CN105695412B - 一种人肺腺癌细胞株ha109及其建立方法 - Google Patents

一种人肺腺癌细胞株ha109及其建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人肺腺癌细胞株HA109及其建立方法，所述人肺腺癌细胞株HA109的保藏编号为CCTCCNo:C201617，其是将胸腔积液加入到人外周血淋巴分离液，得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞，用胸腔积液加二抗培养基进行培养，双密度梯度离心得到活力高的肿瘤细胞，反复贴壁剔除内皮及上皮细胞，逐步减少胸腔积液比例进行培养，至第5代时直接用含胎牛血清的培养基培养，培养细胞注射小鼠成瘤，杀小鼠取肿瘤并消化，得到活力好的原代肿瘤细胞。由于中晚期肺癌病人的组织标本一般难以获得，成熟的高分化肿瘤细胞较难体外培养，本发明从比较容易获得又不为病人带来痛苦的胸腔积液中分离纯化高分化的肿瘤细胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更简单方便且成功率大大提高。

Description

一种人肺腺癌细胞株HA109及其建立方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的人肺腺癌细胞株HA109及其建立方法。
背景技术
体外建立肺癌细胞系为研究肿瘤的基础和临床研究提供了极其重要的细胞实验模型。但是随着实验的不断开展，常需要对细胞系进行不断的体外传代，于是一些生物学特征会渐渐的改变或消失，所以不断建立新的细胞系已经成为研究肺癌的发病机理和探寻新的治疗方法的重要环节。
原代细胞的培养难易程度与取材时的组织类型、分化程度、年龄等密切相关，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
现有技术大多采用手术中切除的早中期病人肿瘤组织进行原代培养，包括直接将组织进行消化培养或是将病人肿瘤组织移植至小鼠体内，待成瘤后，再取出小鼠肿瘤组织进行消化培养。
胸水细胞的主要成分为淋巴细胞、粒细胞、树突状细胞、少量脱落的上皮细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞等，成分相对较为复杂，胸腔积液中的肿瘤细胞属于高分化的成熟细胞，比较脆弱，一般而言比较难培养。但是相对于原发肿瘤灶，胸水取材容易，如果能建立稳定的培养体系，对肺癌原代细胞的建立有很大的推广意义。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的人肺腺癌细胞株HA109及其建立方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种人肺腺癌细胞株HA109的建立方法，包括以下步骤：
(1)、去除中晚期肺癌病人胸腔积液中的血块，离心后得到上清液和沉淀；
(2)、将步骤(1)的沉淀用两倍体积的PBS重悬，再按1:1的体积比缓慢贴壁加入到人外周血淋巴分离液的液面上，离心；
(3)、小心吸取分离液面交界处的液体，得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞，无菌PBS清洗，离心弃上清；
(4)、使用含0.5～2wt％的青-链双抗的步骤(1)的上清液作为条件培养基培养步骤(3)的细胞；
(5)、待细胞长满时，用0.25～0.5wt％的胰酶消化，离心后，用PBS将沉淀重悬成细胞悬液；所述PBS与沉淀的体积比为2～3:1；
(6)、预先在干净离心管中依次缓慢贴壁加入40％的比重为1.056的percoll液和20％的比重为1.031的percoll液；
(7)、将步骤(5)的细胞悬液缓慢贴壁加入到步骤(6)的离心管中，离心；
(8)、吸取40％的percoll液面处的液体，无菌PBS清洗，离心弃上清，得到肿瘤细胞，使用步骤(4)中的条件培养基进行培养；
(9)、重复步骤(4)-(8)一次，然后进行细胞传代，传代时，步骤(4)的条件培养基的上清液的比例每次减少20％，再相应增加20％含10％胎牛血清的DMEM培养基，到第五代时条件培养基为加青-链双抗的10％胎牛血清的DMEM培养基；
(10)、将传代五次后的细胞注射小鼠成瘤，杀小鼠取肿瘤并消化，得到原代人肺腺癌细胞株HA109。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述人外周血淋巴分离液的比重为1.077。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述离心是在4℃1000rpm/min离心10min；步骤(2)所述离心是在20℃1350rpm/min升速5，降速0，水平离心25分钟；步骤(7)所述离心是在20℃2000rpm/min，升速5，降速0，水平离心25分钟。
在其中一些实施例中，步骤(4)的青-链双抗的含量为1wt％
在其中一些实施例中，步骤(4)中置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养细胞。
在其中一些实施例中，步骤(5)中所述PBS与沉淀的体积比为2:1。
本发明还提供了上述建立方法建立的人肺腺癌细胞株HA109。
本发明创建了一种从中晚期病人的癌性胸腔积液中分离纯化肿瘤细胞进行培养并建系的方法。分离得到活力高的肿瘤细胞后，用胸腔积液加培养基进行培养，每次传代，利用上皮和内皮细胞容易脱落，而肿瘤细胞贴壁更牢固的特点，丢弃先脱落的细胞，剩下肿瘤细胞进行培养，逐步剔除内皮和上皮细胞。本发明通过以下几个特殊的处理实现了本发明的发明目的：
1、本发明的人肺腺癌细胞株HA109的建立方法中分离肿瘤细胞时采用了两次双密度梯度离心法，第一次双密度梯度离心法，得到含量较高的肿瘤细胞和部分成纤维细胞及内皮细胞，由于成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长更快，导致肿瘤细胞生长抑制甚至死亡，因此本发明利用反复贴壁法剔除成纤维细胞和内皮细胞，再次采用双密度梯度离心法，分离除去凋亡和死亡细胞，得到活力高的肿瘤细胞；
2、由于成熟肿瘤细胞在体外培养条件与体内环境变化剧烈，细胞不容易 适应，容易造成生长缓慢甚至死亡，因此本发明采用了在培养初期，用自体胸腔积液加二抗为主的条件培养基，使细胞适应生长环境，视长出的细胞量适当加大含10％胎牛血清的DMEM量，逐步过渡到细胞稳定生长时不加胸腔积液上清；
3、为了得到活力高的肿瘤细胞，本发明将培养的肿瘤细胞接种至裸鼠中，通过裸鼠体内的自然筛选，那些生长能力较强的细胞群体(肿瘤细胞)继续生长存活，相对生长能力较弱的群体(包括人成纤维细胞及内皮细胞)就会慢慢丢失，再将裸鼠体内的移植瘤取出作原代细胞培养，从而得到本发明所需要的高活力的原代人肺腺癌细胞。
本发明所述的人肺腺癌细胞株HA109已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号为CCTCCNo:C201617。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
由于中晚期肺癌病人的组织标本一般难以获得，成熟的高分化肿瘤细胞较难体外培养，本发明从比较容易获得又不为病人带来痛苦的胸腔积液中分离纯化高分化的肿瘤细胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更简单方便且成功率大大提高。
附图说明
图1为160×光学显微镜下，细胞稀疏与密集生长的状态图；
图2分别为12000×和25000×透射电镜下的细胞内部结构图，其中2-1中，A为核仁，B为细胞表面微绒毛，C为细胞核；2-2中，A为线粒体；B为内浆网，C为自噬体；
图3分别为1.2K×扫描电镜下的细胞生长情况图和5.0K×扫描电镜下的细胞表面结构图；
图4为流式细胞仪检测细胞周期结果图；
图5为染色体核型分析结果；
图6为细胞生长曲线图；
图7分别为克隆形成图和克隆形成率图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的人肺腺癌细胞株HA109的建立方法的主要流程为：
胸腔积液→人外周血淋巴分离液→得到肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞用胸腔积液加培养基进行培养→双密度梯度离心得到活力高的肿瘤细胞→反复贴壁法→剔除内皮及上皮细胞→逐步减少胸腔积液比例→直接用含胎牛血清的培养基培养→培养细胞注射小鼠成瘤→杀小鼠取肿瘤并消化→活力好的原代肿瘤细胞。
实施例1 人肺腺癌细胞株HA109的建立方法
包括以下具体步骤：
(1)、将中晚期肺癌病人的胸腔积液过100μm滤网除去血块，4℃1000rpm/min离心10min得到上清液和沉淀，将上清液吸出另外保存；
(2)、在离心管中准备人外周血淋巴分离液(LTS1077,天津灏洋，比重为1.077)，将步骤1的沉淀用两倍体积的PBS重悬，再按PBS重悬液与人外周 血淋巴分离液的体积比1:1，将PBS重悬液缓慢贴壁加入人外周血淋巴分离液的液面上，水平离心机20℃1350rpm/min(升速5，降速0)水平离心25分钟；
(3)、小心吸取分离液面交界处的约1mL液体(含肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞)到新的离心管中，用无菌的1×PBS清洗三次，室温，1000rpm/min，离心5分钟，弃上清；
(4)、步骤1离心得到的胸腔积液上清液，加入胸腔积液上清液含量1wt％的青-链双抗，作为条件培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱(HERAcell150i,USA)中培养步骤(3)的细胞，即(1mL液体，含肿瘤细胞和部分上皮细胞、内皮细胞)；
(5)、待细胞长满时，用0.3wt％的胰酶消化，离心后，用PBS按2:1(PBS:沉淀)的体积比重悬成细胞悬液；
(6)、预先在干净离心管中缓慢贴壁加入40％的比重为1.056的percoll液和20％的比重为1.031的percoll液；
(7)、将4ml步骤(5)的细胞悬液缓慢贴壁加入到步骤(6)已加入percoll液的离心管中，水平离心机20℃2000rpm/min(升速5，降速0)水平离心25min；
(8)、吸取40％的percoll液面处的1ml液体(分离得到的活力高的肿瘤细胞)到新的离心管中，加入无菌PBS 2ml混匀1000rpm/min离心5min，重复洗涤1次，弃上清，得到肿瘤细胞，使用步骤(4)中的条件培养基进行培养；
(9)、重复步骤(4)-(8)进行一次，然后进行细胞传代，传代时，步骤(4)的条件培养基的胸腔积液上清液的比例每次减少20％，再增加20％含10％胎牛血清的DMEM培养基，到第五代时条件培养基为加青-链双抗的10％胎牛血清的DMEM培养基；传代时，利用上皮和内皮细胞容易脱落，而肿瘤细胞贴壁更牢固的特点，丢弃先被胰酶消化脱落的细胞，剩下肿瘤细胞进行培养，逐步剔 除内皮和上皮细胞；
(10)、将传代五次后肿瘤的细胞用胰酶消化，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107个/mL，将细胞悬液接种在免疫缺陷小鼠两侧皮下成瘤，待肿瘤形成，杀小鼠，取肿瘤组织块，进行鼠间传代。
通过10-70um尼龙细胞滤网去除细胞团以及细胞碎片，然后再用0.25％的胰蛋白酶消化约1小时，弃掉上清再次低速离心，得到了大量的肿瘤上皮样细胞。
a剪切
把已成瘤的肿瘤组织块剪碎，约1～2mm3大小的组织块。
b加液漂洗
将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2～3次(采用倾斜，自然沉降法)。
c消化
使用含1％胶原酶II的完全细胞培养基(10％FCS的DMEM)37℃消化4小时，800r/min低速离心8分钟后,弃掉上清。消化液的量应该是组织的8～10倍，消化过程中要间断的振荡摇匀，观察组织呈絮状，消化液变浑浊时即终止消化。
d漂洗
将含有10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养基沿瓶壁缓缓加入，终止漂洗2-3次后，加入DMEM(GIBCO)培养基重悬。
e机械分散
采用吸管吹打，通过10-70um尼龙细胞滤网去除细胞团以及细胞碎片，然后再用0.25％的胰蛋白酶消化约1小时，弃掉上清再次低速离心，得到了大量 的肿瘤上皮样细胞，用10％胎牛血清的DMEM培养基进行体外培养，得到人肺腺癌细胞株HA109，已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号为CCTCCNo:C201617。
体外培养的细胞的鉴定
细胞形态及光镜下观察
细胞体外培养物呈贴壁状态；不规则形，体积较大；各代细胞始终保持旺盛代谢；细胞形态稳定，即使传至第50代，细胞形态和生长速度不变。冻存后复苏良好。
在光镜下观察细胞生长情况如图1所示：细胞较大，形态不规则，多数为梭形，少量为多角形，细胞核明显，呈贴壁状生长，细胞铺满瓶底后有重叠现象，接触性抑制消失，重叠性生长，反映了肿瘤细胞恶性增殖的特点。
透射电镜观察细胞内部结构
透射电镜样品制作步骤
1、取材：用于透射的细胞团块小于lmm3。
2、固定：2.5％戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时以上；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分钟，共3次；l％锇酸固定液固定2～3小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分钟，共3次；
3、脱水：50％乙醇15～20分钟；70％乙醇15～20分钟；90％乙醇15～20分钟；90％乙醇90％丙酮(1：1)15～20分钟；90％丙酮15～20分钟；以上在4℃冰箱内进行。100％丙酮室温15～20分钟，重复三次。
4、包埋：纯丙酮+包埋液(2：1)室温3～4小时；纯丙酮+包埋液(1：2)室温过夜；纯包埋液37℃2～3小时；
5、固化：37℃烘箱内过夜；45℃烘箱内12小时；60℃烘箱内24小时
6、切片：Leica EM UC 7型超薄切片机切片50～60nm；
7、双染：3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色；
8、HITACHI H-7650透射电镜观察，拍片。
结果如图2-1和2-2所示，从图2可以看出：胞核巨大、畸形，核膜形状不规则，有的见胞核内包裹一部分胞浆。核仁明显，有的细胞含有多个核仁，核仁中间有空白区。胞浆内线粒体增多,形状不规则，体积增大，峭增多。细胞的胞浆内内浆网较多，扩张明显、表面微绒毛较少。
扫描电镜观察细胞表面结构
扫描电镜样品制作步骤
1、取材：对数生长期细胞消化后计数，5×103个细胞(100u1)接种于盖玻片上(面积为lcm2)，加适量DMEM培养液，放于孵箱，至细胞到生长对数期停止培养。
2、清洗：用PBS冲洗两次。
3、固定：①2.5％戊二醛4℃预固定2小时；②0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次各15分钟；③1％锇酸4℃后固定2小时。
4、清洗：0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次各15分钟。
5、脱水及置换：各15分钟。50％乙醇→70％乙醇→90％乙醇→100％乙醇I、II、III→100％乙醇+醋酸正戊酯(2：1)→100％乙醇+醋酸正戊酯(1：2)→100％醋酸正戊酯I、II、III
6、临界点干燥：样品装入样品盒中入HCP-2临界点干燥仪中干燥约2小时。
7、样品粘贴：取双面胶将已干燥的样品粘贴于样品台上。
8、喷镀：样品入IB一3型离子溅射仪中喷金3分钟。
9、扫描电镜观察：日立S-3000N。
结果如图3所示，从图3可以看出：细胞大小不一，细胞外形多扁平，细胞呈嵌套或重叠生长(图3-1)，细胞凹凸不平，表面有微绒毛均匀分布，有明显的细胞间桥连接(图3-2)。扫描电镜检测未见支原体等异常颗粒存在。
流式细胞仪检测细胞周期
消化对数生长期的细胞，制成细胞悬液，PBS洗三遍，离心，用预冷的70％乙醇4℃固定过夜，用PBS洗一次后用PBS重悬，加PI 4℃避光孵育半小时，用流式细胞仪(BDFACScanto L)检测。
从图4可见，HA109和A549均有典型的DNA非整倍体细胞峰，符合肿瘤细胞特征。另外HA109G2/G1明显比A549细胞高，表明其增殖速度更快。
染色体核型分析
步骤
1、将原代细胞37℃，5％CO2培养箱中72小时培养，获得大量分裂细胞；
2、每毫升培养基中加入20uL 20ug/mL的秋水仙素摇匀，继续培养2.5小时，使进行分裂的细胞停止于分裂中期，以便染色体的观察；
3、消化细胞，转入离心管，用2000rpm/min离心8分钟，弃上清；
4、加入8ml 0.075mol/L KCL低渗液混匀，并在37℃水浴箱中低渗膨胀细胞25分钟，减少染色体间的相互缠绕和重叠；
5、加1ML固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)并混匀；
6、离心弃上清，再重新加固定液将细胞固定于载玻片上；
7、用新鲜配制的10％Giemsa染色液染色8～10min，取出水洗，待干；
8、在显微镜下观察染色体的结构和数量并拍照。
取第12代HA109的100个中期分裂相细胞的染色体进行分析，各细胞内染色体数目分布在50-55之间，核型分析结果如图5所示，染色体条数增加主要是：第10号和X染色体；丢失的主要是：第1，3，5,7,8,9号。二倍体染色体细胞占11％，二倍体和三倍体之间(包括三倍体)的细胞占89％，说明这种细胞染色体不稳定，属亚三倍体，容易发生转移。细胞染色体结构有如下畸变：1号染色体长臂3区2带增加，11号染色体长臂2区2带增加，12号染色体长臂2区4带增加，18号染色体短臂1区1带增加，22号染色体长臂1区1带增加。
通过细胞核型分析显示：来源于人类的非整倍体细胞、多倍体细胞的出现代表着基因拷贝量的大量增加、核分裂加速、细胞增殖失控、核浆分裂失衡等细胞恶性增殖特性，异常染色体及端着丝粒等染色体结构异常可能与细胞锚着独立性生长能力、生长增殖优势及成瘤性等恶性细胞特性有明显关联。
细胞生长曲线绘制
1、分别取对数生长期的HA109细胞和A549细胞，胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹匀，倍比稀释，以每孔100uL(1.0×104个/m1)J接种至96孔板，每孔再加入DMEM培养液100uL，使细胞终浓度为l×l03个/孔，每组3个复孔，培养板放入孵箱。
2、0h后，在各组的3孔细胞中加入MTI'20uL(5mg/mL)，置孵箱培养4h后取出，吸尽上清，加入DMSO 150uL，置孵箱30min后取出，混匀后吸尽孔内液体至一空白96孔板，微型振荡仪上振荡5min，选择波长为590nm，在酶标仪上测定吸光值，取均值，DMSO做空白对照。其余细胞更换培养液。
3、分别于12，24h，48h，72h测定吸光值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
细胞生长曲线如图6所示，从生长曲线可见，细胞生长增殖快。
克隆形成实验对其增殖能力进行检测
1、分别取对数期生长的细胞HA109和A549，消化，重悬，按每孔200个细胞，接种至6孔板中，每个细胞重复3孔，再放入37℃，5％CO2细胞培养箱内培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(14天)，终止培养。
2、结晶紫染色
结晶紫染液的配制：0.5％结晶紫溶于20％甲醇中，置于4℃冰箱中备用；将6孔板中培养液吸弃，加入PBS洗2次；每孔加入结晶紫染液lml，染色5min；吸弃结晶紫染液，用双蒸水冲洗六孔板2次；计算克隆形成的数目，并用照相机拍摄图片，计数克隆形成率。
克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。
克隆形成率结果如图7所示，图中可见，HA109克隆形成率明显比A549高，说明其增殖能力较强，但克隆体积较A549小，与其细胞特性有关。
体外成瘤能力检测
消化对数生长期的细胞，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107个/mL。分别接种在3只免疫缺陷小鼠右侧臀部皮下。从第10天开始，小鼠均开始出现明显肿块，至44天3只小鼠成瘤率100％。处死小鼠后取出肿块,大小分别为19mm×17mm和22mm×18mm、19mm×16mm，肉眼观察，肿块呈肉红色，结节状，切面灰白，质稍硬。镜下见肿瘤细胞呈巢状排列，细胞核大， 核仁明显，核分裂相多见，并向周围肌肉及脂肪组织浸润，伴有炎性细胞浸润及纤维组织反应性增生，解剖小鼠查远处脏器未见转移灶。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种人肺腺癌细胞株HA109，其特征在于，所述细胞株HA109的保藏编号为CCTCC No:C201617。
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