CN111840646B - 一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用 - Google Patents

一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用。该胸部脂肪填充用干细胞组合物，包括以下组分：脂肪干细胞、成纤维细胞、浓缩生长因子、富血小板纤维蛋白以及间充质干细胞分泌的外泌体，其中：每1ml含(1‑10)×107脂肪干细胞的溶液与0.5‑2ml含(1‑10)×107成纤维细胞的溶液、1‑2ml的浓缩生长因子、0.5‑2ml的富血小板纤维蛋白、以及1‑3ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合。本发明实施例中的胸部脂肪填充用干细胞组合物中，使用了CGF、PRF和MSC外泌体以促进机体干细胞存活和生长。

Description

一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用
技术领域
本发明涉及细胞制品，具体涉及一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用。
背景技术
目前市面上丰胸主要通过两种方式，即：假体丰胸和脂肪丰胸。假体丰胸一次成型，但假体本身有寿命期限且副作用多，如：可能引起血肿、假体破裂、包膜挛缩、乳房变硬、感觉异常、操作不当带来位置异常、做胸部检查X光时会遮挡射线。脂肪丰胸是向胸部注入未经处理的脂肪团，但注入的脂肪团在体内容易被吸收，无法达到效果。人们一直在寻找能提高脂肪移植成活率的方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用。本发明实施例中的胸部脂肪填充用干细胞组合物中，使用了CGF、PRF和MSC外泌体以促进机体干细胞存活和生长。CGF和PRF除了具有生长因子、细胞因子外，还具有网络状纤维蛋白凝胶结构，可以作为脂肪干细胞和成纤维细胞存活和生长的支架，而CGF和PRF本身具有的生长因子、细胞因子又可以促进支架上的干细胞存活和生长。MSC外泌体因其包含多种物质，可以促进机体干细胞存活和生长。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种胸部脂肪填充用干细胞组合物，其包括以下组分：脂肪干细胞、成纤维细胞、浓缩生长因子、富血小板纤维蛋白以及间充质干细胞分泌的外泌体，其中：每1ml含(1-10)×107脂肪干细胞的溶液与0.5-2ml含(1-10)×107成纤维细胞的溶液、1-2ml的浓缩生长因子、0.5-2ml的富血小板纤维蛋白、以及1-3ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合。
在一种可能的实现方式中，每1ml含5×107脂肪干细胞的溶液与1ml含5×107成纤维细胞的溶液、1ml的浓缩生长因子、1ml的富血小板纤维蛋白以及2ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合。
在一种可能的实现方式中，含脂肪干细胞的溶液与含成纤维细胞的溶液中，所用溶剂均为生理盐水。
在一种可能的实现方式中，浓缩生长因子的制备方法包括以下步骤：
将装有血液、不添加抗凝剂的采血管放置到离心机中，进行差速离心，所述差速离心的程序为：加速30秒；2700转/分钟离心2分钟；2400转/分钟离心4min；2700转/分钟离心4分钟；3000转/分钟离心3分钟；减速33s，离心后血液样品分三层：取中间层黄色部分为CGF。
在一种可能的实现方式中，富血小板纤维蛋白的制备方法包括以下步骤：
将装有血液、不添加抗凝素的采血管放置到离心机中，3000转/分钟离心10分钟；离心后血液分成3层，取中间层为富含血小板的纤维蛋白凝胶层。
在一种可能的实现方式中，间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括以下步骤：
取间充质干细胞培养上清40mL，4000g，4℃离心20分钟，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中，收集样本至于冰上；
取处理后的细胞培养上清放入离心管中，加入外泌体沉淀试剂，混匀后4℃静置至少30min；静置后的样品12,000g，4℃离心30min，管底可见白色外泌体沉淀，吸去上清，加入100μl缓冲液溶解沉淀，获得重悬的外泌体；将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5mL收集管中，3,000×g，4℃离心10min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体。
本发明实施例还提供了上述胸部脂肪填充用干细胞组合物在制备胸部脂肪填充材料中的应用。
一种胸部脂肪填充材料，包括上述胸部脂肪填充用干细胞组合物以及生理盐水。
在一种可能的实现方式中，每1ml含(1-10)×107脂肪干细胞的溶液与0.5-2ml含(1-10)×107成纤维细胞的溶液、1-2ml的浓缩生长因子、0.5-2ml的富血小板纤维蛋白、以及1-3ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合，用生理盐水补充至50ml。
在一种可能的实现方式中，每1ml含5×107脂肪干细胞的溶液与1ml含5×107成纤维细胞的溶液、1ml的浓缩生长因子、1ml的富血小板纤维蛋白以及2ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合，用生理盐水补充至50ml。
脂肪干细胞：脂肪组织在人体内储量丰富，通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞(ADSCs)，脂肪干细胞有自我更新增殖及多向分化潜能，可向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞等分化，而且可分泌多种促血管生成因子。
成纤维细胞：以前一直认为成纤维细胞是人体的终末体细胞，但近年来随着细胞生物学的快速发展，研究者发明成纤维细胞在不同微环境下可分化成不同的成体细胞，如：脂肪细胞、心肌细胞、巨噬细胞、软骨细胞等。成纤维细胞起源于胚胎中胚层的间充质细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分。成纤维细胞体外培养能够合成纤维蛋白、黏连蛋白、胶原蛋白等蛋白质，以及胶原纤维、弹性纤维、网状纤维等细胞外基质。成纤维细胞与脂肪干细胞共同起源于中胚层间质细胞，而且成纤维细胞能表达CD29、CD44、CD71、CD73等脂肪干细胞的标志物，并在特定条件下能形成脂肪组织。
浓缩生长因子：即CGF，主要由各种生长因子和纤维蛋白凝胶组成。这些生长因子主要分布在血浆和血小板中，血小板在制备过程中因变速离心而被大量激活，释放出各类生长因子，这一类生长因子包括：血管内皮生长因子(VEGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等。CGF还具有结构为三维聚合物的网络纤维蛋白结构，生长因子诱导组织修复与再生过程中有了一个可靠的支架，可以使得大量干细胞在支架上附着并进行增殖与分化。CGF最常被用于骨缺损修复，如修补牙等。
富血小板纤维蛋白：即Platelet-Rich Fabrin(PRF)是一种区别于传统富血小板血浆(Platelet-rich plasma)技术的富含细胞因子和生长因子的新一代血小板浓缩物，其结构类似于天然血凝块，可以借助细胞因子的调节作用以及纤维蛋白的支架作用进行组织修复。
间充质干细胞分泌的外泌体：即MSC外泌体，其富含多种胞外基质蛋白，mRNA信使核糖核酸和多重生长因子。在临床上，干细胞外泌体主要治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡，再生健康皮肤；在护肤方面，主要是对外伤受损、衰老中毒皮肤进行修复。
有益效果
1、本发明实施例中的胸部脂肪填充用干细胞组合物中，使用了CGF、PRF和MSC外泌体以促进机体干细胞存活和生长。CGF和PRF除了具有生长因子、细胞因子外，还具有网络状纤维蛋白凝胶结构，可以作为脂肪干细胞和成纤维细胞存活和生长的支架，而CGF和PRF本身具有的生长因子、细胞因子又可以促进支架上的干细胞存活和生长。MSC外泌体因其包含多种物质，可以促进机体干细胞存活和生长。
2、CGF在胸部脂肪填充领域鲜有报道，本发明实施例中通过将CGF与脂肪干细胞、成纤维细胞、PRF和MSC外泌体组合使用，并通过调节各组分的比例，获得了优良的效果。将这五种成分注射入胸部后，术后瘢痕更小、胸部增大的效果更明显且均匀性更好、移植注射后保持情况也更好、胸部触感自然、无硬结，不萎缩。
3、在达到理想丰胸的情况下，本申请方案所需要的人体脂肪组织减少了约50％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1脂肪干细胞制备
1、脂肪干细胞的原代培养
将洗涤干净的脂肪组织剪成约1mm3的小块，加入与脂肪组织等体积的I型胶原酶(浓度为1mg/ml)混匀，放入37℃恒温摇床消化1h；消化后过滤除去较大组织块，将过滤后的液体转移至离心管，2000rpm离心10min，清洗细胞并除去清洗液后，用10ml脂肪干细胞培养基(低糖DMEM)重悬并混匀细胞，接种于1个T75培养瓶内，于37℃、CO2浓度5％的状态开始培养。
原代细胞在培养瓶内2～3天，细胞开始析出并贴壁，培养液颜色由粉红色变为淡黄色即可换液，培养瓶中培养基倒到废液缸中，重新往每个培养瓶中加入10ml新鲜的培养基，继续培养。
换液后3-5天，当细胞铺满培养瓶底部约90％面积时，进行胰蛋白酶消化传代，即P0(原代)传P1(第一代)：将培养液用移液管吸出弃掉，用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1ml，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部，待大部分细胞开始脱壁时中止消化。消化后洗涤细胞并除去洗涤液后，按1:2的比例进行传代接种，每瓶加入10ml低糖DMEM培养基记为P1，如此传至3代。收集前确认脂肪干细胞所有的检测均为合格(检测项目如下表所列，检测方法均为本领域采用的现有方法)，之后洗涤、消化、洗涤、过滤收获细胞。
Figure GDA0003503855590000041
Figure GDA0003503855590000051
实施例2成纤维细胞制备
原代培养皮肤组织：用含青链霉素的PBS冲洗皮肤3次，尽量去除皮下结缔组织；将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入Dispase II 4℃条件下过夜；次日分离表皮真皮，将真皮剪切成小块，接种于35mm培养皿中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养1h，加入少量含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(其中DMEM培养基和F12培养基的比例为3∶1)，次日继续培养，以后每3d换一次液。
传代：用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化约1min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。
收集细胞将传代4-6代的细胞收集，用生理盐水洗涤细胞3次，将5×107成纤维细胞悬浮于1ml生理盐水中，待用。
成纤维细胞的鉴定：
形态学观察：利用倒置相差显微镜观察不同阶段的细胞生长情况及形态变化。原代培养3d后，可见有细胞从组织块周围爬出，细胞呈纺锤状，如纤维细胞样生长。第7～10天时可见大量细胞生长，呈鱼群样。传代培养的成纤维细胞生长旺盛，3～4d达到汇流，形态与原代相似、更加趋向一致。细胞呈长梭形，核呈椭圆形，可见1～2个核仁。
流式细胞术：用0.25％胰酶、0.02％EDTA消化收集P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本；BS清洗，0.1％Triton X100室温10min；PBS清洗，用稀释度为1∶50的鼠抗人波形蛋白一抗和兔抗人CK 15一抗常温下孵育30min；PBS清洗，加入稀释度为1∶50的FITC标记的抗鼠和抗兔的IgG为二抗，4℃避光孵育30min；PBS清洗2次，加入400μl PBS重悬细胞用于FACS分析。流式细胞术通过流式细胞术检测成纤维细胞的标志，经3代以上传代后，细胞成分均一，波形蛋白阳性细胞占总数的95％以上，具有较高的纯度；CK 15阳性细胞占总数的4％以下，为阴性表达。
实施例3 CGF制备
将装有5ml血液的采血管(不添加抗凝剂)两支对称放置到MEDIFUGE离心机中，进行差速离心，所述差速离心的程序为：加速30秒；2700转/分钟离心2分钟；2400转/分钟离心4min；2700转/分钟离心4分钟；3000转/分钟离心3分钟；减速33s，离心后血液样品分三层：上层为血清，中间层为CGF，下层为红血球部分，获得CGF，剪碎纤维蛋白凝块，收集待用。
实施例4 PRF制备
a、将装有5ml血液的采血管(不添加抗凝剂)两支对称放置到eppendorf离心机中，3000转/分钟，离心十分钟。
b、经过离心，血液分成3层，上层为淡黄色的贫血小板血浆层，底层为红细胞层，二者之间即为富含血小板的纤维蛋白凝胶层。
c、用长针头慢慢吸取中间层至5ml冻存管中，密封，4℃保存待用。
实施例5间充质干细胞分泌的外泌体的制备
按照现有技术，培养间充质干细胞至第3代，取第三代间充质干细胞培养上清40mL，4000g，4℃离心20分钟，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中，收集样本至于冰上；
取10.0mL处理后的细胞培养上清放入15mL离心管中，加入1.25mL外泌体沉淀试剂，颠倒充分混匀后4℃静置至少30min；静置后的样品12,000×g，4℃离心30min，管底可见白色沉淀，吸去上清，注意不要破坏外泌体沉淀。
外泌体重悬：加入100μl PBS，用移液器反复吹打或漩涡混合均匀，彻底溶解沉淀，此重悬液中含有完整的外泌体；
外泌体纯化：将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5mL收集管中，3,000×g，4℃离心10min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体；2-8℃保存一周，或者-80℃保存大约三个月。
外泌体沉淀试剂、纯化柱、收集管都可以从市售的外泌体提取试剂盒中获得。
实施例6脂肪干细胞、成纤维细胞、CGF、PRF、MSC外泌体的混和液制备
按照下表将所列体积的含5000万的脂肪干细胞、含5000万的成纤维细胞、CGF、PRF、MSC外泌体用生理盐水混匀至50ml输血袋中，这可用于一个乳房的填充。同样方法配比制作两份，2-8℃保存待用。
Figure GDA0003503855590000071
对比例1
脂肪颗粒物制备：将脂肪组织适当静置后，去除下层的杂质，将其置入离心机无菌离心套管中，以1000r/min速度离心3min，可见脂肪分层，取中层完整的脂肪颗粒待用。
效果例1小鼠实验
取6周龄的Balb/c裸鼠15只，分为3组，分别为实验组1、实验组2和对照组，每组5只。将所有裸鼠尾静脉注射1％戊巴比妥钠100μl，待裸鼠完全麻醉后，实验组1和实验组2在裸鼠双侧背部皮下分别进行本发明实施例6中所得胸部脂肪填充用干细胞组合物1和胸部脂肪填充用干细胞组合物2的注射(即实验组1注射胸部脂肪填充用干细胞组合物1，实验组2注射胸部脂肪填充用干细胞组合物2)。对照组在裸鼠双侧背部皮下进行对比例1中所得脂肪颗粒物的注射。每只裸鼠背部两侧各注射1ml，移植3周后，处死所有裸鼠，解剖裸鼠获取移植部位的全部脂肪组织，将双侧合并进行称重并记录。结果如下表：
实验材料 双侧脂肪组织重量
实验组1 1.66±0.07g
实验组2 1.42±0.13g
对照组 0.62±0.08g
效果例2
由于自体脂肪移植后存在一定程度的吸收率，通过以下实验说明本发明胸部脂肪填充用干细胞组合物注射后不萎缩、不塌陷、成活率高。志愿者13名，分为两组，实验组8人，对照组5人，实验组注射的是实施例6中制备的胸部脂肪填充用干细胞组合物1，乙组注射的是对比例1中获得的脂肪颗粒物。每个志愿者的单侧胸部注射量都为100ml，双侧都进行注射移植。移植12个月内对志愿者的术后胸围保持情况和满意度进行跟踪记录。
(1)进行胸部填充时，每个胸部的注射量为100ml，采用对比例1中的方法，双侧注射填充大约需要人体脂肪组织400ml，而采用本申请的方法，双侧注射填充只需要人体脂肪组织220ml。
(2)测量胸围的方法：测量时取自然端坐位，双肩摆平，双臂自然下垂，胸部挺直，平静呼吸，测量经乳头的胸部一圈的长度，测量2次，每位受试者取平均值，之后所有受试者取平均值。
术后胸围保持情况表
组别 手术后 术后2周 1个月 3个月 6个月 12个月
实验组 86.5 86.3 83.6 81.1 80.4 76.5
对照组 85.7 85.2 82.6 76.6 70.5 65.2
(3)术后满意度评价方法：
术后瘢痕：没有遗留肉眼可见瘢痕评5分、有肉眼可见2cm以上瘢痕评0分，介于两者之间的由志愿者酌情评分，评分越高代表正面评价越高。
乳房饱满效果评分：乳房饱满且有弹性评5分、认为较刚移植后胸部有30％以上的萎缩评0分，介于两者之间的由志愿者酌情评分，评分越高代表正面评价越高。
乳房均匀效果评分：乳房均匀无硬块评5分、乳房能触及0.5mm3以上的硬块评0分，介于两者之间的由志愿者酌情评分，评分越高代表正面评价越高。
整体满意度：对移植中以及移植后的情况均非常满意评5分，非常不满意评0分，介于两者之间的由志愿者酌情评分，评分越高代表正面评价越高。
术后6个月满意度调查表
Figure GDA0003503855590000091
通过以上内容可以看出：
①在达到理想丰胸的情况下，本申请方案所需要的人体脂肪组织减少了约50％。
②本方案与传统方案方法比较，术后瘢痕更小、胸部增大的效果更明显且均匀性更好、移植注射后保持情况也更好。尤其当术后3个月后，实验组和对照组的胸围保持情况有显著差异。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：包括以下组分：脂肪干细胞、成纤维细胞、浓缩生长因子、富血小板纤维蛋白以及间充质干细胞分泌的外泌体，其中：每1ml含(1-10)×107脂肪干细胞的溶液与0.5-2ml含(1-10)×107成纤维细胞的溶液、1-2ml的浓缩生长因子、0.5-2ml的富血小板纤维蛋白、以及1-3ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合。
2.根据权利要求1所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：每1ml含5×107脂肪干细胞的溶液与1ml含5×107成纤维细胞的溶液、1ml的浓缩生长因子、1ml的富血小板纤维蛋白以及2ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合。
3.根据权利要求1所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：含脂肪干细胞的溶液与含成纤维细胞的溶液中，所用溶剂均为生理盐水。
4.根据权利要求1所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：浓缩生长因子的制备方法包括以下步骤：
将装有血液、不添加抗凝剂的采血管放置到离心机中，进行差速离心，所述差速离心的程序为：加速30秒；2700转/分钟离心2分钟；2400转/分钟离心4min；2700转/分钟离心4分钟；3000转/分钟离心3分钟；减速33s，离心后血液样品分三层：取中间层黄色部分为浓缩生长因子。
5.根据权利要求1所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：富血小板纤维蛋白的制备方法包括以下步骤：
将装有血液、不添加抗凝素的采血管放置到离心机中，3000转/分钟离心10分钟；离心后血液分成3层，取中间层为富含血小板的纤维蛋白凝胶层。
6.根据权利要求1所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物，其特征在于：间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括以下步骤：
取间充质干细胞培养上清40mL，4000g，4℃离心20分钟，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中，收集样本至于冰上；
取处理后的细胞培养上清放入离心管中，加入外泌体沉淀试剂，混匀后4℃静置至少30min；静置后的样品12,000g，4℃离心30min，管底可见白色外泌体沉淀，吸去上清，加入100μl缓冲液溶解沉淀，获得重悬的外泌体；将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5mL收集管中，3,000×g，4℃离心10min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体。
7.权利要求1-6之一所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物在制备胸部脂肪填充材料中的应用。
8.一种胸部脂肪填充材料，其特征在于：包括权利要求1-6之一所述的胸部脂肪填充用干细胞组合物以及生理盐水。
9.根据权利要求8所述的胸部脂肪填充材料，其特征在于：每1ml含(1-10)×107脂肪干细胞的溶液与0.5-2ml含(1-10)×107成纤维细胞的溶液、1-2ml的浓缩生长因子、0.5-2ml的富血小板纤维蛋白、以及1-3ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合，用生理盐水补充至50ml。
10.根据权利要求9所述的胸部脂肪填充材料，其特征在于：每1ml含5×107脂肪干细胞的溶液与1ml含5×107成纤维细胞的溶液、1ml的浓缩生长因子、1ml的富血小板纤维蛋白以及2ml的间充质干细胞分泌的外泌体混合，用生理盐水补充至50ml。
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