KR101929006B1 - 기관지폐포세척액에서 분리된 세포외소포체 분석을 통한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐암 환자의 기관지폐포세척액에서 분리된 세포외소포체를 분석하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 폐암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기관지폐포세척액을 이용한 폐암 발현 유전자의 돌연변이 검출 방법은 조직검사를 통한 유전자 돌연변이 검출보다 비침습적이고, 용이하며, 반복검사가 가능하면서 민감도가 높다는 점에서 EGFR-TKI와 같은 표적 항암제 치료 후 발생하는 항암제 내성 유발 돌연변이 검출에 용이하다.
또한 기관지폐포세척액 유래 세포외소포체를 이용하면 암세포에서 유래된 DNA, RNA, 단백질, 지질, 당의 생체 고분자의 다양한 정보를 분석할 수 있어 더욱 정확하고 효율적인 진단이 가능하므로, 폐암을 조기 검진하거나 예후를 측정하여 폐암 치료 효율 증대에 기여할 수 있다.

Description

기관지폐포세척액에서 분리된 세포외소포체 분석을 통한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측용 조성물{Composition for diagnosing lung cancer, assaying drug response and prognosis through analysis of extracellular vesicle isolated from Bronchoalveolar lavage fluid}

본 발명은 폐암 환자의 기관지폐포세척액에서 분리된 세포외소포체에 함유된 DNA 및 RNA와 같은 핵산, 단백질 등과 같은 생체활성분자(bioactive molecules)를 분석하는 제재를 포함하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 폐암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

폐암은 세계적으로 하루 5천 명, 1년에 150만 명이 사망하고 있고 이번 세기에 모두 5억 명이 사망할 것으로 추정되며, 남녀 모두에서 가장 많이 사망하는 암으로 우리나라에서는 2013년 17,177명이 폐암으로 사망했으며 전체 암 사망자의 26.6%(남), 16.5%(여)를 차지하고 있다. 그러나 폐암은 진단방법 및 항암치료와 방사선 치료의 발전에도 불구하고 예후가 매우 좋지 않아 5년 생존율이 20.7%로 췌장암에 이어 두번째로 낮은 질환이다.

폐암의 조기 발견으로 사망률을 낮추기 위해 저선량 CT scan 등이 시도되고 있으나 선별검사로 확립되어 있지 못하며, 객담 세포학 검사의 민감도 도한 매우 낮아 조기 발견이 매우 어렵다. 따라서 폐암 생존율을 높이기 위한 조기 진단법 개발이 매우 중요하다.

최근 표적 항암제의 개발로 종양세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자 돌연변이 검출에 대한 관심이 증가하고 있다. 폐암 진단에서 현재 사용되고 있는 가장 의미 있는 표적(biomarker)은 상피세포나 조직에서 나타나는 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 변이이다. 상기 EGFR DNA의 활성 변이는 서양인 폐암 환자들에게서 10 내지 20% 정도인 반면, 비흡연 동양 여성 폐암 환자들 중에는 60%이상의 높은 빈도를 보인다. 가장 흔히 발견되는 활성 변이는 Exon 19에서 나타나는 염기 결실(deletion E746_A750)과 Exon 21에서 나타나는 염기치환(L858R) 돌연변이이다. 반면, EGFR-TKI (Tyrosine kinase inhibitor)에 대한 획득 내성을 유발하는 2차 돌연변이인 Exon 20의 염기치환(T790M) 돌연변이는 50-60%의 빈도로 발현되는데 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI (EGFR mutant specific inhibitor)가 임상에 도입되면서 약제 처방에 대한 동반진단 (companion diagnostics)이 필수 사항으로 요구되면서 임상적 중요성이 부각되고 있다.

현재 진행성 폐암에 대한 항암치료에 있어서 EGFR 유전자 돌연변이 검사는 의료보험 혜택이 적용될 정도로 필수적이며 보편화된 검사 방법으로서, EGFR 돌연변이 검사는 조직검사 병리 슬라이드에서 확인된 암세포에서 DNA를 분리하여 진행되고 있다. 즉 유전자 돌연변이 검사를 위해서는 생체조직을 얻고자 시행하는 조직검사가 현재로서는 표준 방법으로 되어있는데 정확하기는 하지만 침습적이고 관혈적인 검사 방법으로 출혈, 기흉, 공기 색전증 등 심각한 합병증을 초래할 수 있는 위험도가 있는 방법이며 때로는 병변의 위치나 위험성 때문에 검사를 시행할 수 없는 경우도 발생한다. 최근 Osimertinib등과 같은 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI가 임상에 도입되면서 T790M 2차 돌연변이를 검출하고자 재조직검사(rebiopsy)를 시행해야 하는데 이 경우, 그 성공률이 더욱 낮아서 좋은 약제가 있음에도 불구하고 적절한 돌연변이 진단이 되지 않아서 환자가 혜택을 보지 못하는 경우가 증가하고 있다.

이에 대한 해결책으로 최근 혈액을 이용하여 T790M 유전자 돌연변이 검사를 검출하려는 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 그러나 기술적 한계로 60-70%의 환자만 찾아낼 수 있는 민감도 문제에 한계점을 보이고 있는 실정이다.

향후 생체액(biofluid) 분석을 통하여 암 유전자 검사를 시행하는 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)의 시대가 도래할 것으로 예상되고 있다. 그 대상으로는 혈액이나 소변과 같이 쉽게 얻을 수 있고 비용도 적게 드는 시료가 이상적이기는 하지만, 이를 해결하기 위한 기술적 난관은 매우 높다고 생각된다.

한편, 폐암은 기관지내시경 검사를 통하여 기관지폐포세척술 (Bronchoalveolar lavage=BAL)을 시행함으로써 폐암이 있는 부위에서 폐암세포는 물론 폐암세포가 분비한 생체 물질들을 직접 채취할 수 있는데 이를 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid = BALF)이라 한다. 이는 폐암이 존재하는 기관지에 기관지내시경을 쐐기식 고정을 하고 생리식염수를 주입한 후 이를 음압을 이용하여 다시 회수함으로써 이루어지는데 특별한 부작용 없이 안전하게 시행되는 시술로서 호흡기내과 전문의라면 쉽게 수행할 수 있는 보편적 진단법이다. 회수된 기관지폐포세척액(BALF)은 원심분리하여 세포 성분과 상층액으로 구분하여 이에 대한 각각의 분석을 통하여 진단에 사용될 수 있는데, 현재까지는 세포 성분의 분석이 임상적 진단에 이용될 뿐 아직 BALF의 액체 성분인 상층액 분석을 이용하여 진단에 이용하는 경우는 없는 실정이다.

최근 신체에서 얻어진 체액(biofluid)에는 나노 크기의 세포외소포체 (extracellular vesicles)라는 것이 존재한다고 밝혀져 주목받고 있다. 세포외소포체는 이중 지질막으로 이루어진 50~1000nm의 크기를 갖는 나노 소포체로 DNA, RNA 및 단백질 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포막으로부터 분비되어 세포와 세포 사이의 communication에 매우 중요한 기능을 한다고 밝혀져 있다. 특히 암세포에서는 세포외소포체를 정상세포에 비해 훨씬 더 많이 분비하며, 암세포에서 분비된 세포외소포체를 암 유래 세포외소포체라고 하며, 최근 여러 연구들을 통해, 암 진행과정에서 암 유래 세포외소포체가 면역 억제, 전이, 혈관 형성 등 여러 가지 역할을 하고 있음이 확인되고 있다. 또한 세포외소포체는 이중지질막으로 싸여 있어서 내부에 존재하는 DNA는 물론 RNA와 같은 핵산이나 단백질 등 주요 생체물질들이 대단히 안정적으로 보존되고 있어 암진단 및 생체표지자(biomarker) 개발에 혁신적인 기반을 제공할 것으로 주목받고 있다. 세포외소포체는 혈액, 소변, 타액, 모유, 흉수, 복수, 뇌척수액 등 대부분의 우리 몸에 정상적으로 혹은 질병 발생 시 발생하는 체액에 존재한다고 밝혀져 있어서 그 임상적 유용성이 대단히 높으며, 실제로 우리 몸의 체액에서 세포외소포제를 분리하여 분석함으로써 암은 물론 각종 질환을 진단하는 방법으로 개발하려는 노력들이 국제적으로 매우 활발히 진행되고 있는 실정이다.

하지만 아직 폐암에 있어서 체액에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 분석하여 진단 및 약제반응과 예후 예측에 적용할 수 있는 생체표지자로 이용할만한 연구적 성과는 보고되지 않는 실정이다. 더욱이 폐암 환자에서 기관지폐포세척에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 그 안에 존재하는 DNA를 분석하여 유전자 돌연변이 검사를 시행한다는 것은 국내는 물론 세계 최초의 획기적이고 선도적인 검사 방법이라 판단되며, 합병증 빈도가 높은 침습적이고 위험성이 높으며 진단적 실패율의 문제점을 안고 있는 조직검사를 대체할 수 있는 매우 유망한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측 방법으로 자리매김할 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명자는 폐암 진단 및 약제반응 예측용 조성물을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 폐암 환자의 기관지폐포세척액에서 분리된 세포외소포체를 분석할 경우, 폐암세포에서 유래된 DNA, RNA, 단백질, 지질, 당의 생체 고분자의 다양한 정보를 분석할 수 있어 폐암 환자에서 비침습적이면서도 신속하고 민감도 높은 분자적 진단 결과를 얻음으로써 약제반응과 예후를 예측할 수 있다는 연구 결과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암 진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 폐암 진단용 마커 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 (a) 기관지폐포세척액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 폐암 환자의 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암 진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 기관지폐포세척액은 기관지내시경을 이용해 검사대상의 기관지로부터 얻은 액체인 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR 돌연변이인 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 EGFR 돌연변이는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c)의 EGFR 돌연변이 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 폐암 환자의 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 폐암 환자의 기관지폐포세척액에 존재하는 세포외소포체 DNA를 이용하여 폐암 관련 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하고자 한다. 이는 조직검사를 통한 유전자 돌연변이 검출보다 용이하고, 비침습적이며, 반복 검사가 가능하여 표적 항암제 치료 후 발생하는 항암제 내성유발 돌연변이 검출에 용이하다. 따라서 폐암의 조기 검진과 폐암 치료 효율 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체 크기를 나타낸 결과이다.
도 2는 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 3은 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 4는 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체와 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 증폭 곡선을 비교한 결과이다.
도 6은 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체 DAN와 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 검출 결과를 조직검사한 결과와 비교한 표이다.
도 7은 기관지폐포세척액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이를 조직검사 일치율과 비교한 표이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 표준 방법으로 사용되는 조직검사를 통한 유전자 진단방법의 단점과 한계점을 보완하기 위한 비침습적이고도 반복적 검사가 가능하며 민감도가 높은 EGFR-TKI를 중심으로 하는 표적항암제 내성관련 돌연변이 검출에 용이한 진단방법 개발이 시급한 실정이다. 본 발명은 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체를 포함하는 폐암 진단용 마커 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

본 발명에서 "세포외소포체"란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 폐암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 폐암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

상기 세포외소포체는 폐암 환자의 기관지폐포세척액으로부터 분리한 것일 수 있다.

상기 기관지폐포세척액은 기관지 파이브로스코프를 사용해 구역, 아구역 기관지에서 말초측에 생리식염색을 주입, 흡인 및 세척하여 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기관지폐포세척액은 기관지폐포계에 존재하는 마크로페이지, 림프구, 다핵백혈구 등의 세포성분이나 기관지 세포 내에 존재하는 생리활성물질, 대사산물을 채취하여 분석함으로써 폐의 생리기능이나 대사의 이상 등을 검색할 때 사용될 수 있다.

본 발명은, 폐암 환자의 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암 진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 폐암의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 폐암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 폐암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 폐암 세포에서 차별 발현되는 유전자 또는 단백질로서, EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자 또는 단백질 일 수 있다. 바람직하게, 상기 EGFR 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환에 의해 폐암 세포에서 차별 발현되는 것일 수 있다.

본 발명의 KRAS 유전자 돌연변이는 K-Ras 단백질의 12 또는 13번째 아미노산인 글리신이 변형된 것이거나 61번째 아미노산인 글루타민이 변형된 것이다.

본 발명의 ALK 유전자는 tyrosine kinase receptor를 코딩하는 유전자로서, 비소세포폐암에서 돌연변이가 발견된다. 상기 유전자 돌연변이 중 염색체 전위가 가장 일반적이며, 이는 ALK (chromosome 2)/EML4 (chromosome 2), ALK/RANBP2 (chromosome 2), ALK/ATIC (chromosome 2), ALK/TFG (chromosome 3), ALK/NPM1 (chromosome 5), ALK/SQSTM1 (chromosome 5), ALK/KIF5B (chromosome 10), ALK/CLTC (chromosome 17), ALK/TPM4 (chromosome 19), 및 ALK/MSN　(chromosome X)를 포함하여 여러 종양 유전자의 fusion을 초래한다.

본 발명의 ROS1 유전자는 몇 가지 다른 종류의 ROS1 전위가 비소세포폐암에서 발견되었으며, SLC34A2-ROS1,　CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1,　and SDC4-ROS1을 포함한다.

한편, 질병을 진단하는 진단 마커는 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용이 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는데 매우 중요한 인자로 작용하는데, 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다.

본 발명의 폐암을 진단할 수 있는 상기 마커의 경우, 폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 결실, 치환 등이 되는 유전자들로서 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 돌연변이의 수준 차이가 대조군과 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이므로 잘못된 결과를 보일 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신할 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

본 키트는, 검사 대상에게서 돌연변이 유전자의 존재, mRNA 발현 또는 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질의 발현을 확인함으로써 폐암의 발병 가능성을 진단할 수 있다. 바람직하게, 상기 돌연변이 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자일 수 있다.

본 발명의 키트에는 상기 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브와, 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질을 선택적으로 인지하는 항체가 포함되고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 상기 키트는 프라이머키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적인 일예로서, 본 발명에서 EGRF 돌연변이 유전자를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, DNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자를 포함하는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하여 폐암의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

또한 본 발명은, (a) 기관지폐포세척액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계의 폐암 진단에 사용되는 세포외소포체는 폐암 환자의 기관지폐포세척액의 연속적인 원심분리(centrifugation) 및 초고속 원심분리(ultracentrifugation)를 통해 분리할 수 있으며, 기존에 기관지폐포세척액에서 세포외소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (b) 단계의 세포외소포체는 세포외소포체 용해 버퍼와 단백질분해효소 K를 이용해 추출할 수 있으며, 기존에 기관지폐포세척액에서 세포외소포체 DNA를 추출하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (c) 단계의 세포외소포체 DNA 분석시 농도 측정용 Nanodrop 기계를 이용하고, 크기 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (d) 단계의 EGRF 돌연변이 유전자 분석은 세포외소포체 DNA, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR믹스를 섞어서 PCR 반응 용액을 만든 후 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 40 사이클 동안 반응하여 매 사이클마다 형광 값을 측정, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값(Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 분석하는 방법으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은, 폐암 환자의 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 세포외소포체 DNA의 EGFR 유전자 돌연변이 유무를 확인함으로써 해당 개체의 폐암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 폐암 환자의 기관지폐포세척액에 존재하는 세포외소포체 분리 및 세포외소포체 DNA 추출

기관지폐포세척액에서 세포와 세포 찌꺼기를 제거하기 위해서 1000g에서 10분 동안 원심분리 하여 침전시켰다. 세포와 세포 찌꺼기가 제거된 상층액을 200,000g에서 1시간 동안 초고속 원심분리 하여 세포외소포체를 침전시킨 후 상층액을 제거하고 PBS 버퍼 200ul에 침전물을 풀어주었다. 분리된 세포외소포체의 크기를 나노물질 크기 측정용 zetasizer 기계로 측정하였다. 분리된 세포외소포체 200ul에 세포외소포체 용해 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다. (도 2, 4) 세포외소포체 DNA농도는 630pg/ul이고, DNA의 크기는 도2,3,4를 비교했을 때 세포외소포체 DNA에서 2000bp이상의 큰 DNA가 유리 DNA보다 많이 존재한다.

실시예 2. 폐암 환자의 기관지폐포세척액에 존재하는 유리 DNA 추출

폐암 환자 기관지폐포세척액에 존재하는 세포외소포체 DNA와의 비교를 위해 하기의 실험을 실시하였다.

기관지폐포세척액에 유리 DNA 추출 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다(도 3, 4). 유리 DNA농도는 50pg/ul이다.

실시예 3. EGFR 돌연변이 유전자 분석

상기 추출된 세포외소포체 DNA 70ng또는 유리 DNA70ng을 프라이머, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR 믹스 (mix)를 섞어서 20ul의 PCR 반응 용액을 만들었다. 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 94 5분 반응 후 94 30 초, 70 20초, 63 30초 조건으로 40 사이클 (cycles) 동안 반응하며 매 사이클마다 형광 값을 측정하여 그래프를 작성하였다. (도 5) 이 때, 94의 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리되는 denaturation, 이 후 온도를 70정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정부위에 결합하고, 합성되는 단계를 거쳐 두 개의 DNA가 된다. 증폭시키려는 상기 추출된 세포외소포체 DNA 또는 유리 DNA의 적은 양을 이용해 엄청난 양으로 늘릴 수 있으며, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값 (Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 파악하였다. EGFR 돌연변이 유전자 검사 결과 세포외소포체 DNA는 20검체중 20 검체가 조직검사 결과와 일치하여 100%의 일치율을 보였고, 유리 DNA는 20개 검체중 17개 검체가 일치하여 85%의 일치율을 보여 기관지폐포세척액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA를 이용한 EGFR 돌연변이 유전자 검사가 효율성이 높다는 것이 입증되었다. (도 6, 7)

Claims (14)

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7. (a) 기관지폐포세척액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계;
   (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계;
   (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및
   (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는
   폐암 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
   상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 및 PI3K로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
   
   
   
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9. 제7항에 있어서,
   상기 단계 (c) 및 (d)의 돌연변이 유전자는 EGFR 돌연변이 유전자인 것을 특징으로 하는
   폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 EGFR 돌연변이 유전자는 엑손 19의 염기 결실, 엑손 21의 L858R의 염기 치환 및 엑손 20의 T790M의 염기 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
    
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