CN111346051A - 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗脑梗死的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：人脐带组织块的获取、人脐带间充质干细胞的原代培养、人脐带间充质干细胞的传代培养、人脐带间充质干细胞特征的检测和人脐带间充质干细胞制剂的制备。本发明作为一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法的优选方案，其有益效果在于：避免了外源动物血清及人源血清或血清替代物的引入，降低了在制剂中引入外源微生物或致敏源的风险；提高了所得人脐带间充质干细胞的存活率、增值能力和特异性。本发明所制备的人脐带间充质干细胞注射液工艺简便，质量控制严格，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。
间充质干细胞培养过程中会分泌干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子A(PDGF-A)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素(IL)、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅱ)、巨噬细胞集落刺激因子(GSFs)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN)、神经生长因子(NGF)，以及其他还没有被分离的分子物质。这种复合细胞因子在人体内能够促进细胞增殖、分化、再生，加强新陈代谢，防止细胞衰老；介导机体细胞信号传导，活化机体干细胞，促进新毛细血管形成，进行生理性修复；调节机体亚健康，提高机体免疫清除损伤、病变、衰老的细胞。有研究表明，使用干细胞分泌因子及外泌体与使用干细胞具有相同的作用，因此用干细胞联合干细胞分泌因子做治疗与单纯用干细胞相比，优势明显。
目前国内关于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法很少见，而这个对于脑梗死的细胞治疗的意义很大，所以也是写本专利的动力所在。
发明内容
本发明提供一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法，该方法操作过程简单可靠，应用效果较好。
具体操作步骤如下：
(1)选取行剖宫产术的健康初产妇，经产妇及家属同意，无菌采集整条脐带；
(2)用PBS洗去脐带残存血液，纵向剖开脐带，并剔除动静脉血管；
(3)用组织剪将脐带组织均匀剪碎成1mm3大小的组织块；
(4)将所得组织块接种在10cm培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％-8％，温度36℃-39℃，湿度85％-100％)内1-3小时；
(5)待组织块贴壁比较牢固后，轻轻加入适量的无血清培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％-8％，温度36℃-39℃，湿度85％-100％)内静置培养；
(6)24-48小时后换液，去除多余组织及细胞碎片；
(7)约5-7天左右，瓶中贴壁细胞铺满约60％-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，所得细胞即为原代脐带间充质干细胞；
(8)将步骤(7)所得原代间充质干细胞悬液按1:2-1:4比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)；
(9)待细胞生长铺满约60％-90％时，重复步骤(7)、(8)，继续进行传代扩大培养；
(10)按照预定制剂量，选取P5-P10代细胞，经流式、内毒素、无菌及支原体检测合格后，冻存备用；
(11)搜集干细胞培养上清，0.22um滤膜过滤，经无菌、内毒素及支原体检测合格后，冻存备用；
(12)将步骤(9)所得工作细胞37℃复苏，步骤(10)所得培养上清液37℃融解，与5％-20％人血白蛋白混合制成用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液，所得人脐带间充质干细胞的细胞密度为0.5×106/ml-5×106/ml。
本发明作为一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法的优选方案，在原代脐带间充质干细胞的获取方面，与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)避免了外源动物血清及人源血清或血清替代物的引入，简化了操作及检测过程，并很大程度上降低了引入外源致病微生物或致敏源的风险，提高了产品的安全性；
(2)原代细胞分离过程避免了胶原酶消化，分离所得的原代脐带间充质干细胞活性好、扩增速度更快。
附图说明
图1是本发明实施1例中人脐带间充质干细胞原代细胞培养效果图(×40)；
图2是本发明实施1例中人脐带间充质干细胞第六代(P6)细胞培养效果图(×100)；
图3是本发明实施2例中人脐带间充质干细胞原代细胞培养效果图(×40)；
图4是本发明实施2例中人脐带间充质干细胞第八代(P8)细胞培养效果图(×100)；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
(1)无菌采集脐带：选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，除去脐静脉和动脉内的残血。纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管；
(3)用止血钳固定住脐带一段，用手术剪将脐带剪成1cm长度小段，后再用组织剪将小段脐带剪成1mm3大小的组织块。将所得组织块用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(4)将所得起到组织块均匀的铺于10cm培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内1小时；
(5)待组织块贴壁比较牢固后，轻轻加入适量的干细胞专用无血清培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(6)24小时后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用无血清培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml新鲜无血清培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(7)第5天，培养皿中贴壁细胞铺满约60％。用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml无血清培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml新鲜无血清培养基重悬。所得细胞即为原代脐带间充质干细胞；
(8)将步骤(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1:2比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)(具体培养结果见图1)；
(9)待细胞生长铺满约80％时，重复步骤(7)、(8)，继续进行传代扩大培养；
(10)按照预定制剂量，选取P6代细胞(具体培养结果见图2)，经流式、内毒素、无菌及支原体检测合格后，冻存备用；
(11)搜集培养细胞24小时左右的干细胞培养上清，0.22um滤膜过滤，经无菌、内毒素及支原体检测合格后，冻存备用；
(12)将步骤(9)所得工作细胞37℃复苏，步骤(10)所得培养上清液37℃融解，与10％人血白蛋白混合，制成细胞密度约0.5×106/ml的细胞悬液，此即为用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液。
实施例2
(1)无菌采集脐带：选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，除去脐静脉和动脉内的残血。纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管；
(3)用止血钳固定住脐带一段，用手术剪将脐带剪成1cm长度小段，后再用组织剪将小段脐带剪成1mm3大小的组织块。将所得组织块用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(4)将所得起到组织块均匀的铺于10cm培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内2小时；
(5)待组织块贴壁比较牢固后，轻轻加入适量的干细胞专用无血清培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(6)48小时后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用无血清培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml新鲜无血清培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(7)第7天，培养皿中贴壁细胞铺满约80％。用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml无血清培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml新鲜无血清培养基重悬。所得细胞即为原代脐带间充质干细胞；
(8)将步骤(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1:4比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)(具体培养结果见图3)；
(9)待细胞生长铺满约80％时，重复步骤(7)、(8)，继续进行传代扩大培养；
(10)按照预定制剂量，选取P8代细胞(具体培养结果见图4)，经流式、内毒素、无菌及支原体检测合格后，冻存备用；
(11)搜集培养细胞24小时左右的干细胞培养上清，0.22um滤膜过滤，经无菌、内毒素及支原体检测合格后，冻存备用；
(12)将步骤(9)所得工作细胞37℃复苏，步骤(10)所得培养上清液37℃融解，与20％人血白蛋白混合，制成细胞密度约2×106/ml的细胞悬液，此即为用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将脐带快速置于脐带保存液中；
(2)将步骤(1)所述脐带纵向剖开，剔除脐带内的动静脉血管，并将所得华通氏胶剪成组织匀浆块，并用滤网过滤；
(3)将步骤(2)所得组织匀浆块平铺于细胞培养皿，置于细胞培养箱孵育；
(4)将步骤(3)培养皿中加入无血清培养基，置于细胞培养箱内培养；
(5)将步骤(4)培养皿中原有培养基弃去，更换为新鲜培养基；
(6)将步骤(5)中的细胞用胰酶进行消化，得到P0代细胞；
(7)将步骤(6)所得P0代细胞进行传代，传至P5-P10代时收获细胞；
(8)对收获的细胞进行鉴定及检测；
(9)制备人脐带间充质干细胞注射液。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)所取用的脐带是健康、足月、行剖宫产的初产妇在胎儿娩出后结扎的人脐带；所述人脐带保存液是1％青霉素钠和1％硫酸链霉素的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)须剔除脐带内的动静脉血管；所述组织匀浆块体积为1mm3左右；所述滤网为200目。
4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养箱条件为3％-8％二氧化碳、温度范围36℃-39℃、湿度85％-100％；所述培养/孵育方式为静置培养/孵育。
5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(5)所述更换培养基时间为步骤(4)之后24-48小时。
6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(6)所述胰酶消化操作为步骤(5)之后5-7天且/或培养皿中贴壁细胞铺满约60％-90％时进行。
7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(6)所用胰酶为重组胰蛋白酶。
8.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(7)传代时的比例为1:2到1:4之间；传代时间为步骤(6)和/或上一代细胞培养皿中贴壁细胞铺满约60％-90％时进行。
9.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(8)所述细胞表面抗原鉴定合格标准为：CD90、CD73、CD105表达均大于95％，CD45、CD34、CD79a、CD14、HLA-DR表达均小于2％。
10.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(9)所得制剂含有以下组分：人脐带间充质干细胞，细胞密度为0.5×106/ml-5×106/ml；步骤(8)所得人脐带间充质干细胞培养上清液；人血白蛋白，体积分数5％-20％。
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