CN112899228B - 一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，属于细胞提取技术领域。从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀重悬，将细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层。本发明提供的方法能够高效去除肺泡灌洗液中细胞成分、细胞碎片成分以及沉积在肺泡部的粉尘、药物、表面活性物质和分泌物等杂质，较大程度分离获得具有诊断意义的细胞成分，用于疾病的临床诊断及基础研究。

Description

一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞提取技术领域，具体涉及一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法。

背景技术

肺泡微环境是反映肺泡功能状态的重要部分，组成肺泡结构的上皮细胞及肺泡腔内的免疫细胞，共同形成了天然免疫的屏障，接受着吸入气体中有害物质的冲击，保护机体内环境的稳定。支气管肺泡灌洗通过纤支镜将特定量的生理盐水灌入某一叶/段肺，通过负压或重力回收液体，当中带有肺泡腔内的细胞，通过对细胞的形态、功能或表型进行评价，完成细胞学的判读，从而为疾病的诊断提供数据。细胞学证据不仅有利于诊断，大剂量的灌洗清除细胞也是重要的治疗手段。因此，分离复杂的肺泡灌洗液中的细胞对于疾病的诊断和治疗有着非常重大的意义。

现有技术中，分离肺泡灌洗液细胞直接用等渗缓冲液结合低速离心法进行分离，一般是PBS或生理盐水离心，但是会混有很多杂质，包括菌丝、痰液之类，该种方法制备的细胞仅仅用于分析，无法进行后续培养。

然而从肺部感染疾病和弥漫性肺泡沉积疾病如肺泡蛋白沉积症和早期尘肺的病人中分离的灌洗液成分非常复杂，因为除了细胞成分及细胞碎片外，还包括沉积在肺泡内的粉尘、药物、表面活性物质、分泌物和坏死物等，这些杂质直接覆盖或粘附在细胞上，影响细胞的分离。因此，如何高效分离出细胞成分一直是本领域技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，分离得到具有诊断和治疗的细胞成分。

本发明提供了一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，包括以下步骤：

1)将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀；

2)将所述沉淀重悬，得到细胞悬液；

3)将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞。

优选的，步骤2)中所述重悬用溶液为含体积百分含量1.5％～2.5％的FBS、pH值7.4的PBS缓冲液。

优选的，步骤3)中所述Percoll非连续性密度梯度离心的转速为800×g～1600×g；所述Percoll非连续性密度梯度离心的时间为15～20min，升速为3～6×g，降速为0～2×g。

优选的，步骤3)中所述Percoll非连续性密度梯度离心时，Percoll的分层液为由体积百分含量30％～40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％～80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系；

优选的，包括由体积百分含量30％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系1或由体积百分含量40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系2。

优选的，步骤1)中所述去除杂质的方法包括采用4～5层纱布过滤；

所述固液分离的方法包括离心；所述离心的转速为300×g～500×g；所述离心的时间为5～10min。

优选的，所述肺泡灌洗液来源为患弥漫性肺泡沉积疾病的病人中收集得到；

优选的，所述弥漫性肺泡沉积疾病包括肺泡蛋白沉积症、肺泡微结石症和早期尘肺。

优选的，患所述肺泡蛋白沉积症病人中收集的肺泡灌洗液中，沉积蛋白的含量为50％～70％。

优选的，得到所述细胞层后，还包括去除红细胞、去除死细胞和台盼蓝染色；

所述去除死细胞的方法采用Dead Cell Removal Kit进行去除。

优选的，所述去除红细胞包括所述细胞层去除红细胞、离心和清洗；

所述去除红细胞的方法为将所述细胞层离心去上清，加入裂红液，离心去上清，直至得到的细胞团用肉眼观察无红色出现结束。

优选的，所述台盼蓝染色判读透亮细胞未着色为活细胞，明确细胞活率；

优选的，所述活细胞包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。

本发明提供的从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，将肺泡灌洗液先去除杂质，收集沉淀细胞重悬，再用Percoll非连续密度梯度离心后，在Percoll分层液之间形成细胞层。本发明提供一种高效快速的从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，不仅能够摆脱肺泡灌洗液中痰液和大块沉渣对目标细胞的影响，而且通过Percoll非连续密度梯度离心，粉尘、分泌物以及细胞碎片和红细胞等沉降至管底或下层，而包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞在内的多种目标种类细胞沉降在Percoll分层液之间，实现巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞在内的多种功能细胞的分离，从而为相关疾病的诊断和治疗提供细胞基础。

进一步的，本发明具体限定了Percoll非连续密度梯度离心时Percoll分层液的成分。实验表明，与30％/80％、40％/60％的Percoll分层液组成密度梯度相比，采用30％/60％或40％/80％的Percoll分层液组成密度梯度离心提取的活细胞数量和得率均有显著提高。

进一步的，本发明具体限定了支气管肺泡灌洗液的来源为患弥漫性肺泡沉积疾病的病人中收集得到。由于弥漫性肺泡沉积疾病为内源性或外源性的原因导致肺泡腔内产生难以清除的固体物质，包括粉尘和多余的表面活性物质，从而影响病人换气功能导致呼吸困难，与此同时，粉尘的吸入刺激呼吸道和肺部结构产生分泌物，长期吸入导致肺间质病变，加重疾病。由于患肺部感染和弥漫性肺泡沉积疾病的病人来源的支气管肺泡灌洗液中成分较普通呼吸道疾病的样本相比，成分更为复杂，分离细胞更具难度，而采用本发明提供的方法能够解决患弥漫性肺泡沉积疾病的病人来源的支气管肺泡灌洗液的细胞分离难的问题，且分离的细胞去除绝大部分杂质，得到大量活细胞，取得理想的分离提取效果。

附图说明

图1为未处理的灌洗液的HE染色结果图；

图2为处理后杂质的HE染色结果图；

图3为处理后细胞的HE染色结果图；

图4为实施例1分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量结果；

图5为实施例3分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量结果；

图6为实施例4分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量结果；

图7为实施例5分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量结果；

图8为从低速离心分离的细胞中细胞和杂质的相对含量的空白对照(未染色)；

图9为从低速离心分离的细胞中细胞和杂质的相对含量结果。

具体实施方式

本发明提供了一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，包括以下步骤：

1)将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀；

2)将所述沉淀重悬，得到细胞悬液；

3)将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞。

本发明将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀。

本发明对肺泡灌洗液的来源不做具体限定，本发明提供的方法对患本领域所熟知的肺病或呼吸类疾病的病人来源的肺泡灌洗液均可适用提取，尤其是患弥漫性肺泡沉积疾病的病人来源的肺泡灌洗液。所述弥漫性肺泡沉积疾病优选包括肺泡蛋白沉积症、肺泡微结石症和早期尘肺。患所述肺泡蛋白沉积症的病人中收集的肺泡灌洗液中，沉积蛋白的含量优选为50％～70％，更优选为60％。本发明对收集肺泡灌洗液的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的收集方法即可。

在本发明中，所述去除杂质的方法优选包括采用4～5层纱布过滤。去除的杂质主要为气道内痰液及大块沉渣等杂质。所述固液分离的方法优选包括离心。所述离心的转速优选为300×g～500×g，更优选为500×g；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为5～8min，最优选为5min。

得到沉淀后，本发明将所述沉淀重悬，得到细胞悬液。

在本发明中，所述重悬用溶液优选为含体积百分含量1.5％～2.5％的FBS、pH值7.4的PBS缓冲液。所述PBS缓冲中FBS的体积百分含量优选为2.0％。所述重悬用溶液的用量没有特殊限制，以能够悬浮起所述沉淀的量为宜。所述重悬用溶液中FBS有利于维持待分离的细胞活力，同时PBS缓冲液有利于维持细胞的渗透压。

得到细胞悬液，本发明将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞。

在本发明中，所述Percoll非连续性密度梯度离心的转速优选为800×g～1600×g，更优选1500×g；所述Percoll非连续性密度梯度离心的时间优选为15～20min，更优选为15min；所述离心的升速优选为3～6×g，更优选为4～6×g，最优选为6×g；所述离心的降速优选为0～2×g，更优选为1～2×g，最优选为2×g。本发明对离心所用离心的种类不做特殊限制，采用本领域所熟知的离心机即可，在本发明实施例中，所述离心机型号为ThermoST40R。离心转速直接影响目标细胞的分离效果，实验表明，离心转速过大或过小，都会导致目标细胞与红细胞、细胞碎片和粉尘无法彻底分离。

在本发明中，所述Percoll非连续性密度梯度离心时，Percoll的分层液优选由体积百分含量30％～40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％～80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系；更优选包括由体积百分含量30％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系1或由体积百分含量40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系2。本发明对Percoll非连续性密度梯度体系的配制没有特殊限制，采用本领域所熟知的Percoll非连续性密度梯度体系的配制方案即可。

得到细胞层后，将细胞层用5倍体积PBS缓冲液进行清洗，然后再离心；所述离心的转速优选为300×g～500×g，更优选为500×g；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为7min。

在本发明中，当得到的细胞层后，肉眼观察有红色时，所述去除死细胞前，优选还包括所述细胞层去除红细胞、离心和清洗。所述去除红细胞的方法为将所述细胞层离心去上清，加入裂红液孵育，离心去上清，直至得到的细胞团用肉眼观察无红色出现结束。所述离心的转速优选为300×g～500×g，所述离心的时间优选为5～10min，更优选为5min。所述裂红液为红细胞裂解液，主要成分为NH₄Cl，优选购自北京雷根生物技术有限公司。所述孵育的条件优选为20～25℃下静置5～7min，裂红液同体积含2％FBS的PBS缓冲液清洗3次。

得到细胞后，将所述细胞去除死细胞后，经台盼蓝染色筛选，收集活细胞。

在本发明中，所述去除死细胞的方法优选采用Dead Cell Removal Kit进行去除。本发明对所述Dead Cell Removal Kit的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的DeadCell Removal Kit的来源即可，例如可购自Miltenyi Biotec公司。

在本发明中，所述台盼蓝染色筛选的方法优选将台盼蓝溶液和细胞悬液按照体积比为1:1混合，计数板计数。所述台盼蓝溶液的质量浓度为0.4％。所述台盼蓝染色筛选时优选选择未着色的透亮细胞为活细胞。所述活细胞优选包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，其中以巨噬细胞为主，分离得到的细胞经培养后可用于用于疾病的临床诊断及基础研究。实验表明，本发明提供的方法最终分离细胞中活细胞率为80％以上。

在本发明中，分离提取的活细胞优选包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，其中以巨噬细胞为主。采用本发明提供的分离提取方法得到的肺泡灌洗液活细胞能够用于疾病的诊断和治疗。所述疾病包括弥漫性肺泡沉积疾病。

下面结合实施例对本发明提供的一种从支气管肺泡灌洗液提取细胞的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液用4层无菌纱布过滤，去除气道内痰液及大块沉渣等杂质。过滤后的灌洗液以500×g下离心5min。得到的沉淀用含2％FBS的PBS缓冲液重悬。以Percoll密度梯度(由30％和60％Percoll分层液等体积组成)，离心沉淀悬液，离心条件为1500×g、15min、升速6×g、降速2×g。离心分离成功后，最上层为表面活性物质沉淀，细胞层在Percoll分层液中间。细胞经5倍体积、pH值7.4的PBS缓冲液清洗后离心，并根据肉眼观察到红色成分时采取裂解红细胞1～3次，以肉眼无可见红色为标准，裂红后含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞3次。收集的细胞经Dead Cell Removal Kit去除死细胞，再进行台盼蓝染色，将台盼蓝染液和细胞悬液按1:1比例混合，计数板计数后，计数并确认其活细胞，染色为蓝色的为死细胞，未着色的透亮细胞为活细胞，经统计计算，活细胞率为89.5％，可在后续诊断中应用。经过对活细胞流式细胞鉴定，主要包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，其中巨噬细胞占比最多。

将采集的肺泡灌洗液与分离得到的杂质和活细胞分别进行HE染色，结果如图1～图3所示。HE染色是采用苏木精染液使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，采用HE染色结果可以直观反映细胞的分离效果。图1的染色结果可知，未经分离的肺泡灌洗液粘液中细胞碎片与细胞交织在一起。图2的染色结果可知，Percoll密度梯度离心后位于分离液表层的杂质中主要为粉红色，表明该组分主要为细胞碎片和细胞外基质成分。图3的染色结果背景干净，主要是完整的细胞。表明，本发明分离方法能够杂质彻底分离除去，得到的细胞较为干净，便于后续细胞的培养。

实施例2

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液用5层无菌纱布过滤，去除气道内痰液及大块沉渣等杂质。过滤后的灌洗液以500×g下离心5min。得到的沉淀用含2％FBS的PBS缓冲液重悬。以Percoll密度梯度(由30％和60％Percoll分层液等体积组成)，离心沉淀悬液，离心条件为1400×g、18min、升速4×g、降速1×g。离心分离成功后，最上层为表面活性物质沉淀，细胞层在Percoll分层液中间。细胞经5倍体积、pH值7.4的PBS缓冲液清洗后离心，并根据肉眼观察到红色成分时采取裂解红细胞1～3次，以肉眼无可见红色为标准，裂红后含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞3次。收集的活细胞经Dead Cell Removal Kit去除死细胞，再进行台盼蓝染色，将台盼蓝染液和细胞悬液按1:1比例混合，计数板计数后，计数并确认其活细胞，染色为蓝色的为死细胞，未着色的透亮细胞为活细胞，经统计计算，活细胞率为81.8％，可在诊断应用。经过对活细胞流式细胞鉴定，主要包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，其中巨噬细胞占比最多。

实施例3

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液用5层无菌纱布过滤，去除气道内痰液及大块沉渣等杂质。过滤后的灌洗液以500×g下离心5min。得到的沉淀用含2％FBS的PBS缓冲液重悬。以Percoll密度梯度(由40％和80％Percoll分层液等体积组成)，离心沉淀悬液，离心条件为1600×g、12min、升速5×g、降速2×g。离心分离成功后，最上层为表面活性物质沉淀，细胞层在Percoll分层液中间。细胞经5倍体积、pH值7.4的PBS缓冲液清洗后离心，并根据肉眼观察不到红色成分时直接采用Dead Cell Removal Kit去除死细胞，再进行台盼蓝染色，将台盼蓝染液和细胞悬液按1:1比例混合，计数板计数后，计数并确认其活细胞，染色为蓝色的为死细胞，未着色的透亮细胞为活细胞，经统计计算，活细胞率为83.2％，可在后续诊断中应用。经过对活细胞流式细胞鉴定，主要包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，其中巨噬细胞占比最多。

实施例4

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液用4层无菌纱布过滤，去除气道内痰液及大块沉渣等杂质。过滤后的灌洗液以500×g下离心5min。得到的沉淀用含2％FBS的PBS缓冲液重悬。以Percoll密度梯度(由30％和80％Percoll分层液等体积组成)，离心沉淀悬液，离心条件为1500×g、15min、升速3×g、降速2×g。离心分离后，细胞层在分层液中间位置。细胞经5倍体积、pH值7.4的PBS缓冲液清洗后离心，并根据肉眼观察到红色成分时采取裂解红细胞1～3次，以肉眼无可见红色为标准，裂红后含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞3次。收集的活细胞经DeadCell Removal Kit去除死细胞，再进行台盼蓝染色，将台盼蓝染液和细胞悬液按1:1比例混合，计数板计数后，计数并确认其活细胞，染色为蓝色的为死细胞，未着色的透亮细胞为活细胞，经统计计算，活细胞率为80.2％。经过对活细胞流式细胞鉴定，主要包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，其中巨噬细胞占比最多。

实施例5

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液用4层无菌纱布过滤，去除气道内痰液及大块沉渣等杂质。过滤后的灌洗液以500×g下离心5min。得到的沉淀用含2％FBS的PBS缓冲液重悬。以Percoll密度梯度(由40％和60％Percoll分层液等体积组成)，离心沉淀悬液，离心条件为1500×g、15min、升速3×g、降速0×g。离心分离后，细胞层在分层液中间位置。细胞经5倍体积、pH值7.4的PBS缓冲液清洗后离心，并根据肉眼观察到红色成分时采取裂解红细胞1～3次，以肉眼无可见红色为标准，裂红后含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞3次。收集的活细胞经DeadCell RemovalKit去除死细胞，再进行台盼蓝染色，将台盼蓝染液和细胞悬液按1:1比例混合，计数板计数后，计数并确认其活细胞，染色为蓝色的为死细胞，未着色的透亮细胞为活细胞，经统计计算，活细胞率为86.9％。经过对活细胞流式细胞鉴定，主要包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，其中巨噬细胞占比最多。

将肺泡灌洗液与实施例1、3～5中分离的细胞和杂质组分分别进行Hoechst 33258染色(参见W.Sterzel；P.Bedford；G.Eisenbrand(1985).Automated determination ofDNA using the fluorochrome Hoechst 33258.,147(2),462–467.)，得到的细胞成分和杂质成分分别进行流式细胞仪检测，得到分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量。

对比例1

从患肺泡蛋白沉积症病人体内取出肺泡灌洗液后，迅速转移至4℃环境中保存，尽快转运到实验室。将灌洗液进行500×g转速下离心5min条件下分离得到细胞层。将分离得到的细胞层分成两份，一份进行Hoechst 33258染色，另外一份不染色作为空白对照，二者均进行流式细胞检测，得到分离的细胞和杂质组分中细胞和杂质的相对含量。

流式细胞检测结果见图4～图9。由图9可知，肺泡灌洗液未经处理直接进行流式细胞分析发现，该组分中杂质占比巨大，达到95.6％，而细胞占比仅为3.67％，由此可知，从肺泡灌洗液去除绝大部分杂质分离获取细胞难度较大。由图8可知，该杂质组分经低速离心处理，杂质占比仍然较大，达到84.3％，而细胞占比仅为15％。而本发明中通过Percoll密度梯度方法分离的细胞成分能够去除决大部分的杂质，得到能够用于后续培养的细胞，这表明本发明利用Percoll密度梯度方法实现细胞的分离。

针对Percoll密度梯度方法中不同的分层液成分对分离效果有影响：采用30％/60％的Percoll密度梯度方法分离的细胞成分中细胞得率最高，达到93.5％，杂质成分中细胞得率仅为12.9，其次为40％/80％的Percoll密度梯度方法，细胞得率为86.9％；而40％/60％的Percoll密度梯度方法较低，细胞得率为82.7％；30％/80％的Percoll密度梯度方法分离的细胞成分中细胞得率最低，仅为79.9％，杂质成分中细胞得率为16.3％。由此可见，密度梯度离心不同浓度组成的密度梯度溶液也能够影响肺泡灌洗液中细胞分离效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀；所述支气管肺泡灌洗液的来源为患弥漫性肺泡沉积疾病的病人中收集得到；

2)将所述沉淀重悬，得到细胞悬液；所述重悬用溶液为含体积百分含量1.5％～2.5％的FBS、pH值7.4的PBS缓冲液；

3)将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞；所述Percoll非连续性密度梯度离心的转速为800×g～1600×g；所述Percoll非连续性密度梯度离心的时间为15～20min，升速为3～6×g，降速为0～2×g；

所述Percoll的分层液为由体积百分含量30％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系1或由体积百分含量40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系2。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述去除杂质的方法包括采用4～5层纱布过滤；

所述固液分离的方法包括离心；所述离心的转速为300×g～500×g；所述离心的时间为5～10min。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述弥漫性肺泡沉积疾病包括肺泡蛋白沉积症、肺泡微结石症和早期尘肺。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，患所述肺泡蛋白沉积症病人中收集的肺泡灌洗液中，沉积蛋白的含量为50％～70％。

5.根据权利要求1～4任意一项所述方法，其特征在于，得到所述细胞层后，还包括去除红细胞、去除死细胞和台盼蓝染色；

所述去除死细胞的方法采用Dead Cell Removal Kit进行去除。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述去除红细胞包括所述细胞层去除红细胞、离心和清洗；

所述去除红细胞的方法为将所述细胞层离心去上清，加入裂红液，离心去上清，直至得到的细胞团用肉眼观察无红色出现结束。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述台盼蓝染色判读透亮细胞未着色为活细胞，明确细胞活率；

所述活细胞包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。

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