CN111733250A

CN111733250A - 一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂及应用

Info

Publication number: CN111733250A
Application number: CN202010749110.3A
Authority: CN
Inventors: 尹磊; 张大东; 许晓雅; 年宝宁; 刘士毅; 王晓楠; 张亚楠; 陈灏; 郭世伟; 金钢
Original assignee: Shanghai Siludi Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Shanghai Siludi Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明涉及一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂，特别是包括血液胞外囊泡miRNA：hsa‑miR‑335‑5p和hsa‑miR‑340‑5p作为区分转移性与非转移性胰腺癌生物标志物。本发明首次提出并验证了血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物，利用其表达水平区分转移性与非转移性胰腺癌时具有高敏感性，对于胰腺癌鉴别诊断具有重要意义。

Description

一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂及应用

技术领域

本发明涉及癌症鉴别诊断技术领域，尤其涉及一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂及应用。

背景技术

胰腺癌是一类高度恶性和侵袭性的消化系统疾病，其中超过90%为胰腺导管腺癌。胰腺癌早期发病并无症状，在初诊时约80%的胰腺癌患者已处于中晚期，并且约60%的患者存在胰腺癌细胞的远端转移至肝、肺和周围腹膜等，很难进行手术切除，患者五年生存率只有2%-9%。目前手术切除仍然是治疗胰腺癌一个重要且有效的手段，然而仅有20%的患者有机会进行手术切除。虽然手术切除能明显提高胰腺癌患者的中位生存期，但是高达80%患者在手术切除后会发生转移性复发，导致5年生存率仍仅有约20%-30%。在临床上如何鉴别诊断患者在转移部位病灶是原发病灶还是转移病灶，如何对影像学技术未检测到转移而实际发生转移的患者进行诊断避免不必要的手术切除是非常具有挑战性又常见的问题。因此，对转移性和非转移性胰腺癌患者进行鉴别诊断在临床上有重要意义。

目前，临床上常用的胰腺癌诊断和分期方法有胸部影像学、内镜超声引导下细针穿刺活检(EUS-FNA)和糖类抗原19-9(CA19-9)检测等，但这些检测方法在鉴别诊断胰腺癌患者是否存在远端转移具有一定的局限性。胸部影像学检测包括超声检查（US），多探测器计算机断层扫描（MDCT），磁共振成像(MRI)，正电子发射断层摄影(PET)等，影像学检测方法特异性和敏感性较低，难以区分患者是否存在远端转移。如MDCT对小于2cm的病变的检测敏感度只有80%，不能显示肝或腹的小转移。而 EUS-FNA 是一种侵入性的检测方法本身就容易引起肿瘤的扩散，并且特异性较低仅有60%-70%。CA19-9是基于血液的肿瘤标志物被广泛用于胰腺癌的预后监测，据报道CA19-9对于区分胰腺癌患者术后是否发生血液转移的敏感性和特异性较低，而且假阴性率较高。因此，仅采用影像学方法很难对胰腺癌患者是否存在远端转移进行诊断，迫切需要微创的肿瘤标志物对转移性和非转移性胰腺癌患者进行有效的鉴别。

胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是由多种不同类型细胞释放到细胞外的囊泡，几乎存在于所有的生物体液中。小型胞外囊泡包括一种直径约30-150 nm的由脂膜包裹的纳米泡状结构，也称为外泌体。一般是由细胞膜内陷形成内体，随后凹陷成为多囊泡体，最后分泌到细胞外基质中。胞外囊泡包含多种内容物如miRNA，mRNA，DNA和蛋白质等。机体在正常生理和病理条件下均能分泌胞外囊泡，进而与其他细胞进行物质交换和信息传递，在肿瘤发生和癌症转移中起着重要作用。鉴于胞外囊泡的广泛分布和重要功能，外周血中游离的小型胞外囊泡（外泌体）作为一种重要液体活检形式来检测多种疾病已得到广泛的关注和深入研究，大量研究表明癌细胞衍生的胞外囊泡在癌症发展早期会进入循环并与转移有关。但是，这些研究血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物在鉴别胰腺癌是否发生转移的研究较少，也没有发现并验证可用于提高胰腺癌发生转移特异性的生物标志物。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂，利用血液胞外囊泡miRNA作为生物标志物，建立血液胞外囊泡miRNA生物标志物鉴别诊断模型，通过miRNA生物标志物表达水平区分转移性与非转移性胰腺癌时具有高敏感性。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p的组合。

进一步地，所述hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p的组合生物标志物在转移性胰腺癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。

进一步地，所述对照样本为非转移性胰腺癌患者样本。

本发明还涉及一种用于鉴别诊断转移性与非转移性胰腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如上所述的检测试剂。

本发明还涉及一种基于hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p生物标志物的转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断模型，其特征在于，所述模型包括：

其中，f(x)为鉴别结果，包括非转移性胰腺癌（Non metastatic）和转移性胰腺癌（Metastatic）；x为血液胞外囊泡中hsa-miR-335-5p与hsa-miR-340-5p的表达值之间的比值。

本发明还涉及一种使用如上所述检测试剂在制备通过如下方法进行转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、采集影像学检测结果疑似为转移性胰腺癌患者的外周血样本，提取血液中胞外囊泡；

S2、通过所述检测试剂抽提所述血液胞外囊泡中miRNA作为生物标志物，测量生物标志物的表达值；

S3、将获得的表达值带入如权利要求5所述的模型中，计算得到根据此模型推断的疑似患者发生转移性胰腺癌或非转移性胰腺癌的鉴别结果。

进一步地，所述步骤S2包括使用small RNA测序获得生物标志物的表达值。

进一步地，所述步骤S1包括采用L型外泌体沉淀剂提取血液胞外囊泡。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂能够从患者外周血中针对性的获取胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p，并可以根据其表达值建立鉴别诊断模型，在区分转移性与非转移性胰腺癌的应用中具有高敏感性。

本发明还涉及一种基于血液胞外囊泡miRNA生物标志物的转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断模型，采用该模型结合影像学技术可以提高对转移性和非转移性胰腺癌鉴别诊断的准确性，从而能使患者获得更加准确的治疗措施，对影像学技术未检测到转移而实际发生转移的患者进行诊断避免不必要的手术切除，减少患者的额外痛苦并避免临床医疗资源的浪费。

附图说明

图1为血液胞外囊泡电镜结果。

图2为血液胞外囊泡特征性蛋白表达。

图3为训练队列ROC曲线。

图4为验证队列ROC曲线。

图5为生物标记物的死亡风险比。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

本发明涉及到的所有miRNA都是公开在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)被注释过的成熟的miRNA。

本发明的血液胞外囊泡miRNA生物标志物，根据其表达值建立鉴别诊断模型来协助区分转移性与非转移性胰腺癌患者，从而提高转移性胰腺癌诊断的准确性。

本发明所述检测试剂针对性检测的血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p的筛选过程包括以下步骤：

（1）研究队列及临床信息

本研究共收集69名患者入选两个研究队列，去除病理诊断为非胰腺癌、未进行手术操作、严重溶血 (溶血等级≥5) 的样本，最终保留57例患者入组训练队列和验证队列，于术前采集患者的血浆样本。如表1所示，训练队列共纳入30例患者，包括18例转移性胰腺癌患者和12例非转移性胰腺癌患者；验证队列入组27例患者，包括16例转移性胰腺癌患者和11例非转移性胰腺癌患者。表1展示了患者的临床信息，包括性别、年龄及病理诊断结果等相关临床信息。分析结果表明两组患者间的性别、年龄、病灶部位及转移性与非转移性胰腺癌患者比例并无显著差异。实际选入研究队列的患者所患均为胰腺导管腺癌，因胰腺导管腺癌在全部胰腺癌中占有绝对显著的较大数量比例，因此样本筛选具有对应胰腺癌患者的广泛意义。

表1 患者临床信息

（2）血液胞外囊泡的提取和特征

S21、血液收集和胞外囊泡的提取

本研究所有的转移性和非转移性胰腺癌患者均在手术或药物治疗前采集血液样本，血液样本保存在抗凝血的真空采血管中(REF367863, BD, USA)，采集后的样本在一小时内4°C运送。对收到的血样采用两步离心法进行血浆的分离，第一次离心1600 g，4°C离心10min，吸取上清液到新的1.5ml离心管中，并对样本的溶血等级进行分级和记录，溶血等级大于等于5级的样本不纳入后续研究，第二次离心16000 g，4°C离心15 min ，吸取上清液每管1 ml到新的1.5ml离心管中，保存在负80度冰箱中待用。对于血浆胞外囊泡的提取采用思路迪自主研发的L型外泌体沉淀剂（L3525）。血浆样本从负80度冰箱取出后，先放置于37℃金属浴中孵育至完全融化后，12000 g，4°C离心10 min，先后转移上清液到0.45 µm tubefilter (Costar, CLS8163-100EA, Corning, USA) 和0.22 µm tube filter (Costar,CLS8161-100EA, USA)中，于 12000 g，4°C离心5 min收集过滤液。小心吸取过滤液到1.5ml离心管中，然后加入1/4体积的L型外泌体沉淀剂 (L3525, 3DMed, Shanghai, China)，涡旋混匀后放置于4°C孵育30 min，孵育完成后4700 g，4°C离心30 min获取胞外囊泡，最后弃去上清液并加入200 µl PBS (phosphate buffer saline)重悬胞外囊泡沉淀。

对于本领域技术人员来说，胞外囊泡的提取方法不限定于上述操作步骤，现有技术中的适合方法如超速离心法、梯度密度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法等，以及在如上述方法中采用其他商品化外泌体沉淀剂均是可行的，本领域技术人员可以预见其所得胞外囊泡应具有类似特征而不因提取方法的改变而存在差异。

S22、血液胞外囊泡的特征

为了检测转移性和非转移性胰腺癌患者血液中胞外囊泡的特征，本专利采用扫描电镜检测胞外囊泡形态，通过免疫印迹检测胞外囊泡特征性蛋白的表达水平。胞外囊泡形态特征鉴定：收获的胞外囊泡沉淀先用PBS重悬，然后新鲜配置5%戊二醛进行胞外囊泡固定，之后用PBS清洗5min，再用PBS配置1%锇酸固定，随后用不同浓度梯度的乙醇 (40%、60%、80%、96-98%)进行脱水，最后在样本表面镀一层硅金属膜，待室温干燥24小时后采用扫描电镜(SU8020, Hitachi High-Technologies, Japan)进行形态特征分析。检测结果如图1所示，可见到胞外囊泡呈现典型的“马蹄状”形态。

血液胞外囊泡特征蛋白检测：用于胞外囊泡特征蛋白检测时选用N型外泌体沉淀剂 (N3525, 3DMed, Shanghai, China)来分离胞外囊泡，收获的胞外囊泡用RIPA裂解液(P0013B, Beyotime, Shanghai, China)来裂解，冰上裂解30 min后，12000 g，4°C离心10min。裂解后样本的蛋白浓度用BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific,USA)来检测，取25µg的总蛋白量用4%—20% SDS-PAGE gel (#4561095, Bio-Rad, USA) 恒压电泳约1h，PVDF膜 (Millipore, Billerica, MA, USA)恒流电转约45min，5%脱脂奶粉封闭过夜。实验用相关一抗抗体信息如下： TSG101 (1:1000 diluted, ab125011, Abcam,England)、Alix (1:1000 diluted, 2171, Cell Signaling Technology, Danvers, MA,USA) 、Syntenin (1:1000 diluted, ab19903, Abcam, England) 和CD63 (1:1000diluted, ab216130, Abcam, England)，一抗抗体室温孵育2h，结束后使用TBST洗4次，每次10 min，随后进行二抗孵育，羊抗兔源二抗 (A0208, Beyotime, Shanghai, China)或羊抗鼠源二抗 (A0216, Beyotime, Shanghai, China)室温孵育1 h，TBST洗4次，最后用化学发光系统(Tanon-5200Multi, Shanghai, China)检测抗体的结合。检测结果如图2所示，表明本专利提取的代表性样本中胞外囊泡特征性蛋白TSG101、Alix、Syntenin、CD63均有表达。

（3）胞外囊泡miRNA抽提和表达量

S31、血液胞外囊泡miRNA抽提

本专利采用miRNeasy Serum/Plasma Kit (217184, QIAGEN, Shanghai, China )对转移性和非转移性胰腺癌患者血液样本进行胞外囊泡miRNA的分离，具体的操作流程可以参照该产品的公开使用说明书。对于抽提的miRNA抽提质量进行质控，可以选用2100分析仪及配套的芯片和试剂 (5067-1548, Agilent, USA )进行miRNA产量和片段分布的检测。

S32、血液胞外囊泡的表达检测

本专利采用small RNA sequencing检测转移性和非转移性胰腺癌患者血液胞外囊泡miRNA的表达水平。文库的构建选用NEBNext, Multiplex Small RNA Library Prep Setfor Illumina (E7300L, NEB, USA)试剂盒，具体的操作流程依照产品说明书。每个血浆样本miRNA上样量为100 ng总体积不超过6 µl，连接3’接头、杂交反转录引物、连接5’接头、反转录、加入Illumina index primers标记PCR扩增18个循环。选用NucleoSpin Gel and PCRClean-up (740609. 50, QIAGEN, Shanghai, China) 试剂盒纯化PCR产物，用30 µl 无酶的水洗脱DNA。用 LabChip® GX Touch^TM HT核酸分析仪及配套的芯片 (CLS138948,PerkinElmer, USA)和试剂 (CLS760672, PerkinElmer, USA)对DNA定量和片段分布的检测。一般20-25个文库等摩尔比混合包lane测序，选用Illumina HiSeq PE150 analyzer测序。

（4）测序数据分析流程

基于small RNA sequencing检测技术，获得转移性和非转移性胰腺癌患者血液胞外囊泡中miRNA的表达量。测序数据的分析流程如下:

S41、测序数据比对。去除small RNA sequencing数据测序接头后，使用BWA软件 (版本：0.7.12-r1039)将测序数据比对到人类参考基因组hg19 (基因组下载链接：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)，并统计比对到miRNA上的reads数量。

S42、miRNA注释。利用Gencode v25和miRBase v21数据库对miRNA进行注释，保留注释为已知的成熟miRNA，用于后续分析。

S43、miRNA过滤。对于训练队列，保留长度小于等于30nt且在训练队列数据中的每个样本至少覆盖1条reads的成熟miRNA，用于后续分析；对于验证队列，保留由训练队列筛选所得的miRNA且在验证队列数据中的每个样本至少覆盖2条reads的成熟miRNA，用于后续分析。

S44、miRNA表达量标准化。使用每个样本中基因表达量的上分位数作为每个样本的度量因子，将所有样本中的表达量除以度量因子实现标准化处理。

对于本领域技术人员，可以合理的预见除上述small RNA sequencing检测技术的其他表达检测方法如Q-PCR检测、芯片检测、其他二代测序方法或三代测序方法也能够获得相同或相近的结果。

（5）生物标记物的确定

基于训练队列中miRNAs的表达量，根据病理检测结果对样本进行分组，使用统计学方法确定可用于区分转移性和非转移性胰腺癌患者的miRNA作为生物标志物。过程如下:

训练队列分组。依据样本病理检测结果，将训练队列中患者分为两组，转移性胰腺癌组和非转移性胰腺癌组。

候选生物标志物。使用R语言limma分析包中拟合线性模型 (limma-trend)方法分析表达量在转移性胰腺癌组和非转移性胰腺癌组中存在差异的miRNA，表达量大于50、两组间变化量在2倍以上且检验结果P值≤0.05的miRNA，作为候选生物标志物，用于后续分析。

生物标志物。在训练队列中，通过差异表达量的分析和利用公共数据库TCGA（TheCancer Genome Atlas）中miRNA表达量的生存关联分析，得出hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p可以作为区分转移性胰腺癌和非转移性胰腺癌的生物标记物，将hsa-miR-335-5p/hsa-miR-340-5p两个标志物相除后的值构建癌症和转移的风险评估模型。

（6）转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断模型

利用训练队列hsa-miR-335-5p /hsa-miR-340-5p的数据，结合病理检测结果，构建转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断模型。分别取hsa-miR-335-5p /hsa-miR-340-5p敏感性(sensitivity)和特异性(specificity)综合最高点 0.12建立函数模型：

其中，f(x)为分类结果，包括非转移性胰腺癌（Non metastatic）和转移性胰腺癌（Metastatic）；x为血液胞外囊泡中hsa-miR-335-5p与hsa-miR-340-5p的表达值之间的比值。

（7）模型效能评估

将训练样本分为转移性胰腺癌组与非转移性胰腺癌组，评估模型效能。模型评估效能方法以ROC曲线的AUC值和鉴别诊断模型下的特异性和敏感性，AUC值越高效果越优，特异性和敏感性越高越优。如图3所示，利用hsa-miR-335-5p/ hsa-miR-340-5p的值在训练集中模型的AUC值为0.798，表明这两个miRNA的组合能较好地区分转移性胰腺癌和非转移性胰腺癌。在保证敏感性的情况下以在训练集中挑选分类比值，在比值为0.12时模型的敏感性为91.7%，特异性为44.4%（见表2），表明此模型能较好的检出转移性胰腺癌。

（8）模型效能验证

将验证样本带入鉴别诊断模型，以病理结果为真值，绘制ROC曲线并计算AUC值、敏感性和特异性值，结果如图4和表2所示，其中AUC为0.801，敏感性和特异性分别为81.9%和56.3%，表明此模型能在训练队列中较好地检出转移性胰腺癌。

表2 生物标记物的效能评估及效能验证

（9）生物标记物拓展研究

将训练队列和验证队列合并进行cox回归分析，取hsa-miR-335-5p/ hsa-miR-340-5p的比值作为分类指标，HR(hazard Ratio)为3，95%CI(1.1~8.1)（如图5所示），表明hsa-miR-335-5p/hsa-miR-340-5p的比值高和胰腺癌患者高死亡风险显著相关（p=0.027）。

本发明最终筛选得到区分转移性与非转移性胰腺癌的生物标记物，所述生物标记物包括2个miRNAs：hsa-miR-335-5p、hsa-miR-340-5p。

应用本发明所述生物标志物以及鉴别诊断模型的具体实施方法包括：

1）采集影像学检测结果疑似为转移性胰腺癌患者的外周血样本，提取外周血样本中的胞外囊泡并检测外周血胞外囊泡中miRNA表达的存在；

2）测量所述检测试剂所对应生物标志物的表达值；

3）将获得的表达值带入如上所述的鉴别诊断模型中，计算得到根据此模型推断的疑似患者发生转移性胰腺癌或非转移性胰腺癌的鉴别结果。

在上述应用的基础上，本发明所述检测试剂还可以结合针对其他标志物的试剂进行联合检测，例如以胞外囊泡中蛋白质、mRNA、LncRNA等为生物标志物的试剂，以及对于患者血液中如ctDNA (Circulating tumor DNA)、CTC (Circulating tumor cell)、蛋白生物标志物、其他核酸生物标志物等其他成分的结合进一步辅助转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种用于转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的生物标志物的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p的组合。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p的组合生物标志物在转移性胰腺癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。

3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述对照样本为非转移性胰腺癌患者样本。

4.一种用于鉴别诊断转移性与非转移性胰腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1至3任一项所述的检测试剂。

5.一种基于hsa-miR-335-5p和hsa-miR-340-5p生物标志物的转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断模型，其特征在于，所述模型包括：

6.一种使用权利要求1至3任一项所述检测试剂在制备通过如下方法进行转移性与非转移性胰腺癌鉴别诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述步骤S2包括使用small RNA测序获得生物标志物的表达值。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述步骤S1包括采用L型外泌体沉淀剂提取血液胞外囊泡。