JP3416779B2 - ウイルス汚染について血液単位を試験するための方法及び装置 - Google Patents

ウイルス汚染について血液単位を試験するための方法及び装置

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、一般的には診断技術に関する。より具体的
には、本発明は、ウイルス汚染についての血液単位の試
験に関する。
輸血及び移植等のような種々の療法において、体液特
に、赤血球、血小板、血漿及び骨髄等のような血液成分
が、一人又はより多くの個体から患者へ注入される。そ
のような療法−−−それらのうちには救命的であり他の
方法では提供できないものがある−−−は治療を提供は
するものの、感染性疾患の伝染のためにそのような治療
には潜在的危険性があり得る。
例えば、血液は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイ
ルス（エイズの病原因子）、サイトメガロウイルス、EB
ウイルス、及びヘルペスウイルス等のような感染性因子
を担持し得ることが知られている。そのようなウイルス
を含有するおそれのある血液を同定するためのスクリー
ニング法が存在するが、現行のスクリーニング法は、そ
のようなウイルスを含有する各々の血液単位を同定する
ことを保証はしない。
これに関し、HIV等のようなウイルス性汚染について
の血液成分の試験における困難の一つは、現行の診断試
験の多くが抗体の同定に基づいていることである。従っ
て、それらは、その血液がそのウイルスに対する抗体、
例えば抗HIV抗体を含む場合しか、陽性試験結果を示さ
ない。しかしながら細胞内ウイルス感染では、個体は、
感染直後には抗体を産生しない。寧ろ、ウイルスへの患
者の最初の感染から抗体の産生までにわたる「ウィンド
ウ期間」がある。個体がこのウィンドウ期間にあるとき
は、抗体に基づく診断試験は、該個体又は血液単位が感
染しているとは同定しないであろう。しかしながら、抗
体が存在しないといえども、その血液単位はやはり感染
を伝達しうる。
このウィンドウ期間は、HIV感染に関しては、６週な
いし48ヵ月にわたるものと信じられている。この期間の
間は、HIVに感染し従ってその血液がこれを伝染するで
あろう個体も、陰性抗体反応を示すであろう。従って現
行のスクリーニング試験は、HIVに感染しているが抗HIV
を産生していない個体からの血液単位をウイルスに汚染
されているとは同定しないであろう。
個体がウィンドウ期間にあるために汚染されているか
も知れない血液単位を同定するために、最近の試みは、
核酸配列診断技術の使用に焦点を当ててきた。特に、HI
Vウイルスの核酸配列を検出するためにポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）技術を使用するための試みが成されてき
た。
PCRを用いる多数の方法が知られている。要約する
と、一つのPCR法においては、DNAを含有するサンプル
が、適当な緩衝液、ヌクレオシド三リン酸、熱安定性DN
Aポリメラーゼ、及び、関係のDNA領域の末端に対し相補
的なオリゴヌクレオチドプライマーを含んだ反応管中に
入れられる。初めに、試験する二本鎖DNAを変性させる
ために、反応温度が急速に高められる。次いで、オリゴ
ヌクレオチドプライマーがそれらの相補的配列にアニー
リングするよう、温度が下げられる。温度を上昇させる
ことによって、該ポリメラーゼの活性の至適温度におい
てDNAの延長が起こる。変性−アニーリング−延長とい
うこのサイクルを繰り返すことにより、数百塩基対より
なる一本鎖を増幅することができる。この増幅は、106
倍の範囲にあることができ、比較的容易に検出できる。
Conway,“Detection of HIV−1 by PCR in Clinical Sp
ecimens",“Techniques in HIV Research",Stockton Pr
ess（1990）． 核酸配列技術は非常に敏感ではあるが、それらはまた
サンプル特異的でもある。更には、そのように処理され
た血液単位のサンプルは、治療的適用のためには使用不
能にされる。この故に、現在のところ、核酸配列診断法
は、血液単位がウイルス性汚染を有さないことの保証を
するための方法を提供していない。
例えば、標準の技術を用いて血液単位のサンプルを試
験するためにPCR技術を使用することを試みるならば、
試験が陰性であったとしても、その単位がウイルス性汚
染を含まなかったと保証することができないであろう。
この点、PCR試験は、血液単位全体が試験されるのでな
い限りサンプル特異的であるため、その単位がウイルス
性汚染を含まなかったということを正確には反映しない
であろう。もしも10mlのサンプルしか試験されなかった
のならば、300mlのうちの残りの290mlは、ウイルス性汚
染を含み得る。
PCR試験は、単位全体に中にではなく、アッセイして
いる当該サンプル中にウイルス因子があるか否かを判定
するだけである。この試験は成分の生存力を破壊するか
ら、従って、例えばHIV等による汚染がないことを保証
するために全成分を試験することは不可能であった。
従って、感染の「ウィンドウ期間」中におけるウイル
ス汚染を判定するための、血液単位の改良された診断試
験に対する需要がある。
発明の要約 本発明は、ウイルス汚染について血液単位を試験する
ための、当該血液単位を治療適用に使用不能にしてしま
うことのない方法を提供する。該方法は、例えば核酸配
列技術を用いて、血液単位全体を効果的なサンプルする
ことを許容する。該方法は、ウイルス性汚染についての
診断試験の正確さを改善する。
典型的には感染性疾患についての診断試験の正確さを
向上させるためにはアッセイされるサンプル量を増やす
ことが望ましいが、血液成分に関しては、これは不可能
である。血液及びその成分の場合、血液成分全体の僅か
な部分を感染性疾患についての診断アッセイの実施のた
めに犠牲にすることしかできない。血液単位全体をサン
プルすることが不可能であることは、診断試験（核酸増
幅技術を含む）に、サンプル量による明白な限界を設け
るものである。すなわち、１）アッセイ結果は真に陰性
でありうるが、単位は陽性でありうるか、又は２）アッ
セイ感度の欠如のためにアッセイ結果が偽の陰性であり
うることである。本発明は、これらの限界の双方に向け
られている。
この目的のため、本発明は、治療的適用に当該血液単
位を使用不能にしてしまうことなしにウイルス性汚染に
ついて血液ユニットを試験するための方法を提供する。
該方法は、血液単位からそこに存在する白血球の大部分
を除去して収集するステップと、そしてウイルス性汚染
について該血液単位を試験するために該収集された白血
球を使用するステップと、を含む。
一具体例においては、本発明は、当該血液単位を治療
的適用に使用不能にしてしまうことなしにウイルス性汚
染について血液単位を試験するための方法であって、血
液単位を、血小板リッチ血漿成分と、軟層と、そして赤
血球成分とに分離するステップと、該軟層を除去するス
テップと、そしてウイルス性汚染について該軟層をアッ
セイするステップと、を含む方法を提供する。
好ましい具体例において、本発明は、血球の混合した
集団から白血球リッチサンプルを作り出すための方法で
あって、ある量の血液を血漿及び赤血球を含んだ混合血
球集団を有する軟層を含んだ層へと分離するステップ
と、液体を受け入れるための開口を有するチャンバーを
準備するステップと、該軟層を該チャンバー内へ入れる
ステップと、該軟層を少なくとも血漿層、白血球層、及
び赤血球層に分離するために該チャンバーを遠心するス
テップと、そして該チャンバー内の該白血球層を他の層
から分離するステップと、を含む方法を提供する。
一具体例においては、該白血球層は５×108個以下の
赤血球を含む。
一具体例においては、該白血球層は、５×109個以下
の血小板を含む。
−具体例においては、該チャンバーは、少なくとも30
0×ｇの遠心力に曝される。
一具体例においては、該チャンバーは、約750×ｇの
遠心力に曝される。
一具体例においては、該チャンバーは約５乃至約10分
間遠心される。
一具体例においては、該チャンバーはシリンジによっ
て規定されている。
本発明は、別の具体例においては、当該血液単位のう
ち少なくとも血小板リッチ血漿層及び赤血球リッチ層を
治療的適用に使用不能にしてしまうことなしに、ウイル
ス性汚染について血液単位を試験するための方法であっ
て、ある量の血液を、血小板リッチ血漿層、赤血球リッ
チ層、及び、血漿及び赤血球を含んだ血球の混合集団を
含んだ軟層に分離するステップと、液体を受け入れるた
めの開口を有するチャンバーを準備するステップと、該
軟層を該チャンバー内に入れるステップと、該軟層を少
なくとも血漿層、白血球層、及び赤血球層に分離するた
めに該チャンバーを遠心するステップと、該白血球層を
該チャンバー内の他の層から分離するステップと、ウイ
ルス性汚染について該白血球層をアッセイするステップ
と、そして、アッセイが該白血球層にウイルス性汚染の
無いことを判定したならば、治療的適用のために該血小
板リッチ血漿層又は該赤血球リッチ層のうち少なくとも
一方を使用するステップと、を含む方法を提供する。
別の一具体例においては、当該血液単位の少なくとも
血小板リッチ血漿層又は赤血球リッチ層を使用不能にし
てしまうことなしにウイルス性汚染について血液単位を
試験するための方法であって、ある量の血液を血漿と赤
血球とを含んだ混合血球集団を有する軟層を含んだ層に
分離するステップと、液体を受け入れるための開口と、
チャンバーとそして該チャンバー内に受け入れられたプ
ランジャーとを有するシリンジを準備するステップと、
該チャンバー内へ該軟層を入れるステップと、該チャン
バー内へのプランジャーの軸方向の動きを阻止するため
の手段を該プランジャーの少なくとも一部の周りに固定
するステップと、該軟層を少なくとも血漿層、白血球
層、及び赤血球層に分離するために該システムを遠心す
るステップと、該白血球層を該チャンバー内の他の層か
ら分離するステップと、を含む方法が提供される。
加えて、本発明は、混合血球集団から白血球リッチサ
ンプルを得る際に使用するためのシステムを提供する。
該システムは、液体を受け入れるための第１の開口を有
するチャンバーと該チャンバー内へ液体を押し入れ又は
押し出すための該チャンバー内に受けいられたプランジ
ャーとを有するチャンバーを含んだシリンジを含む。該
システムはまた、該チャンバー内への該プランジャーの
軸方向の動きを阻止する、除去可能な手段をも含む。一
具体例においては、該手段は、該プランジャーの少なく
とも一部分の周りに結合させたスリーブである。一具体
例においては、該シリンジは、該開口から延びるカニュ
ーレを含む。
本発明の更なる特徴及び利点は、現在好ましい具体例
の詳細な記述及び図面に記載されており及びこれから明
らかであろう。
図面の簡単な記述 図１は、ウイルス性汚染について血液成分を試験する
ための方法の一具体例を概念的に図解する。
図２は、ウイルス性汚染について血液成分を試験する
ための方法の更なる一具体例を概念的に図解する。
図３は、本発明の修正されたシリンジの一具体例を図
解する。
図４は、線IV−IVに沿ってとった図３のシリンジの具
体例の断面図的上面図を示す。
図5a−5dは、本発明の方法の一具体例を概念的に図解
する。
図６は、本発明のシリンジの一具体例による1000×ｇ
での低速軟層調製の工程の前後における、実施例１から
得られた試験結果を、そして特に細胞の表現型をグラフ
により図解する。
図７は、本発明のシリンジの一具体例による750×ｇ
での低速軟層調製の工程の前後における、実施例１から
得られた試験結果を、そして特に細胞の表現型をグラフ
により図解する。
図８は、本発明のシリンジの一具体例による500×ｇ
での低速軟層調製の工程の前後における、実施例１から
得られた試験結果を、そして特に細胞の表現型をグラフ
により図解する。
図9aは、本発明のシリンジの一具体例による、新鮮な
すなわち４時間齢未満の血液についての、異なった遠心
速度での軟層調製の工程の前後における、実施例１から
得られた試験結果を、そして特に細胞の表現型をグラフ
により図解する。
図9bは、本発明のシリンジの一具体例による、48時間
齢の軟層について、異なった遠心速度での軟層調製の工
程の前後における、実施例１から得られた試験結果を、
そして特に細胞の表現型をグラフにより図解する。
図10aは、本発明のシリンジの具体例による、新鮮な
すなわち４時間齢未満の血液についての、異なった遠心
速度での軟層調製の工程の前後における、実施例１から
得られた試験結果を、そして特に細胞の表現型をグラフ
により図解する。
図10bは、本発明のシリンジの具体例による、24時間
齢の軟層について、異なった遠心速度での軟層調製の工
程の前後における、実施例１から得られた試験結果を、
そして特に細胞の表現型をグラフにより図解する。
図11は、ウイルス除去／不活性化プロセスを検証する
ための本発明の一具体例の使用を概念的に図解する。
現在好ましい具体例の詳細な記述 本発明は、ウイルス性汚染について血液成分を試験す
るための改良された方法を提供する。本発明の方法は、
投与されるべき当該血液単位を犠牲にすることなく診断
試験の正確さを改善する。加えて、本発明は、血液成分
を試験するための装置及び改良されたシステムを提供す
る。この目的に向けて、本発明は、当該細胞製品を治療
適用に使用不能にしてしまうことなしに、ウイルス性汚
染について全血、赤血球、又は血小板濃縮物の全体がサ
ンプルされることを許容する。
一具体例においては、本発明は、全血分離工程から、
白血球、赤血球及び血小板の混合集団を有するものであ
る軟層画分を収集するために改良されたシリンジを使用
する段階を含む。該シリンジが該軟層を受け入れた後、
該シリンジチャンバー内への該プランジャーの動きを阻
止するための手段が該シリンジに取り付けられる。該シ
リンジは遠心される。該阻止手段のために、プランジャ
ーはシステムチャンバー内へと動かず、軟層が該シリン
ジから排除されるのを防止する。
該遠心工程を経て軟層は、血漿、白血球及び赤血球へ
と分離される。次いで血漿を搾り出して白血球から分け
ることができ、そして白血球は試験用に容易に隔離でき
る。こうして、リッチ白血球サンプルが、血液成分を損
傷することなく捕獲される。白血球を捕獲するための該
方法及び装置は、以下に詳細に提示されよう。
血液製品の輸血のための３つの主要な適応症がある。
すなわち、１）酸素運搬性の赤血球の欠乏、２）血小板
又はタンパク質性の凝固因子を含む血液凝固に関係した
血液学的因子の欠乏、及び３）血漿量の欠乏、である。
輸血を必要とする患者は、全血を受けず、その臨床的欠
乏を克服するに必要な特定の成分を輸血される。例え
ば、化学療法又は放射線療法を受けている患者は、主と
して血小板を必要とし、赤血球の必要性はより低い。骨
髄又は他の器官の移植患者及び透析患者は、一般に、赤
血球のみを必要とする。
白血球は、酸素運搬性の赤血球、血小板又は血漿の治
療効果に関係せず且つHLA抗原に対する異系同種免疫に
おけるそれらの役割のために輸血に関連した危険性と、
そしてウイルス運搬性細胞として働くことによって輸血
後感染に関連した危険性を増大させるのに関係するとさ
れていることから、望ましくない。典型的には、輸血さ
れる血液成分の約10％において、白血球は濾過工程によ
って除去されている。
濾過工程が用いられる場合、これらのフィルターに捕
獲された白血球は廃棄される。以下に詳細に示すよう
に、本発明の一具体例においては、白血球を含んだフィ
ルターは、ウイルス性マーカー（ウイルス性核酸配列及
び／又は抗原）を回収及び／又は増幅する工程のための
出発材料として使用することができる。
本発明の一具体例によれば、白血球の大半、50％より
多くが収集される。用いられる方法に依存して、白血球
の99.8％までを収集し得る。白血球は典型的には血液の
うち0.25％の細胞成分を構成する。白血球カウント750
万個/ml血液が、成人についての平均と考えられてい
る。63mlの抗凝固剤溶液を含んだ全血の500mlの単位中
に、3.2×109個の白血球が存在するであろう。
白血球は血液中の感染性の源であるから、それらは、
診断アッセイのための望ましい材料を提供する。更に
は、収集された白血球は、輸血される血液成分の小さな
一部分でなく単位全体に由来するものであるため、改良
された診断手順が達成される。
図１は、本発明の方法の一具体例を概念的に図解す
る。血液成分（全血、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、又
はプール血小板濃縮物であることができる）は、先ず、
存在する白血球の90乃至99％より多くを捕獲するよう設
計されたフィルターを通される。
本発明に従って使用できる白血球フィルターには、旭
化成工業（東京）より入手できるSepacell R−500フィ
ルター及びPall Biomedical Corp.（East Hills,New Yo
rk）より何れも入手できる血液濾過用RC−100及び血小
板濾過用PL−100が含まれる。Biotechnology ＆ Medica
l,August 19,1988に、旭化成工業のフィルターが全血中
に存在する白血球の99.8％を除去することができるとい
うことが報告されている。
濾過された血液成分は血液収集バッグ中に収集され
る。その血液成分は診断試験の結果が出るまで貯蔵され
る。
本発明の一具体例に従えば、白血球フィルターが感染
性疾患抗原及び核酸配列について診断試験をするための
源材料として利用される。この目的のため、該フィルタ
ーは該フィルター中に含まれる細胞を溶解するために処
理される。これは該白血球中に含まれている核酸及び抗
原の回収を許容する。
細胞を、溶解剤を使用することによって溶解する。該
溶解剤は好ましくは、細胞質膜を破壊して細胞の核を遊
離させる界面活性剤を含むものであろう。
細胞溶解液を、次いで、等張食塩水を用いてフィルタ
ーから洗い出して収集する。この得られた細胞溶解液
を、次いで、診断アッセイ（ウイルス性核酸配列のため
の核酸増幅技術、例えばPCR又は3SR、又はウイルス抗
原、例えばELISAのための試験材料として使用する。
本発明によればアッセイが血液単位中に存在する白血
球の大多数の分析に基づいていることから、PCR法のよ
うなサンプル特異的分析を用いる場合でさえも、もし個
体が感染のウィンドウ期間中であったとしても、陰性結
果が正確であることを保証することができる。
細胞溶解液を用いて一旦陰性結果が得られれば、収集
容器中のその血液成分は、患者へ輸血することができ
る。
図２は、本発明の別の具体例を概念的に示す。アッセ
イの感度を（特に抗原捕獲アッセイシステムのために）
向上させることが必要なら、ウイルス複製物のための培
養チャンバーとして白血球フィルターを利用することが
できる。
この場合、やはり血液成分（全血、赤血球濃縮物、血
小板濃縮物、又はプールした血小板濃縮物）は白血球フ
ィルターを通して濾過される。白血球フィルターは、濾
過済の血液成分を収容した血液バッグ容器から分離さ
れ、10％胎仔牛血清RPMI 1640培地のような組織培養培
地によって洗い流される。場合によっては、白血球中に
おけるウイルス複製を促進するため及びフィルター中の
細胞の生存力を維持するために、培地にサイトカイン
〔例えば、IL−２又はＴ細胞マイトジェン（例えば、PH
A）〕）を補足することが望ましいであろう。
加えて、場合によっては、もしも組織培養培地がウイ
ルス宿主細胞系（例えばHIVのためにはH9細胞）を補強
されているならば望まいしであろう。この場合、フィル
ターは、血液から捕獲された白血球のための及びウイル
ス宿主細胞のための培養チャンバーとして使用されよ
う。H9細胞を、次いで、この捕獲された白血球中のHIV
に感染させることができ、ウイルス抗原（例えばHIV p2
4抗原）の産生を増幅する働きをすることができる。
約１乃至５日の適当な培養期間の後、捕獲された細胞
の溶解を達成するために数種の手段（凍結融解、界面活
性剤、低浸透圧衝撃）のうちの一つによってフィルター
を処理することができる。得られた細胞溶解液を、次い
で、フィルターを等張食塩水によって洗い流すことによ
り収集することができる。
収集された細胞溶解液は、例えばDuPont HIV p24 Car
e Profile,Elisa Kit又はCoulter HIV p24 Antigen Ass
ay（Hialeah,Florida）のような慣用の抗原捕獲アッセ
イシステムを用いて、HIV p24抗原について、又はGene
Amplimer HIV−1 Reagents及びGeneAmp PCR Core Rea
gents及びPerkin−Elmer Cetusより入手できるPerkin−
Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerのような核酸増幅法に
よって、試験することができる。場合によっては、感染
細胞から組織培養培地中へウイルスが遊離するために、
細胞溶解液は必要でないであろう。
やはり、この方法を用いることによって、サンプル特
異的診断試験が用いられた場合でさえも、この試験は存
在している白血球の大多数に関するものであることか
ら、陰性試験はその血液成分が汚染されていないことを
保証するであろう。血液バッグ容器中に収容されている
血液成分を次いで患者に輸血することができる。
本発明の一具体例においては、白血球を捕獲するため
に血液成分を濾過する代わりに、全血単位を種々の成分
へと分離する遠心工程を用いることができる。典型的な
遠心工程の間に、全血は血小板リッチ血漿を含んだ最上
部、白血球を含んだ中央層又は軟層、及び底部の赤血球
リッチ層へと分離される。
本発明によれば、軟層が診断適用のために用いられ
る。この目的のため、軟層は、核酸増幅、例えばPCR又
はESR、又はウイルス抗原捕獲アッセイに付すことがで
きる。軟層を試験することによって、もしも陰性結果が
得られたとき、血小板リッチ血漿成分も赤血球成分もウ
イルス性汚染を含んでいないことが保証される。標準の
技術を用いて軟層を収集することによって、白血球の少
なくとも約80％が回収されると信じられている。
一具体例においては、次の方法が使用される。
1. 冷凍遠心機中において倒置した配置で全血を含んだ
血液バッグを、「ヘビー」スピンを用いて５℃にて遠心
する。
2. リングスタンド又は倒置血漿圧搾装置に、遠心され
た倒置されたバッグを吊るす。血液の温度は操作の間10
℃を超えてはならない。バッグを揺することなく数分間
放置する。
3. 移し替えバッグを該血液バッグの下方において秤
（例えば食品秤）に載せる。秤をゼロに調節する。
4. 内容物の攪拌を避けつつ一次バッグの蓋を刺通し、
赤血球を移し替えバッグへ流す。赤血球の少なくとも80
％を該衛星バッグに移し替えなければならない。搾り出
されるべき赤血球の量を計算するために、バッグ中の血
液量（抗凝固剤を除く）×供血者のヘマトクリット（女
性については40％、男性については43％と仮定）（1ml
の赤血球（RBC）は1.06gの重さである）を推定する。
5. バッグ中に残っている血液は、軟層、幾らかの残存
赤血球、及び血漿を含む。
6. 内容物を混合しそして調製物を遠心して軟層をペレ
ット化する。
7. 血漿を衛星容器内へ絞り出す。
8. 精製された軟層調製物を得るために、軟層中の残存
赤血球は、低張塩化アンモニウム溶液その他の赤血球溶
解試薬を加えることによって溶解することができる。
9. この細胞調製物が、標準の方法を用いたPCRその他
の分析によって処理される。
一具体例においては、好ましくは、軟層は、供血から
24時間以内に収集される。
軟層を得るのに、Baxter Internationalの子会社より
入手できる商標Optipress の下に販売されている装置
を用い、及び商標Optipak の下に販売されている使い
捨て器材を用いる、他の方法を用いることができる。米
国特許第4,350,585号及び第4,608,178号をも参照し、参
照によりその開示をここに導入する。
伝統的な分離方法を用いると、得られる軟層は、混合
集団を有する。該層は、それにより、白血球に加えて血
小板、及び赤血球を含む。この追加の集団は軟層中に存
在する白血球のPCR分析を妨害する。本発明によれば、
伝統的な方法で得られた混合集団を有する軟層から実質
的に純粋な白血球サンプルを作り出すための方法が提供
される。
この目的のため、例えばOptipress 装置を用いた典
型的な方法によって軟層画分が収集された後、修正され
たシリンジを軟層を収集するために用いることができ
る。今や図３を参照して、一具体例においては、シリン
ジ20は、本体25、開口24及びチャンバー26を含む。好ま
しくは、図５に図解されているように、シリンジはカニ
ューレ22を含む。しかしながら、シリンジにカニューレ
を備えることはある種の適用においては必要でない。加
えて、適用又は用途に応じて、カニューレは尖ったカニ
ューレでも鈍いカニューレでもよい。
チャンバー26内に受け入れられているのは、プランジ
ャー28である。プランジャー28は、当該分野において知
られている通り、液体をチャンバー26内に吸引しそして
そこから排除する。
加えて、修正されたシリンジシステム20は、プランジ
ャースリーブ30を含む。プランジャースリーブ30は、以
下に詳細に論じられているようにプランジャーがチャン
バー26内へと動くのを阻止する。
図5a〜5dは、本発明の一具体例を概念的に図解する。
使用においては、カニューレ22は混合集団を含んだもの
である軟層画分34を含んだ容器32を刺通する。容器は、
軟層を含む諸層へと分離された血液を収容することがで
き、又は図解されている容器32は、軟層34のみを含むこ
とができる。収集される軟層の量は分離された成分及び
その液量に依存して変化する。従って、チャンバーの容
量も、所望により同様に変更することができる。
カニューレ22が一旦容器32を刺通すると、軟層はプラ
ンジャー28をチャンバー26から外へと引くことによって
収集される。これは、軟層34をシリンジ20のチャンバー
26によって受け入れさせる。
本発明によれば、シリンジ20、特にチャンバー26内に
軟層34が受け入れられた後、プランジャースリーブ30
が、プランジャー28上に配置される。この図解された具
体例においてはプランジャースリーブはスリット31を含
んだプラスチック片であって、そのためそれはプランジ
ャー28上を滑らせてプランジャーの周りに結合させるこ
とができるものであるが、プランジャーの動きを阻止す
るための如何なる手段も利用することができる。例え
ば、プランジャースリーブ20は、プランジャーの周りに
結合させるために該スリーブが開かれることを許容する
ヒンジを有する部材を含むことができよう。同様に、プ
ランジャースリーブは、プランジャーの周りに固定され
る複数片よりなる部材であることもできよう。プランジ
ャースリーブ30は、シリンジ20のチャンバー26内へのプ
ランジャー28の軸方向の動きを阻止する。
シリンジ20にプランジャースリーブ30が固定された
後、シリンジ20を、次いで、遠心することができる。こ
の目的のため、好ましくは、カニューレ22は除去され開
口24はキャップその他の手段によって除去可能にシール
される。図5cに図解されているように、シリンジ22は、
次いで、遠心管36内に配置される。例として、もしも5c
cのシリンジが用いられるのならば、該シリンジを受け
るために50ccの遠心管を用いることができる。
シリンジ22を次いで遠心し、軟層の混合集団を、血漿
層40、白血球層42、及び血漿リッチ赤血球層44に分離さ
せる。この分離は、軟層34中の細胞成分の異なった密度
のためである。図5dに図解されているように、細胞のう
ちで最も重い赤血球はチャンバー26の底部にパックさ
れ、白血球及び血小板はシリンジ20のチャンバー26内に
順次の層を形成する。図5dに図解されているように、従
って、血漿層40は第１の層であり、白血球層は第２の層
であり、そして赤血球層44は第３のすなわち底部の層で
あろう。
遠心工程の後、PCR分析のために白血球層42が残りの
層から分離される。これらの層を分離するために種々の
方法を用いることができる。該図解されている具体例に
おいては、サンプル収集管46をシリンジ20の開口24の周
囲に結合することができる。プランジャースリーブ30が
除去され、そしてプランジャー28がついでチャンバー内
へと付勢されて第１の血漿層40を該サンプル収集管46を
通して絞り出す。この層は、実質的に澄明であるか又は
僅かに黄色である。
血漿層40の後、白血球層42が次いでサンプル管46内へ
と搾り出される。血漿の色から識別できる白色を有する
ことから、いつ白血球層42が該収集管内に受け入れられ
始めたかを実施者は容易に判定することができる。白血
球層42の全てが該サンプル管46内に受け入れられてしま
うと、管はシールされる。操作者は、白血球層42（白
い）と赤血球層48（赤い）との間を区別するラインを容
易に判定することができる。管46は、ヒートシールを含
む種々の手段でシールすることができる。
白血球を含んだ管46を、次いでPCR分析に用いること
ができる。望むならば、例えば、PCR診断又は貯蔵のた
めに白血球を他の容器へ移し替えることができる。
白血球を収集するのに管を使用するのに代わるものと
して、バキュテーナー管（図解せず）を用いることがで
きる。この目的のため、サンプルを抜き取るのにバキュ
テーナー管を用いる際、与えられた量のサンプルが収集
されたとき停止する一層小さいシリンジスリーブ（図解
せず）が、チャンバープランジャーに取付けられよう。
本発明の方法は、最小限の技術的操作で15分未満のう
ちに高濃度の白血球を収集することを許容する。加え
て、シリンジ20及びチャンバー26は、血液センター技術
者が血液運搬性の病原体に曝されるのを減少する閉鎖系
である。チャンバー26から収集された白血球は、HIV、C
MV及び肝炎を含むウイルス性汚染について血液製品をス
クリーニングするための細胞源として使用することがで
きる、実質的に純粋な、白血球のリッチな収集物であろ
う。
加えて、本発明の方法の一利点は、赤血球による汚染
レベルが低く、PCR分析にサンプルを直接用いることを
許容する白血球のサンプルを提供することである。更に
は、白血球を貯蔵するために管を用いることによって、
管には、例えばサンプルのラベルリングの過誤の可能性
を減ずるバーコードのようなラベルを付すことができ
る。
例として、そして限定としてでなく、本発明の一具体
例が今や提示されよう。
実施例１ この実験は、Optipress 装置及びOptipak 使い捨
て器材（簡潔のため以下「Optipress 装置」という）
を用いて得られた軟層調製物から図３〜５に図解された
装置及び方法を用いて白血球を単利する方法論を検証す
る。この試験は、血球の混合集団（赤血球、血小板、白
血球）からの、種々の遠心力及び時間における図３のシ
リンジチャンバーを用いた白血球リッチサンプルの収集
に焦点を当てた。
細胞源：軟層は、Interstate Blood Bankから又はOptip
ress 装置を用いて社内供血者から調達した種々の年
齢の血液単位から調製した。要約すると、全血単位を＞
3500×ｇ（高速）で遠心し、又はOptipressシステムを
用いて処理した。高速軟層調製物（30〜50ml）は、白血
球及び高濃度の血小板及び赤血球を含んでいる（平均HC
T＝55％）。低速軟層調製物は、低レベルの夾雑血小板
及び赤血球を含んでいる（平均HCT＝42.2）。分離プロ
トコールにおいて使用するまで、これらの軟層は室温に
維持した。
モノクローナル抗体：フルオレッセイン又はフィコエリ
スリン（phycoerythrin）（PE）と接合させたマウス抗I
gGモノクローナル抗体を、Becton Dickinson（Mountain
View,California）より購入した。CD3（Leu ４）、CD
（Leu ３）、CD8（Leu 2a）、CD14（Leu M3）、CD16
（Leu 11c）、CD11b（抗Cr3）、CD19（Leu12）又はCD4
5（HLe）に特異性を有するモノクローナル抗体を、シリ
ンジチャンバー内における分離の前後において種々の白
血球亜集団の分布を測定するために使用した。
FACS溶解溶液:FACS溶解溶液は、Becton Dickinson（Mou
ntain View,California）より10倍濃度として調達し、
使用前に滅菌水によって作業用１倍溶液へと希釈した。
この溶解試薬は、モノクローナル抗体による全血又は血
液製品（高レベルの赤血球汚染を含む血液製品）の直接
的免疫蛍光染色に続いて、フローサイトメトリー分析に
先立って赤血球を溶解させるために使用した。
修正シリンジ白血球収集チャンバー：修正シリンジ白血
球収集チャンバーは、図３に図解されている5mlの使い
捨てのプラスチックシリンジを用いている。該装置の他
の構成要素は、取外し可能なシリンジスリーブ、及びサ
ンプル収集管である。チャンバー内における白血球分離
は、血液中の細胞成分の密度の差に基づくものである。
細胞分離法：高速又は低速軟層調製物を用いて、異なっ
た遠心力及び時間を、白血球分離を実施するときに評価
した。
Optipress 装置を用いて得られた軟層画分の4mlの
サンプルをチャンバー内に引くことによって、チャンバ
ーに負荷した。遠心中にシリンジが潰れるのを阻止する
ためシリンジスリーブをプランジャーに取り付け、そし
てチャンバーを50mlの遠心管内に配置した。低速軟層調
製物は、５、７、及び／又は10分間500〜1000×ｇの速
度で遠心した。高速軟層調製物は、シリンジチャンバー
内で５、７、及び／又は10分間遠心速度500〜1500×ｇ
の遠心速度にて分離された。
遠心に続いて、チューブ片をサンプル収集ポートに取
付け、そして血漿、血小板、及び軟層をサンプル収集チ
ューブ内に搾り出した。パック赤血球層が該チューブに
入るのが観察されたとき止血鉗子でチューブを挟んだ。
サンプルチューブを次いでチャンバーから除去し、サン
プル管内へ流した。カウントされてFACS分析のために染
色されるまで、この白血球濃厚化サンプルを室温にて保
持した。
細胞の表現型分析：修正シリンジ白血球収集チャンバー
の前後のサンプルからの細胞を、適切にラベルした12×
75mmのプロプロピレン管に入れ、次のモノクローナル抗
体組合せによって染色した： HLeFITC,CD3PE/HLeFITC,CD4PE/HLeFITC,CD8PE/HLeFIT
C,CD14PE/HLeFITC,CD16PE/HLeFITC,Cr3PE/HLeFITC及びC
D19PE/HLeFITC モノクローナル抗体の添加後、細胞を室温にて15〜20
分間インキュベートシた。
染色期間の後、細胞を１〜2mlの１倍FACS溶解溶液中
に再懸濁させ、室温にて10分間インキュベートした。Se
rofuge遠心機を用いて２分間の高速遠心により細胞を収
集した。上澄を流し去り、細胞を２倍PABで洗浄した。
最後の洗浄後、細胞をPAB中に再懸濁させ、そしてFACSC
ANフローサイトメーターによる分析まで氷上又は冷蔵庫
内に終夜保持した。
結果 結果は２つの部分に分割される。第Ｉ部は、低速軟層
調製物からの白血球単離を、第II部は、高速軟層調製物
からの白血球単離を要約する。
I. 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーを用いた
白血球の単離 A. Interstate Blood Bankより受け取った24時間齢の
血液から調製された低速軟層調製物からの白血球の、本
発明の修正シリンジ白血球収集チャンバーを用いた単離 Optipress 装置を用いて得られた全部で８通りの低
速軟層調製物を、図３のシリンジチャンバーを用いて処
理した。表１は、異なる遠心力と時間とにおけるチャン
バー内の軟層の処理の前後での、白血球（WBC）、赤血
球（RBC）、及び血小板（PLT）カウントを要約する。
原料である軟層サンプルの平均WBC濃度は、3.99×107
WBC/mlであった。この軟層の1000×ｇでの５分間の処理
は、回収されたWBC/mlの最高の平均数を与えた（5.54×
106）。1000×ｇでの７分間の遠心は最も乏しいWBC収率
を与えたが（平均＝1.8×106）、一方10分のサンプルは
中間的なWBC量を与えた（平均＝3.4×106）。赤血球（R
BC）濃度は、遠心時間の延長と共に有意に減少した。チ
ャンバー前サンプルに対し、５分においては1.8対数、
７分においては2.2対数、そして10分においては5.2対
数、というRBC濃度の減少が、1000×ｇのチャンバー後
サンプルにおいて観察された。チャンバー後サンプル中
の血小板濃度は、チャンバー前の値より僅かに高かっ
た。
遠心力を750×ｇに低下させると、５、７、及び10分
の遠心をそれぞれ用いて、1.225×106、1.7×106、及び
3.825×106の平均WBC/ml濃度が得られた。750×ｇにて
収集されたチャンバー後サンプルのRBC汚染は、遠心時
間の延長と共に減少した（５分＝1.86対数、７分＝2.45
対数、10分＝5.27対数）。750×ｇのチャンバー後収集
サンプル中の血小板濃度は、チャンバー前対照サンプル
よりも僅かに高かった。
500×ｇ、５分間での軟層処理工程は、チャンバー内
に必ずしも常に明確なWBC層を形成しなかった。従っ
て、500×ｇにおける５分間の遠心は、PCRのためにシリ
ンジチャンバーで白血球を収集する目的には推奨できな
い。500×g7分間及び10分間の遠心は、3.42×106及び1.
64×106の平均WBC/ml濃度をそれぞれ与えた。遠心時間
を７から10分へ延長することは、500×ｇにおけるチャ
ンバー後サンプル中のRBC汚染の有意な減少をもたらし
た。チャンバー前サンプルに比較して、10分サンプル中
のRBC汚染は5.09対数減少されたが、一方７分サンプル
は1.8という低いRBC濃度低下を有した。血小板濃度は、
チャンバー前値に比して、７及び10分500×ｇのシンリ
ンジチャンバー後サンプルの双方において、僅かに上昇
していた。
表２は、シリンジチャンバーを用いた軟層処理の前後
の細胞の表現型を要約している。主要な細胞集団（リン
パ球、単球及び顆粒球）を分析するために、分析にHLe
（全白血球）陽性細胞を含めHLe陰性細胞を排除するた
めに電子ゲートをセットした。HLeゲートをセットした
のち、散乱特性（FSC対SSC）に基づいて、電子的領域を
リンパ球、単球及び顆粒球集団の周りにセットした。
チャンバー前軟層サンプル中のリンパ球集団は、9.18
％〜61.93％であり平均値34.36％±16.62％を有した。
単球集団は平均値7.04％±7.42％（範囲＝0.19％〜22.0
7％）を有し、顆粒球集団は平均値54.47％±19.05％
（範囲:20.85％±76.28％）を有した。シリンジチャン
バーによる1000×ｇでの軟層の処理によって収集された
サンプルは（図６を参照）、リンパ球集団の増加と顆粒
球集団の減少とをもたらした。しかしながら、５、７、
10分の遠心時間の延長は、シリンジチャンバー後のサン
プルにおいて平均リンパ球のパーセントを減少させ（５
分＝79.59、７分＝71.28％、10分＝70.60％）、平均顆
粒球のパーセントを増加させた（５分＝12.42％、７分
＝13.66％、10分＝17.62％）。単球のパーセントは、５
分サンプルにおいて僅かに減少し（平均＝3.18％）、７
分（7.26％）又は10分（6.53％）においてはチャンバー
前パーセント（7.04％）と近似していた。
図７は、750×ｇでの５、７及び／又は10分間におけ
るシリンジチャンバーから収集されたサンプルをグラフ
で示す。前軟層対照サンプルに比して、試験された遠心
時間の各々についてのリンパ球のパーセントは増大し、
一方顆粒球のパーセントは減少した。５又は７分の遠心
後にチャンバーから収集されたサンプルは、近似のリン
パ球（５分＝80.93％、７分＝79.01％）、単球（５分＝
2.20％、７分＝2.67％）、及び顆粒球（５分＝11.71
％、７分＝13.02％）パーセントを有していた。750×g1
0分間で収集されたサンプルは、より低いリンパ球（67.
38％）及びより高い単球（4.29％）及び顆粒球（20.50
％）パーセントを有していた。
500×g7又は10分後において収集されたシリンジチャ
ンバー後サンプルは、リンパ球パーセントの増大と、顆
粒球パーセントの減少とを示した（図８を参照）。500
×g7分間でのチャンバーから収集されたサンプルは、対
照軟層サンプルに比して、リンパ球のパーセントの増大
（75.45％）及び単球のパーセントの減少（2.31％）及
び顆粒球のパーセントの減少（15.69％）を有した。500
×ｇにおける遠心時間の10分への延長は、７分サンプル
に比して、一層低いリンパ球のパーセント（57.77％）
及び増大した単球（8.40％）及び顆粒球（27.32％）パ
ーセントをもたらした。
結論： １） 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーより収
集された全てのサンプルは、遠心力又は時間に関わりな
く、チャンバー前軟層対照に比してリンパ球パーセント
が増大していた。
２） 試験した何れの遠心力（50、750、1000×ｇ）に
ついても、遠心時間の延長は、チャンバー後サンプル中
の顆粒球のパーセントの減少をもたらした。単球のパー
セントは、しかしながら、遠心力及び時間に関わりなく
かなり一定に止まった。
３） PCRサンプル収集のためのシリンジチャンバー内
に明瞭な軟層を形成するためには、少なくとも500×g7
分の遠心力が必要である。
４） 試験した何れの遠心力における遠心時間の延長
も、収集されたPCRサンプル中のRBCの減少をもたらし
た。
５） 遠心力の及び／又は時間の減少は、シリンジチャ
ンバーから収集されるPCRサンプル中の血小板数を増加
させる。
６） 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーを用い
たとき、750×g7分間の遠心が、PCR診断のための最もよ
いサンプル（最高のリンパ球パーセント、低いRBC汚
染）を与える。
図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーは、リンパ
球の光散乱特性を示す細胞を濃厚化した低速において得
られる軟層調製物から、白血球を収集することを許容す
る。750×g7分間の遠心力が、PCR試験のためのサンプル
を得るのに必要な最適条件であるように見える。PCR診
断において使用するためのこのサンプルは、＞80％とい
う平均リンパ球パーセントまで濃厚化されており、そし
てまたRBC汚染が減少されている。
B. Optipress 装置を用いて得られた社内Fenwal供血
者より得られた新鮮な４時間齢未満の血液から調製され
た軟層調製物からの、図３の修正シリンジ白血球収集チ
ャンバーを用いた白血球の単離 修正シリンジ白血球収集チャンバーによる処理に先立
つ軟層画分の貯蔵がチャンバーの性能に影響を及ぼすか
否かを決定するために、２つの実験を行った。第１の実
験においては、新鮮な社内血液（４時間齢未満）からOp
tipress を用いて処理した軟層画分が受け取られた。
該軟層画分をシリンジチャンバー中500、400、300、200
及び100×ｇにて10分間処理した。表3aは、シリンジチ
ャンバーによる軟層の処理前後の細胞カウントを要約し
ている。
チャンバーより収集されたサンプルの白血球（WBC）
濃度は、細胞を処理するのに用いた遠心力の減少と共に
増加した。RBC濃度は、400×ｇサンプルにおいて最低
（７×107）、100×ｇサンプルにおいて最高（２×1
08）であった。
図9aは、シリンジチャンバーによる処理の前後のサン
プルの表現型結果を図解する。リンパ球濃度は、31.08
％のチャンバー前軟層対照パーセントから、500×ｇに
おける80.53％、400×ｇにおける83.28％、300×ｇにお
ける88.70％、200×ｇにおける74.59％、及び100×ｇに
おける57.75％へと、増加した。リンパ球濃度の増加に
対応して、各シリンジチャンバー後サンプル中の顆粒球
パーセントの減少が観察された。単球濃度は、チャンバ
ー前対照値の8.56％から、300×ｇサンプルにおけるチ
ャンバー後濃度3.95％、400×ｇにおける5.25％、200×
ｇにおける8.47％、500×ｇにおける10.53％、及び100
×ｇにおける12.06へと、動揺した。軟層の使用された
なった部分は、シリンジチャンバーを用いて400×ｇに
て10分間処理する前に、室温にて48時間放置した。この
48時間齢の軟層サンプル中のWBC、RBC、及び血小板濃度
は、新鮮軟層サンプルの濃度と同等であった（表3a）。
チャンバーから収集される各サンプルの間に何らかの変
動が有るか否かを判定するために、48時間齢の軟層を２
つにして400×ｇにて10分間処理した。
表3bは、チャンバーによる処理の前後のサンプルの細
胞カウントを提示している。400×ｇの第１サンプル及
び400×ｇの第２サンプルのWBC、RBC及び血小板濃度は
近似している。しかしながら、400×ｇにて収集された
新鮮サンプルと較べたとき、48時間齢サンプルについて
収集されたWBC数/mlにおいて５倍の増加があった。平均
RBC汚染は、新鮮サンプルに比して48時間において2.5倍
高かった。平均血小板濃度（5.06×108）は、新鮮処理
サンプルにおける血小板濃度（5.49×108）より僅かに
低かった。
図9bは、図３のシリンジチャンバーによる処理の前後
の48時間齢の軟層サンプルの表現型データを図解してい
る。リンパ球、単球又は顆粒球のパーセントにおいて、
48時間齢の軟層サンプルと対照の400×g10分のシリンジ
チャンバーサンプルとの間に明らかな差はなかった。
新鮮調製軟層及び48時間齢軟層とを比較すると、軟層
の貯蔵時間に対してリンパ球パーセント及び単球パーセ
ントが減少し、顆粒球パーセントが増加している。
第２の実験においては、Optipress 装置を用いて新
鮮な社内血液（４時間齢未満）から処理された軟層画分
が受け入れられた。この軟層画分を、２つにしてシリン
ジチャンバー中で500、400、300、及び200×ｇにて10分
間処理した。
表４は、シリンジチャンバーによる処理の前後の軟層
の細胞カウントを要約している。平均のWBC濃度は、200
×ｇチャンバー後サンプルにおいて最高であり（1.66×
107）、400×ｇ（1.15×107）、300×ｇ（9.15×1
07）、及び550×ｇ（5.4×106）がこれに続く。チャン
バー後サンプルにおけるRBC汚染は、チャンバー前値の
4.76×109から、500×ｇにおける6.5×107、400×ｇに
おける9.0×107、300×ｇにおける8.5×107、及び200×
ｇにおける9.0×107へと減少した。血小板濃度は、チャ
ンバー前値の血小板2.75×108個/mlに較べて、チャンバ
ー後サンプルの全てにおいて僅かに高かった。
図10aは、シリンジチャンバーによる処理の前後のサ
ンプルの表現型結果を図解している。チャンバー後のサ
ンプルの全てにおいて、チャンバー前軟層対照パーセン
トの42.05％から＞82％へと増加した。単球濃度は、チ
ャンバー後サンプルの全てにおいて、チャンバー前サン
プルにおける8.09％と同等であった。顆粒球集団はチャ
ンバー前濃度の48.93％からチャンバー後サンプルの＜
8.0％へと減少した。異なった遠心力において収集され
たサンプルは、細胞カウント（WBC/ml、RBC/ml、血小板
/ml）と表現型（％リンパ球、％単球、％顆粒球）の双
方について、２つにしたサンプルの間に殆ど変動を示さ
なかった。軟層画分を、シリンジチャンバーで400×g10
分間処理する前に、室温にて終夜（24時間）放置した。
24時間齢の軟層についても400×ｇシリンジチャンバー
後サンプルについても、細胞カウントは実施しなかっ
た。
図10bは、24時間齢の軟層のシリンジチャンバーによ
る処理前後のサンプルの表現型を図解している。リンパ
球のパーセントは、24時間のチャンバー前軟層対照サン
プルにおける44.07％から、400×ｇシリンジチャンバー
サンプルにおける60.74％へと増加した。顆粒球のパー
セントは、46.20％からチャンバー後サンプルにおける2
7.68％へと減少した。単球濃度は、チャンバー前（7.77
％）とチャンバー後（9.57％）との間で比較的不変に止
まった。
Optipress 装置を用いて収集された軟層サンプル
の、室温における24時間の貯蔵は、軟層画分中の細胞の
表現型を変化させなかった（新鮮軟層：リンパ球＝42.0
5％、24時間軟層：リンパ球＝44.07％、新鮮軟層：単球
＝8.09％、24時間軟層：単球＝7.77％、新鮮軟層：顆粒
球＝48.93％、24時間軟層：顆粒球＝46.20％）。しかし
ながら、軟層の24時間の終夜貯蔵は、該チャンバーを用
いて400×ｇ、10分間にて収穫されるリンパ球のパーセ
ントに影響を及ぼさなかった。チャンバー後サンプルの
リンパ球のパーセントは、新鮮サンプルにおける87.7％
という平均値から24時間齢の軟層における60.74％へと
減少した。顆粒球集団は、新鮮サンプルにおける1.59％
という平均パーセントからシリンジチャンバーによる処
理後の24時間齢の軟層における27.68％へと増加した。
チャンバー後画分における単球のパーセントは、軟層の
24時間の貯蔵によって影響を受けなかった（新鮮＝9.23
％、24時間＝9.57％）。
結論： １） ４時間齢未満の全血から調製された「新鮮な」軟
層画分の使用は、図３の修正シリンジ白血球収集によ
り、80％を超えるリンパ球を有するサンプルの収集をも
たらした。
２） 300〜500×ｇ、10分間のシリンジチャンバーの遠
心は、PCR診断のための最もよいサンプルを与えるよう
に見える。十分なWBC数（＞１×106）、低いRBC汚染及
び高いリンパ球数（＞80％）は、これらのサンプルをPC
R試験に許容し得るものにしている。
３） RBC濃度（＜１×108）は、シリンジチャンバー中
における「新鮮」軟層の処理の後は大きく減少した。
４） 血小板濃度は、無処理のチャンバー前軟層サンプ
ルに比して、シリンジチャンバー後サンプルにおいて僅
かに高い。チャンバー内に収集された血小板濃度はPCR
反応に影響を与えないはずである。
３） 24乃至48時間の軟層の貯蔵は、第０日の「新鮮」
軟層サンプルに比して、細胞カウント（WBC/ml、RBC/m
l、血小板/ml）にも表現型（％リンパ球、％単球、％顆
粒球）にも影響を与えなかった。しかしながら、24乃至
48時間の軟層の貯蔵は、400×ｇ、10分間により収集さ
れたチャンバー後サンプルのリンパ球のパーセントを減
少させる。リンパ球のパーセントは、新鮮なシリンジチ
ャンバーサンプルにおける83.28％から、48時間サンプ
ルにおける41.42％へと減少した。24時間後において
は、リンパ球のパーセントは、第０日のリンパ球パーセ
ントである87.7％から60.74％へと減少した。
II. 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーを用い
た白血球単離 Interstate Blood Bankから受け取った24時間齢の血
液から調製された高速軟層からの白血球の、図３の修正
シリンジ白血球収集チャンバーを用いた単離。
全部で４通りの高速（＞3500×ｇ）のOptipress 装
置軟層調製物を、図３の修正シリンジ白血球収集チャン
バーを用いて処理した。細胞カウントは、チャンバー前
軟層サンプル及びシリンジチャンバー収集後軟層サンプ
ルの双方について、Sysmex K−1000自動化細胞カウンタ
ーを用いて実施した。単球及び顆粒球集団と共にリンパ
球亜集団（CD3,CD4,CD8,NK,CD19）を特徴づけるため
に、チャンバー前後のサンプルについて詳細な表現型分
析も実施した。表５は、原料の軟層チャンバー前サンプ
ル及び異なった遠心力及び時間にて収集されたシリンジ
チャンバー後サンプルの細胞カウントを要約している。
チャンバー前サンプルの平均WBC濃度は、2.615×107個/
mlであった。チャンバー後収集サンプルは、遠心力及び
時間の双方の減少によりWBC濃度の低下を示した。チャ
ンバー後収集サンプルの全てが、典型的なPCR診断反応
において用いられる１×106より多くのWBCを含んでい
た。遠心の時間及び力の減少は、チャンバー後サンプル
におけるRBC汚染の増大をもたらした。チャンバー後収
集サンプル中の血小板濃度は、しばしば、Sysmex K−10
00細胞カウンターの検出限界より上であった。しかしな
がら、RBC及び／又は血小板のこの総数は、１×106個の
WBCサンプル中に存在してもPCR反応を妨害しないであろ
う。750×ｇにおける５又は７分という遠心時間は、PCR
分析のための最良のサンプルを与えるように見える。こ
れらのサンプルは、PCR分析に直接使用するのに許容し
得るレベルのRBC（≦５×108）及び血小板（≦５×1
09）を有する、十分なWBC数（＞１×106）を与えた。
表６は、チャンバー後サンプルの表現型を要約してい
る。ただ一つのサンプルのみをチャンバー中1500×ｇに
て７又は10分間処理した。この1500×ｇ、７分のチャン
バー後サンプルにおいて、CD3（Ｔ−リンパ球）、CD4
（Ｔ−ヘルパー）、CD8（Ｔ−サプレッサー）及びCD14
（単球）のパーセントは、チャンバー前パーセントに比
して、僅かに増加した。ナチュラルキラー細胞（NK、CD
16）及びＢリンパ球（CD19）は、チャンバー前パーセン
トの6.34％及び5.66％から、チャンバー後の値であるそ
れぞれ11.66％及び10.79％へと増加した。顆粒球（CD1
6）は、高速軟層画分のシリンジチャンバーによる1500
×ｇ、７分間の処理の後、35.29％から6.92％へと減少
した。1500×ｇにおける遠心時間の10分への延長は、チ
ャンバー前軟層値に近似のCD3,CD4,CD8,CD16,CD19,CD14
及びCD16細胞パーセントを有するチャンバー後サンプル
をもたらした。
Optipress 装置軟層サンプルを、図３の修正シリン
ジ白血球収集チャンバー中で1000×ｇ、５、７、及び10
分間処理した。CD3＋Ｔリンパ球のパーセントは、チャ
ンバー前サンプル（平均34.47％）に比して、５分サン
プルにおいては増加し（平均41.67％）、７分サンプル
においては近似であり（平均34.24）、そして10分サン
プルにおいては減少した（17.84％）。Ｔ−ヘルパー（C
D4）及びＴ−サプレッサー（CD8）の値は、チャンバー
前値と同様であった。CT＋NK細胞は、チャンバー前値の
6.34％から、５、７、及び10分のチャンバー後サンプル
における、それぞれ12.07％、12.47％、及び17.35％へ
と増加した。1000×ｇにて５分間処理したサンプルは、
チャンバー前パーセント（平均12.79％）と近似のCr3＋
パーセント（平均＝12.40％）を有していた。チャンバ
ーCr3＋（NK）パーセントは、７分（平均＝23.19％）及
び10分（平均＝20.30％）において増加した。Ｂリンパ
球は、6.23％から、５分のチャンバー後サンプルにおい
て14.26％へと、７分において14.57％へと、10分におい
て24.85％へと増加した（％＝平均値）。単球パーセン
トは、５分及び10分サンプルにおいて僅かに上昇し（前
平均＝10.96パーセント、５分平均＝13.17、10分平均＝
13.06％）、そして７分（平均＝20.85％）においてはチ
ャンバー後サンプルにおいて1.9倍大きかった。顆粒球
の量（チャンバー前平均＝38.57％）は、1000×ｇにお
ける５分のチャンバー後サンプルにおいて11.30％（平
均）、７分において25.86％、そして10分において19.27
％（平均）へと減少した。
750×ｇにおいて５分間処理したサンプルは、チャン
バー前平均の34.47％からチャンバー後値の26.85％へと
Ｔリンパ球数の減少を示した。７又は10分におけるチャ
ンバー後サンプル中のＴリンパ球値は、チャンバー前パ
ーセントに近似のCD3＋値を与えた（７分平均＝31.69
％、10分平均＝30.05％）。CD4＋、Ｔ−ヘルパー細胞の
パーセントにおいては、試験したこれら３通りの遠心時
間のいずれにおいても増加は観察されなかった。CD8
＋、Ｔ−サプレッサー細胞もまた、750×ｇ、５、７、
又は10分にて収集されたチャンバー後サンプルの何れに
おいても濃厚化を示さなかった。NK細胞（Cr3＋）は、
チャンバーサンプルの各々において増大していた。Cr3
＋NK細胞は、５分サンプルにおいてチャンバー前の1.4
倍に増加した（前平均＝12.79％、５分平均＝18.01
％）。また、７分サンプル（平均＝25.75パーセント）
及び10分サンプル（平均＝25.40％）におけるCr3＋のパ
ーセントは、チャンバー前平均Cr3＋パーセント（平均
＝12.79）の２倍強に増加した。Ｂリンパ球（CD19＋）
のパーセントの濃厚化が、750×ｇにて収集されたチャ
ンバー後サンプルの全てにおいて観察された。単球（CD
14＋）のパーセントもまた、種々の遠心時間の各々につ
いてチャンバー前パーセントより大きかった。５分のチ
ャンバー後サンプルは、26.76％という最高のCD14＋パ
ーセントを有していた。遠心時間の延長は、CD14＋パー
セント（７分平均＝20.31％、10分平均＝14.66％）の減
少をもたらしたが、それでもチャンバー前サンプルのCD
14＋パーセントより大きかった。顆粒球数の減少が、チ
ャンバー後サンプルの全てについて観察された。Cr3＋
顆粒球パーセントは、チャンバー前値の38.57％（平
均）から、５分におけるチャンバー後サンプルの5.16％
（平均）、７分における7.48％（平均）、及び10分にお
ける16.50（平均）へと減少した。
Optipress 装置軟層画分はまた、図３の修正シリン
ジ白血球収集チャンバー中にて500×ｇ、７又は10分間
処理された。７分サンプルにおいては、表現型結果が不
完全であったため、結論が出せなかった。このサンプル
のCD4＋パーセント（23.35％）は、チャンバー前パーセ
ント（７−7:I 26.61％）と近似であった。Ｔ−サプレ
ッサー値もまた、チャンバー前値と近似であった（前＝
17.33、７分＝20.84％）。CD14＋単球パーセントは、チ
ャンバー前値の7.37％からチャンバー後値の15.05％へ
と増加した。500×ｇ、10分間にて収集されたチャンバ
ー後サンプルにおいては、CD3＋,CD4＋,CD8＋，又はCr3
＋（NK）細胞のパーセントには増加は観察されなかっ
た。Ｂリンパ球パーセントは、6.53％（平均）から11.5
1％へと増加し、一方単球パーセントは10.96％（平均）
から24.95％（平均）へと増加した。10分のチャンバー
後サンプルにおいては、Cr3＋顆粒球の数における減少
が観察された（前平均＝38.57％、10分平均＝12.18
％）。
結論： １） 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーを用い
て処理された高速Optipress 装置軟層画分は、PCR反
応を阻害しない血小板濃度（≦５×109）及び／又はRBC
濃度（≦５×108）を有していた（１×106WBC/PCR反
応）。
２） シリンジチャンバーより収集されたWBCの総数
は、典型的なPCR反応を行うのに十分であった（１×106
WBC）。
３） Ｔリンパ球（CD3＋）濃度は、CD3＋細胞のパーセ
ントの増加が認められた1000×g5分のサンプルを除き、
チャンバー後サンプルにおいて濃厚化されなかった。他
のシリンジチャンバー収集サンプルにおけるCD3＋のパ
ーセントは、チャンバー前高速Optipress軟層画分にお
けるCD3＋のパーセントと近似であった。
４） CD4＋Ｔ−ヘルパー細胞亜集団は、試験した遠心
力及び時間の何れにおいても、チャンバー後収集サンプ
ルにおいて濃厚化されなかった。CT8＋Ｔ−サプレッサ
ー細胞も、最終チャンバーサンプルにおいて濃厚化され
なかった。
５） ナチュラルキラー細胞（Cr3＋）パーセントは、1
000×ｇ、７及び10分において、また750×ｇのチャンバ
ー後収集サンプルの全てにおいて増加した。
６） Ｂリンパ球（CD19＋）の濃度の濃厚化は、チャン
バー後収集サンプルの全てにおいて観察された。1000×
ｇから750×ｇへの遠心力の減少は、チャンバー後サン
プル中のCD19＋のパーセントを増加させた。
７） 単球（CD14＋）は、５及び10分、1000×ｇの収集
サンプルにおいて、パーセントの僅かな上昇を示した。
1000×ｇ、７分のサンプルは、CD14＋細胞において、チ
ャンバー前高速Optipress軟層サンプルに対し、1.9倍の
増加を示した。750×ｇにて収集されたチャンバー後サ
ンプルも、チャンバー前画分に比してCD14＋の濃度の増
加を示した。しかしながら、750×ｇにおいて遠心時間
の延長によるCD14＋の低下が観察された。
８） 顆粒球汚染（Cr3＋）は、チャンバー後収集サン
プルの全てにおいて減少した。
９） PCR試験のためにシリンジチャンバー中の高速Opt
ipress 装置軟層画分を処理するのに必要な最適の遠
心力は、750×ｇであるように見える。５〜７分の遠心
時間が、最良のPCRサンプルを収集するのに必要である
ように見える。
要約 図３の修正シリンジ白血球収集チャンバーは、ウイル
ス性汚染についての血液のPCRスクリーニングのため
に、血球の混合集団から白血球リッチサンプルを収集す
るための便利な方法を提供する。低速（＜3000rpm）又
は高速（＞3500rpm）Optipress 装置軟層調製物のい
ずれかからPCRサンプルを収集するのに必要な最適の速
度は750×ｇであった。これらのサンプルは、PCR分析に
おいて直接使用するための、最少のRBC（≦５×108）及
び／又は血小板（≦５×109）汚染しか含まない十分な
数のWBC（１×106）を提供する。
しかしながら、低速Optipress 装置軟層画分は、シ
リンジ後サンプルにおいて一層高いリンパ球パーセント
を有する（750×ｇ、＞45％）。この増加したリンパ球
濃度は、HIV感染についてのPCR分析の感度を増大させる
であろう。新鮮な血液（４時間齢未満）から調製された
低速軟層画分の使用も、シリンジ後チャンバーサンプル
中のWBC回収とリンパ球純度を高めるであろう。24〜48
時間の軟層の貯蔵は、リンパ球濃厚化サンプルを収集す
るためのチャンバーの効率を低下させる。
要約すると、図３の修正シリンジ白血球収集チャンバ
ーは、Optipress 装置軟層調製物を用いて白血球リッ
チのPCRサンプルを収集する迅速且つ便利な方法を提供
する。
図11は、ウイルス除去／不活性化工程を検証する目的
で使用することのできる本発明の別の一具体例を概念的
に図解する。該方法は、ウイルス（例えばHIV）を血液
成分に加え、次いで該血液をウイルス不活性化／除去工
程で処理することよりなる。勿論、当然、望むならば感
染血液を使用することができる。
次に、ウイルス宿主細胞が該血液に加えられる（例え
ば、HIVの場合はH9細胞、またVSVの場合はVero細胞）。
該細胞を該血液成分の全量中でインキュベートする。こ
のインキュベーションステップ−−−１乃至18時間持続
されるであろう−−−において、該血液成分中に存在し
ている感染性ウイルスは、宿主細胞に接着して入り込み
感染プロセスを開始させる。
更なるステップにおいて、本発明によれば、ウイルス
宿主細胞が白血球フィルターを用いて収穫され、血球か
ら分離される。該フィルターは、ウイルス感染性研究の
ための細胞系を除去する。加えて、該フィルターは、白
血球を血小板及び赤血球から除去し分離する。
次いで、フィルターを、ウイルス宿主細胞を維持する
ために必要に応じて10％胎仔牛血清含有RPMI 1640培地
のような組織培養培地で洗浄する。次いで、フィルター
を、37℃にて６〜120時間インキュベートしてフィルタ
ー中に含まれている宿主細胞内におけるウイルスの増殖
を続けさせる。
このインキュベーション期間の終わりに、試験材料と
して使用するためにフィルターからの流出液を調製する
（宿主細胞の溶解を伴って又は伴わずに）。該流出液
は、白血球は溶解させるがウイルスを不活性化はしな
い、１％ Triton X−100（Sigma Chemical Co.）、10mM
トリス塩酸、pH7.0、1mMのEDTA又は低張溶液のような溶
解緩衝液でフィルターを洗い流すことによって調製され
る。
この試験材料を、次いで、慣用の組織培養感染性試験
（例えば、プラーク形成単位）を用いて感染性ウイルス
について試験するか、又はウイルス性核酸マーカー（例
えば、PCRを用いたHIV−DNA配列）について、又はウイ
ルス抗原（例えば、HIV p24）について試験する。
ここに記述した現在好ましい具体例に対する種々の変更
及び修正が当業者に明らかであろうことが、理解されな
ければならない。そのような変更及び修正は、本発明の
精神及び範囲から逸脱することなく且つ伴う利点を損な
うことなく行うことができる。従って、そのような変更
及び修正は、添付の請求の範囲に包含されることが意図
されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォン，リー，ミン アメリカ合衆国60061イリノイ、バーノ ンヒルス、アップルトンドライブ 414 (72)発明者 チャップマン，ジョン アメリカ合衆国60046イリノイ、レイク ビラ、ケビンアベニュー 67 (56)参考文献 特開 昭62−38177（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−153486（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−167471（ＪＰ，Ａ) Ｇ．ＫＥＬＬＥＲ等，ＤＮＡ ＰＲＯ ＢＥＳ，英国，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐ ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，1993年, 36−39 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．，1979年，ｖｏｌ．10，ｎｏ．４, 533−537 Ｎ．Ｚ．Ｊ．ｍｉｄ．Ｌａｂ．Ｔｅｃ ｈｎｏｌ．，1977年，31，６−９ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔ ｏｌｏｇｙ，1991年，ｖｏｌ．28，ｎ ｏ．３，ｓｕｐｐｌ．５，18−21 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1983年，220，868− 871 Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，1988年，55，211 −217 Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，1993年，64，73− 81 Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ，1988年, 25，663−673 Ｔｒａｎｓｆｕｔｉｏｎ，1990年, 30，833−837 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 A01N 1/02 A61B 5/15 C12Q 1/68 C12Q 1/70

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血液単位のうち少なくとも血小板リッチ血
    漿層又は赤血球リッチ層を使用不能にしてしまうことな
    しに、ウイルス性汚染について血液単位を試験するため
    の方法であって、 ある量の血液を、容器中において、血漿及び赤血球を含
    んだ血球の混合集団を有する軟層を含む諸層へと分離す
    るステップと、 液体を受け入れるために開口に結合されたカニューレ
    と、チャンバーと、該チャンバー内に受けいられたプラ
    ンジャーとを有するシリンジを準備するステップと、 該軟層を含んだ容器を該カニューレで穿刺して該軟層を
    該チャンバー内へ入れるステップと、 該チャンバー内への該プランジャーの軸方向の動きを阻
    止するための手段を該プランジャーの少なくとも一部分
    の周りに固定するステップと、 該シリンジを遠心して該軟層を、少なくとも血漿含有
    層、白血球含有層、及び赤血球含有層に分離するステッ
    プと、そして 該白血球リッチ層を該チャンバー内の他の層から分離す
    るステップと、 を含む方法。
  2. 【請求項２】該白血球含有層が５×108個以下の赤血球
    しか含まないものである、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】該白血球含有層が５×109個以下の血小板
    しか含まないものである、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】該軟層が少なくとも300×ｇの遠心力に曝
    されるものである、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】該軟層が750×ｇの遠心力に曝されるもの
    である、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】該軟層が約５乃至約10分間遠心されるもの
    である、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】該ある量の血液を諸層に分離するステップ
    が遠心ステップを含むものである、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】該ある量の血液を分離するステップが該あ
    る量の血液を含んだ容器を少なくとも3500rpmで回転さ
    せることを含むものである、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】該軟層が、供血者から収集された後24時間
    以内に遠心されるものである、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】該軟層が、供血者から収集された後４時
    間以内に遠心されるものである、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】該血液単位を試験するために核酸増幅を
    含む診断アッセイを用いるステップを含む、請求項１の
    方法。
  12. 【請求項１２】該血液単位を試験するためにウイルス抗
    原捕獲アッセイを用いるステップを含む、請求項１の方
    法。
  13. 【請求項１３】該ある量の血液を分離するステップが該
    ある量の血液を含んだ容器を3000rpm以下の速度で回転
    させることを含むものである、請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】該軸方向の動きを阻止するための手段
    が、該プランジャーの少なくとも一部分の周りに除去可
    能に結合されるように構成され配置されたスリーブであ
    る、請求項１の方法。
  15. 【請求項１５】該スリーブが実質的に管状であり且つ軸
    方向のスリットを含むものである、請求項14の方法。
  16. 【請求項１６】該白血球リッチ層を、該層をチューブの
    中へ搾り出すことによって分離するステップを含む、請
    求項１の方法。
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