miRNA都是公开在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)被注释过的成熟的miRNA。
本发明的血液胞外囊泡miRNA生物标志物的表达水平建立鉴别模型来协助提高肝癌早期诊断的敏感性和准确性，降低假阴性，减少早期肝癌患者的漏诊，减少患者的额外痛苦、减轻家庭和社会负担。
本发明所述检测试剂针对性检测的血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的筛选过程包括以下步骤：
(1)研究队列及临床信息
本研究共纳入两个研究队列共计62例影像学检测结果疑似为肝癌的患者，于术前采集患者的血液样本。每个入组的患者于术后根据病理检查结果获取准确的诊断。患者入组时间为2017年8月至2018年5月，随机将患者分入训练队列和验证队列。如表1所示，训练队列共纳入31例患者，包括20例非肝细胞癌患者和11例肝细胞患者；验证队列入组31例患者，包括18例非肝细胞癌患者和13例肝细胞患者。表1展示了患者的临床信息，包括性别、年龄、饮酒史及病理诊断结果等相关临床信息。分析结果表明两组患者间的性别、年龄、饮酒史及良恶性患者比例并无显著差异。
表1患者临床信息
(2)血液胞外囊泡的提取和特征
S21、血液收集和胞外囊泡的提取
本研究所有的非肝细胞癌和肝细胞癌患者均在手术或药物治疗前采集血液样本，将采集的血液样本保存在抗凝血的真空采血管中(REF367863,BD,USA)，随后样本在一小时内4℃条件下寄送。对收到的血样首先在4℃条件下1600g离心10min，离心完成后小心的转移上清液到新的1.5ml离心管中，同时对样本的溶血等级进行判定并记录，将溶血等级小于5级的样本纳入后续研究，其次将上清液在4℃条件下16000g离心15min，离心完成后转移上清液并分装成每管1ml，-80℃冰箱中保存待用。对于非肝细胞癌和肝细胞癌患者的血浆胞外囊泡提取，采用思路迪自主研发的外泌体分离试剂。冻存的血浆样本取出后，先放置于37℃金属浴中孵育，待血浆样本完全融化后，12000g，4℃离心10min，离心完成后转移上清液到0.45μm tube filter(Costar,CLS8163-100EA,Corning,USA)和0.22μm tube filter(Costar,CLS8161-100EA,USA)中，在4℃条件下12000g离心5min收集过滤液。向过滤液中加入1/4体积的外泌体沉淀剂(REX015S,3DMed,Shanghai,China)，涡旋混匀后4℃孵育30min，随后4700g，4℃离心30min，离心完成后胞外囊泡会聚集在管底，弃去上清液并加入200μlPBS(phosphate buffer saline)吹打重悬胞外囊泡。
对于本领域技术人员来说，胞外囊泡的提取方法不限定于上述操作步骤，现有技术中的适合方法如超速离心法、梯度密度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法等，以及在如上述方法中采用其他商品化外泌体沉淀剂均是可行的，本领域技术人员可以预见其所得胞外囊泡应具有类似特征而不因提取方法的改变而存在差异。
S22、血液胞外囊泡的特征
为了检测非肝细胞癌和肝细胞癌患者血液中胞外囊泡的特征，本专利采用透射电子显微镜检测胞外囊泡的形态，对于胞外囊泡特征蛋白表达水平的检测采用免疫杂交实验。血液胞外囊泡形态特征鉴定：首先将分离得到的胞外囊泡用PBS重悬后，加入4％多聚甲醛进行胞外囊泡的固定，固定完成之后转移到碳包覆的电子显微镜铜网上。然后用PBS清洗铜网2次，之后用含甘氨酸(50mM)的PBS清洗铜网3min，其次用含0.5％BSA的PBS清洗铜网10min，最后用2％醋酸铀酰染色铜网，染色完成后采用透射电镜(H-7650,Hitachi High-Technologies,Japan)对胞外囊泡形态进行特征分析。检测结果如图1所示，可见到胞外囊泡呈现典型的“马蹄状”形态。
胞外囊泡特征蛋白检测：对于胞外囊泡特征蛋白表达水平进行检测时，采用外泌体沉淀剂(REX015S,3DMed,Shanghai,China)来沉淀胞外囊泡，采用RIPA裂解液(P0013B,Beyotime,Shanghai,China)得到胞外囊泡的蛋白，并用BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher Scientific,USA)对胞外囊泡的蛋白浓度进行检测。采用4％-20％SDS-PAGE gel(#4561095,Bio-Rad,USA)恒压电泳1h左右，PVDF膜(Millipore,Billerica,MA,USA)200mA恒流电转1h左右，5％脱脂奶粉封闭过夜，一抗室温孵育2h，二抗室温孵育40min，最后用化学发光系统(Tanon-5200Multi,Shanghai,China)检测抗体的结合。本发明所用一抗、二抗信息如下：CD9(1:2000diluted,ab92726,Abcam,England)、CD63(1:1000diluted,ab216130,Abcam,England)、羊抗兔源二抗(A0208,Beyotime,Shanghai,China)。检测结果如图2所示，表明本发明提取的代表性样本中胞外囊泡特征性蛋白CD9和CD63均有表达。
(3)胞外囊泡miRNA抽提和表达量
S31、血液胞外囊泡miRNA抽提
对于非肝细胞癌和肝细胞癌患者血液样本胞外囊泡miRNA的分离，本发明采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(217184,QIAGEN,Shanghai,China)，具体的实验操作流程参照产品使用说明书。对于抽提得到的胞外囊泡miRNA抽提产量和片段分布的检测，采用2100分析仪及配套的芯片和试剂(5067-1548,Agilent,USA)。
S32、血液胞外囊泡的表达检测
对于非肝细胞癌和肝细胞癌患者血液胞外囊泡miRNA的表达水平，采用small RNAsequencing来进行检测。对于血液胞外囊泡miRNA文库的构建，采用NEBNext,MultiplexSmall RNA Library Prep Set for Illumina(E7300L,NEB,USA)试剂盒，对于构建好的文库进行纯化，采用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(740609.50,QIAGEN,Shanghai,China)试剂盒，具体的操作流程参照产品使用说明书。简单来说，每个血浆样本miRNA的input量100ng，同时总体积不能超过6μl，随后连接3’接头、杂交反转录引物、连接5’接头、反转录、PCR扩增、PCR产物纯化。对于纯化后文库采用
GX TouchTM HT核酸分析仪及配套的芯片(CLS138948,PerkinElmer,USA)和试剂(CLS760672,PerkinElmer,USA)对DNA的产量和片段分布进行质控。最后，将20-25个文库等摩尔比混合后包lane送测，测序平台选择Illumina HiSeq PE150 analyzer。
(4)测序数据分析流程
基于small RNA sequencing检测技术，获得非肝细胞癌和肝细胞癌患者外周血胞外囊泡中miRNA的表达量。测序数据的分析流程如下:
S41、测序数据比对。去除small RNA sequencing数据测序接头后，使用BWA软件(版本：0.7.12-r1039)将测序数据比对到人类参考基因组hg19(基因组下载链接：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)，并统计比对到miRNA上的reads数量。
S42、miRNA注释。利用Gencode v25和miRBase v21数据库对miRNA进行注释，保留注释为已知的成熟miRNA，用于后续分析。
S43、miRNA过滤。对于训练队列，保留长度小于等于30nt且在训练队列数据中的每个样本至少覆盖1条reads的成熟miRNA，用于后续分析；对于验证队列，保留由训练队列筛选所得的miRNA且在验证队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析。
S44、miRNA表达量标准化。使用R语言中limma分析包中的M值加权截尾均值方法(TMM，trimmed mean of M-values)及limma-voom方法分别对训练队列样本和验证队列样本进行miRNA表达量标准化处理。
对于本领域技术人员，可以合理的预见除上述small RNA sequencing检测技术的其他表达检测方法如Q-PCR检测、芯片检测、其他二代测序方法或三代测序方法也能够获得相同或相近的结果。
(5)生物标记物的发掘
基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法发掘可用于区分非肝细胞癌、肝细胞癌患者的miRNA作为生物标志物。过程如下:
训练队列分组。依据样本病理检测结果，将训练队列中患者分为两组，肝细胞癌组和非肝细胞癌组。
候选生物标志物。使用R语言limma分析包中拟合线性模型(limma-trend)方法分析表达量在肝细胞癌组和非肝细胞癌组中存在差异的miRNA，表达量平均值大于50每百万映射读取的reads(CPM，Counts Per Million)作为候选生物标志物，共计638个miRNA用于后续分析。
生物标志物。在训练队列中，抽取两个候选生物标志物进行配对，如hsa-miR-628-3p和hsa-miR-941进行配对，计算每个样本表达量比值：log2(hsa-miR-628-3p表达量/hsa-miR-941表达量)。根据训练队列中每个病人的表达量比值及病理检测结果，计算每对miRNA的ROC曲线下方面积(AUC，Area Under Curve)。最终选定AUC取值最高的两组候选生物标志物作为生物标志物，即hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p，用于后续构建肝细胞癌、非肝细胞癌风险评分模型。
(6)肝细胞癌和非肝细胞癌风险评分模型
利用训练队列miRNA表达量数据，以4个生物标志物为变量，结合病理检测结果，构建非肝细胞癌、肝细胞癌风险评分模型。模型由变量、模型公式和参比值三部分组成。具体包括:
模型变量。模型变量由4个生物标志物组成，表2给出了4个生物标志物的Ensembl登录号。
表2生物标志物Ensembl登录号
风险评分模型。其中，风险评分模型公式如下:
其中，Risk-Score为非肝细胞癌和肝细胞癌的风险预测值；x为血液胞外囊泡中hsa-miR-628-3p与hsa-miR-941的表达值之间的比值相关公式，即log2(hsa-miR-628-3p表达量和hsa-miR-941表达量比值)；y为血液胞外囊泡中hsa-miR-584-5p与hsa-mir-106b-3p的表达值之间的比值相关公式，即log2(hsa-miR-628-3p表达量和hsa-miR-941表达量比值)。所优选的参比值为，当x小于等于-0.41且y小于等于7.5时，Risk-Score取值为非肝细胞癌；否则为肝细胞癌。使用风险评分模型和每个样本生物标志物的表达量，可以获得每个样本的风险预测结果。
(7)模型效能评估
以非肝细胞癌和肝细胞癌的风险预测结果为准，将训练队列样本分为低风险组(即被预测为非肝细胞癌)和高风险组(即被预测为肝细胞癌)。以病理检测结果为真值，评估模型预测效能。模型预测效能评估方法，包括敏感性(取值范围0～1)、特异性(取值范围0～1)和阴性预测值(NPV，Negative Predictive Value，取值范围0～1)，值越高效果越优。分别为90.9％、75％和93.8％(表3)。结果表明：在训练队列中，此风险预测模型具有较高敏感性和高NPV，模型对肝细胞癌的预测效能较优。
(8)模型效能验证
在验证队列中，根据训练队列中确定的风险评分模型及参比值，对模型预测非肝细胞癌和肝细胞癌的效能进行验证。在验证队列中，计算每个样本的风险值，以非肝细胞癌和肝细胞癌风险预测结果为准，将验证队列患者分为低风险组和高风险组(同训练队列)。以病理检测结果为真值，评估模型预测效能，包括敏感性、特异性和NPV，值越高效果越优。分别为92.3％、66.7％和92.3％(表3)。结果表明：在验证队列中，此风险预测模型同样具有高敏感性和高NPV，即模型预测效能在验证队列中被验证。
表3生物标记物的效能评估及效能验证
本发明最终筛选得到的预测非肝细胞癌、肝癌的生物标记物：
所述生物标记物包括2组共四个miRNAs：hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p。
应用本发明所述生物标志物以及分类模型的具体实施方法包括：
1)采集影像学检测结果疑似为肝细胞癌患者的外周血样本，提取外周血样本中的胞外囊泡并检测外周血胞外囊泡中miRNA表达的存在；
2)测量所述检测试剂所对应生物标志物的表达值；
3)将获得的表达值带入如上所述的分类模型中，计算得到疑似患者所患为肝细胞癌或非肝细胞癌的预测结果。
在上述应用的基础上，本发明所述检测试剂还可以结合针对其他标志物的试剂进行联合检测，例如以胞外囊泡中蛋白质、mRNA、LncRNA等为生物标志物的试剂，以及对于患者血液中如ctDNA(Circulating tumor DNA)、CTC(Circulating tumor cell)、蛋白生物标志物、其他核酸生物标志物等其他成分的结合进一步辅助肝癌早期诊断，结合影像学检测来提高肝癌早诊的敏感性，降低其假阴性。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合生物标志物在肝细胞癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。
3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述对照样本为非肝细胞癌患者样本。
4.一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1至3任一项所述的检测试剂。
5.一种基于hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p生物标志物的肝细胞癌和非肝细胞癌分类模型，其特征在于，所述模型包括：
其中，Risk-Score为非肝细胞癌和肝细胞癌的风险预测值；x为log2(hsa-miR-628-3p表达量和hsa-miR-941表达量比值)；y为log2(hsa-miR-584-5p表达量和hsa-mir-106b-3p表达量比值)。
6.一种使用权利要求1至3任一项所述检测试剂在制备通过如下方法进行肝癌早期诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、采集影像学检测结果疑似为肝细胞癌患者的外周血样本，提取外周血样本中的胞外囊泡并检测外周血胞外囊泡中miRNA的存在；
S2、测量所述检测试剂所对应生物标志物的表达值；
S3、将获得的表达值带入如权利要求5所述的模型中，计算得到疑似患者所患为肝细胞癌或非肝细胞癌的风险预测值。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述步骤S2包括使用small RNA测序获得生物标志物的表达值。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201127 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |