CN110693911A - 经血源性子宫内膜干细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种经血源性子宫内膜干细胞制剂包含富血小板血浆和经血源性子宫内膜干细胞。经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法包括:(1)富血小板血浆的制备;(2)经血源性子宫内膜干细胞的制备;(3)经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备。本发明通过制备经血源性子宫内膜间充质干细胞,与富血小板血浆之间相互配合后,能有效达到相互促进的效果,适合用于制备皮肤损伤治疗药剂,能够更快更好的使伤口愈合,能够更好地达到对损伤皮肤的修复效果,减少患者痛苦,效果极佳。
Description
技术领域
本发明属于再生医学技术领域,涉及体外分离、扩增经血源性子宫内膜干细胞,以及制备生物制剂等技术,具体涉及一种经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法及其应用。
背景技术
皮肤约占人体表面积的70%,是人体最大的器官,具有保护身体、排汗、感觉温度变化、同时还参与机体免疫反应。常见的皮肤损伤包括创伤、烫伤、烧伤等,其中难愈性皮肤损伤以及损伤后引起的瘢痕,会导致机体相关组织或器官生理功能的降低,严重瘢痕甚至可以导致畸形,给病人带来极大的肉体和精神上的折磨,也造成了巨大的经济负担,这也使得皮肤损伤的修复成为科研临床工作者迫切想要解决的问题。皮瓣或皮片移植术作为临床上较为常用的治疗手段,虽然其成功率高、费用较低,但由于存在供皮区组织缺损、瘢痕形成以及疼痛等缺点,从而限制了其临床应用。真皮替代物缺乏血管结构,血管化过程慢,并且缺乏抗感染能力,导致移植成活率较低。
随着再生医学研究领域的发展,干细胞的应用为皮肤组织创面修复提供了新的方法,科学家们研究分离了人体不同组织来源的成体干细胞并将其用于组织修复与再生。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)已被证实在不同诱导条件下能够分化成骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮、心肌、肝脏、神经、肾脏、皮肤等多种组织细胞,因此在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗以及再生医学等方面的应用研究备受关注。
目前研究比较多的治疗皮肤损伤的主要是骨髓间充质干细胞。然而由于操作的侵入性强、提取的产量低、增殖速度慢等缺点限制了其可用性。近年来一种新型的间充质干细胞被发现并分离提取,即经血源性子宫内膜干细胞(Menstrual blood-derivedmesenchymal stem cells, MenSCs)。子宫作为人体中具有超强再生能力的器官,其子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生。MenSCs即来源于女性月经期间脱落的子宫内膜,它通过月经血排出体外,可以无创和安全地从所有育龄妇女中通过采集月经血获得。现有的研究己证实MenSCs具有较强的多向分化潜能,本身可以表达胚胎干细胞的表面标志物,如SSEA-4、CD-117和Oct-4。MenSCs更易转化为诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs),仅需同时转染Oct-4和Sox-2即可;与骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞相比,MenSCs 不仅具有更佳的增殖活性(其倍增时间仅为18~36h),同时亦具有较强的遗传稳定性,能传至68代时核型无畸变。因此,经血源性子宫内膜干细胞具有巨大的临床应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种经血源性子宫内膜干细胞制剂及其制备方法和应用,具有组织再生功能和巨大的临床应用前景。
为解决上述技术问题,本发明还提供一种经血源性子宫内膜干细胞制剂,包含富血小板血浆和经血源性子宫内膜干细胞。
本发明还提供一种经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法,包括:
(1)富血小板血浆(PRP)的制备,具体步骤如下:
(1-1)将若干外周血抽入含抗凝剂的无菌试管中;
(1-2)进行第1次离心,以130g离心10 min,离心后血液分为三层:上层为贫血小板血浆,主要成分是纤维蛋白原等;中层为高度浓缩的血小板,下层为红细胞;用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞,将其移入另一无菌试管中;
(1-3)进行第2次离心,以250g离心10min,离心后血浆分为三层:下层为少许红细胞,上层为贫血小板血浆,两层之间便为富血小板血浆层;
(1-4)用吸管遗弃大部分的上清液,留取适量的血清以悬浮浓缩的血小板并混匀,即得富血小板血浆(PRP);
(2)经血源性子宫内膜干细胞的制备,具体步骤如下:
(2-1)经血源性子宫内膜干细胞的原代分离、培养:收集经血约5ml,将细胞转移到含有0.2ml两性霉素B、0.2ml青链霉素、0.1ml EDTA-Na2的PBS溶液中,4℃保存,用无菌PBS等体积稀释,混匀;用1.077g/ml的Ficoll液分离月经血中的单个核细胞,去掉上清,加入适量完全培养基吹打、重悬、接种入不同培养皿中在37℃,5% CO2饱和湿度的培养箱内培养;
(2-2)经血源性子宫内膜干细胞的传代:等到72小时后更换培养基,根据细胞生长情况,每隔二天换液,汇合率到80%~90%进行传代,用0.25%胰酶进行消化,当细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液,将细胞悬液吸入离心管离心,弃上清,沉淀用完全培养液调整细胞浓度,接种于培养瓶中,置37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养;
(3)经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备:采用步骤(2)获得的PRP重悬步骤(1)制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,获得经血源性子宫内膜干细胞制剂。
其中,步骤(3)中,取步骤(2)制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液;1500rpm,离心5min ,弃上清,用4℃ PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为1×106个/mL 。
本发明还涉及经血源性子宫内膜干细胞、经血源性子宫内膜干细胞制剂、经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法在制备皮肤损伤治疗药剂中的应用。
本发明还提供一种经血源性子宫内膜干细胞。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:
本发明通过制备经血源性子宫内膜间充质干细胞,与富血小板血浆之间相互配合后,能有效达到相互促进的效果,适合用于制备皮肤损伤治疗药剂,能够更快更好的使伤口愈合,能够更好地达到对损伤皮肤的修复效果,减少患者痛苦,效果极佳。
附图说明
图1为本发明中经血源性子宫内膜干细胞的光学显微镜下形态图;
图2为本发明中经血源性子宫内膜干细胞分化鉴定图;
图3为本发明中流式细胞术分析经血源性子宫内膜干细胞的表面标志示意图;
图4为本发明中经血源性子宫内膜干细胞制剂可促进裸鼠皮肤伤口愈合情况示意图;
图5为本发明中经血源性子宫内膜干细胞制剂能够增强再生皮肤致密结构的形成示意图;
图6为本发明中经血源性子宫内膜干细胞制剂可改善再生皮肤超微结构的形成示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供了一种经血源性子宫内膜干细胞制剂,包含富血小板血浆和经血源性子宫内膜干细胞。
富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)指的是通过离心方法从全血中提取出来的血小板浓缩液,含高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白。血小板中含有大量的生长因子,包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等30余种,组织在愈合过程中离不开这些生长因子。PRP注射液释放高浓度的生长因子,从而刺激和加速创伤修复,使得伤口自然愈合。PRP开启了人体自身修复的奥秘,近年来,它在临床尤其是骨组织、软组织创面、肌腱韧带的创伤及缺损修复中被人们所重视,并取得了令人较为满意的效果。
经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法包括:
(1)富血小板血浆(PRP)的制备,具体步骤如下:
(1-1)将若干外周血抽入含抗凝剂的无菌试管中;
(1-2)进行第1次离心,以130g离心10 min,离心后血液分为三层:上层为贫血小板血浆,主要成分是纤维蛋白原等;中层为高度浓缩的血小板,下层为红细胞;用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞,将其移入另一无菌试管中;
(1-3)进行第2次离心,以250g离心10min,离心后血浆分为三层:下层为少许红细胞,上层为贫血小板血浆,两层之间便为富血小板血浆层;
(1-4)用吸管遗弃大部分的上清液,留取适量的血清以悬浮浓缩的血小板并混匀,即得富血小板血浆(PRP);此法用10 mL 的全血约制备1 mL 的富血小板血浆
(2)经血源性子宫内膜干细胞的制备,具体步骤如下:
(2-1)经血源性子宫内膜干细胞的原代分离、培养:收集经血约5ml,将细胞转移到含有0.2ml两性霉素B、0.2ml青链霉素、0.1ml EDTA-Na2的PBS溶液中,4℃保存,用无菌PBS等体积稀释,混匀;用1.077g/ml的Ficoll液分离月经血中的单个核细胞,去掉上清,加入适量完全培养基吹打、重悬、接种入不同培养皿中在37℃,5% CO2饱和湿度的培养箱内培养;
(2-2)经血源性子宫内膜干细胞的传代:等到72小时后更换培养基,根据细胞生长情况,每隔二天换液,汇合率到80%~90%进行传代,用0.25%胰酶进行消化,当细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液,将细胞悬液吸入离心管离心,弃上清,沉淀用完全培养液调整细胞浓度,接种于培养瓶中,置37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养;
(3)经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备:采用步骤(2)获得的PRP重悬步骤(1)制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,获得经血源性子宫内膜干细胞制剂。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
实施例1
经血源性子宫内膜干细胞的制备
第一步、经血源性子宫内膜干细胞的原代分离、培养:患者于月经来潮后第二天,应用月事杯进行收集经血约5ml,将细胞转移到含有0.2ml两性霉素B,0.2ml青链霉素,0.1mlEDTA-Na2的PBS溶液中,4℃保存,用无菌PBS等体积稀释,混匀。用1.077g/ml的Ficoll分选,密度梯度离心法(1800rpm/min,25min)分离经血单核细胞,吸取中间白膜层,加入2倍体积PBS溶剂,1500rpm/min,10min离心洗涤2次,去掉上清,加入适量完全培养基(含10% 自体血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM-F12培养液)吹打,重悬,接种入不同培养皿中在37℃,5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。
第二步、经血源性子宫内膜干细胞的传代:等到72小时后更换培养基,根据细胞生长情况,每隔二天换液,汇合率到80%~90%进行传代,用0.25%胰酶进行消化,当细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液终止消化。反复吹打瓶壁形成细胞悬液,将细胞悬液吸入离心管离心,弃上清,沉淀用完全培养液调整细胞浓度,接种于培养瓶中,置37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱培养。
第三步、经血干细胞的表型鉴定:细胞药物移植当天,先将所有培养瓶中的细胞制成单细胞悬液。取1×106细胞与FITC或PE标记的CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4抗体,置于4℃冰箱孵育30min ,用PBS清洗一遍,洗去未结合抗体。以相应的同型对照抗体作为阴性对照组。用FACS Canto流式细胞仪收集数据,用FACS Diva 软件分析,具体数据见图1~图3。其中,图1 为本发明中经血源性子宫内膜干细胞的光学显微镜下形态图。图2 为本发明中经血源性子宫内膜干细胞分化鉴定图,图2A为经血源性子宫内膜干细胞向脂肪细胞分化鉴定图;图2B为经血源性子宫内膜干细胞向成骨细胞分化鉴定图。图3为本发明中流式细胞术分析经血源性子宫内膜干细胞的表面标志(同型对照:灰色,特异性抗体:黑色):其中图3A为CD45、图3B为CD73、图3C为CD105、图3D为CD146抗体。利用流式细胞术分析发现,经血干细胞低表达CD45,高表达CD146、CD73、CD105。
实施例2
PRP的制备
第一步、将若干外周血抽入含抗凝剂的无菌试管中;
第二步、进行第1 次离心,以130g离心10min,离心后血液分为三层:上层为贫血小板血浆,主要成分是纤维蛋白原等;中层为高度浓缩的血小板,下层为红细胞。用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞,将其移入另一无菌试管中。
第三步、进行第2次离心,以250g离心10min,离心后血浆分为三层:下层为少许红细胞,上层为贫血小板血浆,两层之间便为富血小板血浆层。
第四步、用吸管遗弃大部分的上清液,留取适量的血清以悬浮浓缩的血小板并混匀,即为PRP。此法用10 mL的全血约制备1 mL的富血小板血浆。
实施例3
经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备
取实施例1制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。1500rpm,离心5min ,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为1×106个/mL 。
采用实施例2获得的PRP重悬P3代经血源性子宫内膜干细胞,获得经血源性子宫内膜干细胞制剂,其组成如下表所示。
组分 | 含量 |
P3代经血源性子宫内膜干细胞 | 1×10<sup>6</sup>个/mL |
PRP | 1ml |
。
本发明保护的经血源性子宫内膜干细胞、经血源性子宫内膜干细胞制剂或经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法可应用在制备皮肤损伤治疗药剂中。
试验方法
采用实施例3的细胞制剂对小鼠皮肤全层损伤模型进行试验,试验方式如下:
1、建立小鼠皮肤全层损伤模型
裸鼠购自南通大学实验动物中心。
裸鼠皮肤全层切除损伤模型的构建:将体重20克的裸鼠背部用手术剪刀剪制一个直径为1cm 的圆形创面。
2、经血源性子宫内膜干细胞制剂的应用:
将1ml PRP重悬P3代经血源性子宫内膜干细胞注射至损伤皮肤处,以PBS 作为对照,修复效果观察的时间分别是第3天、第6天、第9天、第11天、第13天。
如附图4对对照组和实验组分别进行观察和拍照,结果如图4A,从图中可以看出,实验组裸鼠在第6天时未愈合创面已小于对照组,在第11天时未愈合创面已明显比模型组小,在第13天时已基本愈合。因此可以看出实验组损伤修复速度明显快于对照组,创面愈合情况更好。
图4B显示术后3、6、9、l1、13天,计算各组残留创面面积占初始创面面积的百分比比较。统计数据表明从第6天开始,实验组和对照组之间已经有显著的统计学差异。
如附图5,将上述处理的裸鼠于第13天取皮肤伤口处的组织,制作石蜡切片,通过H&E染色观察裸鼠皮下结构变化,由图5可发现相比于对照组,实验组已长出皮下毛囊和毛根等结构,因此,经血源性子宫内膜干细胞制剂可促进裸鼠皮肤结构的形成。
如附图6,为了进一步观察经血源性子宫内膜干细胞制剂对于裸鼠皮肤结构形成的作用,我们使用电镜观察第13天各组裸鼠皮肤伤口处组织的超微结构,由图6可知与对照组相比,实验组裸鼠的皮肤结构更加完善,已基本达到正常的裸鼠皮肤结构。而对照组皮下结构尚不完善。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种经血源性子宫内膜干细胞制剂,其特征在于,包含富血小板血浆和经血源性子宫内膜干细胞。
2.一种经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法,其特征在于,包括:
(1)富血小板血浆的制备,具体步骤如下:
(1-1)将若干外周血抽入含抗凝剂的无菌试管中;
(1-2)进行第1次离心,以130g离心10 min,离心后血液分为三层:上层为贫血小板血浆;中层为高度浓缩的血小板,下层为红细胞;用吸管吸取上层、75%中层,将其移入另一无菌试管中;
(1-3)进行第2次离心,以250g离心10min,离心后血浆分为三层:下层为红细胞,上层为贫血小板血浆,两层之间便为富血小板血浆层;
(1-4)用吸管遗弃65~80%的贫血小板血浆,留取20~35%的贫血小板血浆以悬浮浓缩的血小板并混匀,即得富血小板血浆;
(2)经血源性子宫内膜干细胞的制备,具体步骤如下:
(2-1)经血源性子宫内膜干细胞的原代分离、培养:收集经血4~6ml,将细胞转移到含有0.2ml两性霉素B、0.2ml青链霉素、0.1ml EDTA-Na2的PBS溶液中,4℃保存,用无菌PBS等体积稀释,混匀;用1.077g/ml的Ficoll液分离月经血中的单个核细胞,去掉上清,加入4~6ml完全培养基吹打、重悬、接种入不同培养皿中在37℃,5% CO2饱和湿度的培养箱内培养;
(2-2)经血源性子宫内膜干细胞的传代:等到72小时后更换培养基,根据细胞生长情况,每隔二天换液,汇合率到80%~90%进行传代,用0.25%胰酶进行消化,当细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液,将细胞悬液吸入离心管离心,弃上清,沉淀用完全培养液调整细胞浓度,接种于培养瓶中,置37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养;
(3)经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备:采用步骤(2)获得的PRP重悬步骤(1)制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,获得经血源性子宫内膜干细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,取步骤(2)制备的P3代经血源性子宫内膜干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液;1500rpm,离心5min ,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度为1×106个/mL 。
4.如权利要求1所述的经血源性子宫内膜干细胞、如权利要求2所述的经血源性子宫内膜干细胞制剂或如权利要求3所述的经血源性子宫内膜干细胞制剂的制备方法在制备皮肤损伤治疗药剂中的应用。
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WO2011123779A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Cryo-Cell International, Inc. | Cell therapy to improve wound healing and related compositions and methods |
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2019
- 2019-10-30 CN CN201911043713.5A patent/CN110693911A/zh active Pending
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