CN111893093A - 一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体通过对传代培养获得的脐带间充质干细胞进行超速离心分离、提取和透析纯化得到，能够在较短时间内获得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体。该方法操作简单、易于实现，具有广泛的应用前景。

Description

一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法
技术领域
本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。
近年来研究发现，干细胞在培养过程中可以向培养基中分泌多种生物活性物质，包括外泌体、微囊泡、细胞因子、microRNA、信号蛋白和活性肽等。其中部分活性物质由于分子量过大或互相之间发生交联，导致其无法高效的通过人体屏障，在临床应用上存在一定的局限性。超微因子作为干细胞分泌的外泌体中所有活性物质的总称，其超低的分子量可以保证超微因子可以快速的穿过人体屏障，进入细胞内部发挥生物学功能，具有巨大的临床应用潜力。
目前关于超微因子的制备方法尚属空白，因此，有必要对其制备方法进行研究以满足超微因子未来的开发与应用的需求。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，包括以下步骤：
培养：将P1-P10代脐带间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后收集上清液，离心去除细胞碎片，得到包含超微因子的溶液；
分离：使用0.22μm无菌过滤膜对所述包含超微因子的溶液进行过滤，所得滤液在0-20℃，50000-200000g离心30-90min，弃上清；
提取：用无菌PBS重悬，加入提取液，颠倒混匀，0-20℃静置2-24h后，在0-20℃，2000-10000g离心0.5-4h，所得沉淀即为粗制超微因子；
纯化：用无菌PBS重悬，装入透析袋，在0-20℃透析2-24h，即得到超微因子。
进一步地，所述干细胞培养基为无动物源成分培养基。作为优选，本发明实施例的干细胞培养基的的组成如下：无水氯化钙100-300mg/L、九水合硝酸铁0.03-0.2mg/L、氯化钾200-500mg/L、无水硫酸镁50-150mg/L、氯化钠5000-7200mg/L、无水磷酸二氢钠75-165mg/L、L-盐酸精氨酸65-105mg/L、L-盐酸胱氨酸42-86mg/L、L-谷氨酰胺320-760mg/L、甘氨酸14-32mg/L、L-盐酸组氨酸30-54mg/L、L-异亮氨酸75-165mg/L、L-亮氨酸80-125mg/L、L-盐酸赖氨酸120-165mg/L、L-甲硫氨酸12-48mg/L、L-苯丙氨酸30-80mg/L、L-丝氨酸25-62mg/L、L-苏氨酸72-125mg/L、L-色氨酸8-22.5mg/L、L-酪氨酸钠盐75-162mg/L、L-缬氨酸80-160mg/L、D-泛酸钙0.5-6.5mg/L、氯化胆碱2.5-8mg/L、叶酸2.5-6.5mg/L、肌醇4.2-8.6mg/L、烟酰胺3-7.5mg/L、核黄素0.2-1.2mg/L、盐酸硫胺1.6-5.8mg/L、盐酸吡哆辛2.4-6mg/L、葡萄糖2000-8500mg/L、丙酮酸钠80-135mg/L、亚硒酸钠0.01-0.03mg/L、胰岛素10-45mg/L、总细胞因子含量2-80mg/L。
进一步地，所述离心去除细胞碎片的步骤包括：在0-20℃，800-1200g离心25min，取上清液，在0-20℃，800-1200g再次离心30min，保留上清液，即得到包含超微因子的溶液。
进一步地，所述提取液通过以下方法获得：将15-30g聚乙二醇和3-10g氯化钠添加到80ml超纯水中，溶解混匀，定容至100ml。
进一步地，所述无菌PBS和提取液在使用前，进行0-20℃预冷处理。
进一步地，所述P1-P10代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：
(1)将脐带快速置于脐带保存液中；
(2)脐带纵向剖开，剔除脐带内的动静脉血管，将所得华通氏胶剪成组织匀浆块，滤网过滤；
(3)将过滤得到的组织匀浆块平铺于细胞培养皿，置于细胞培养箱孵育；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，向细胞培养皿中加入干细胞培养基，置于细胞培养箱内培养；
(5)24-48h后，弃去原有培养基，更换为新鲜培养基；
(6)待细胞培养皿中贴壁细胞铺满60-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，得到P0代细胞；
(7)将所得P0代细胞进行传代，传至P1-P10代时收获细胞；
(8)对收获的细胞进行鉴定及检测。
进一步地，步骤(1)中，所述脐带是健康、足月、行剖宫产的初产妇在胎儿娩出后结扎的人脐带；所述脐带保存液的组成如下：在PBS溶液的基础上，添加1％青霉素钠和1％硫酸链霉素。
进一步地，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-2mm3；所述滤网孔径为200目。
进一步地，所述细胞培养箱条件为3-8％二氧化碳、温度36-39℃、湿度85-100％；所述培养/孵育为静置培养/孵育。
进一步地，步骤(7)中，P0代细胞悬液按1：2-4的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)，待贴壁细胞生长铺满60-90％时，重复步骤(6)的操作，继续进行传代至P1-P10代。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明的脐带间充质干细胞来源的超微因子通过对传代培养获得的脐带间充质干细胞进行超速离心分离、提取和透析纯化得到，该方法能够在较短时间内获得高纯度、高密度的具有生物学活性的超微因子。该方法操作简单、易于实现，具有广泛的应用前景。
(2)本发明将去除细胞碎片后的干细胞上清液在50000-200000g离心30-90min，获得高纯度超微因子原液，再进一步提取、透析纯化，得到纯度更高的超微因子。
(3)本发明通过对脐带间充质干细胞的培养分离方法进行改进，能提高脐带间充质干细胞的数量、活性，进而在一定程度上提高了超微因子的提取率和纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1是本发明实施例1的P0代间充质干细胞显微镜图；
图2是本发明实施例1的P6代间充质干细胞显微镜图；
图3是本发明实施例1的P6代间充质干细胞流式检测结果图；
图4是本发明实施例2制得的超微因子直径分布范围示意图；
图5是本发明实施例2制得的超微因子在扫描电子显微镜下的形态图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法包括以下步骤：
(1)选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，除去脐静脉和动脉内的残血，纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管，用止血钳固定住脐带一段，用手术剪将脐带剪成1cm长度小段，再用组织剪将小段脐带剪成体积为1mm3大小的组织块，用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(3)将过滤得到的组织匀浆块均匀的铺于10cm细胞培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内1h；
(4)待组织匀浆块贴壁比较牢固后，轻轻加入适量的干细胞培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(5)24h后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml干细胞培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(6)第5天，培养皿中贴壁细胞铺满约60％。用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml干细胞培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml新鲜干细胞培养基重悬，所得细胞即为原代脐带间充质干细胞(P0)；
(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1：2的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)；
(8)待细胞生长铺满60％时，重复步骤(6)、(7)，继续进行传代至P6代；
(9)待P6代融合度达到80％后将其吸出培养基，更换干细胞培养基培养24h，收集上清液，在10℃，1200g离心25min，取上清液，在10℃，1200g再次离心30min，保留上清液，得到包含超微因子的溶液；
(10)取上述包含超微因子的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后将滤液在10℃，120000g离心60min，弃上清；
(11)取1ml温度为15℃的无菌PBS重悬步骤(10)所得沉淀，加入5ml温度为15℃的提取液(提取液的制备方法：将聚乙二醇15g和氯化钠5g，加入80ml超纯水中溶解，定容至100ml)，颠倒混匀，15℃静置4h，所得混合液在10℃，10000g离心4h，弃上清液，所得沉淀即为粗制超微因子；
(12)将粗制超微因子用无菌PBS重悬，装入透析袋，并将透析袋置于100倍以上体积的透析液中透析12h去除杂质，期间分别在4h和8h间更换透析液，所得产物即为超微因子。
实施例2
本实施例的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法包括以下步骤：
(1)选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，除去脐静脉和动脉内的残血，纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管，用止血钳固定住脐带一段，用手术剪将脐带剪成1cm长度小段，再用组织剪将小段脐带剪成1mm3大小的组织块，用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(3)将过滤得到的组织匀浆块均匀的铺于10cm细胞培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内2h；
(4)待组织匀浆块贴壁比较牢固后，轻轻加入适量的干细胞培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(5)48h后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml干细胞培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(6)第5天，培养皿中贴壁细胞铺满约80％。用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml干细胞培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml新鲜干细胞培养基重悬，所得细胞即为原代脐带间充质干细胞(P0)；
(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1：4比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)；
(8)待细胞生长铺满约90％时，重复步骤(6)、(7)，继续进行传代至P5代；
(9)待P5代融合度达到90％后将其吸出培养基，更换干细胞培养基培养24h，收集上清液，在15℃，800g离心25min，取上清液，在15℃，800g再次离心30min，保留上清液，得到包含超微因子的溶液；
(10)取上述包含超微因子的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后将滤液置于100000g转速下离心90min，弃上清；
(11)取2.5ml温度为10℃的无菌PBS重悬步骤(10)所得沉淀，加入10ml温度为12℃的提取液(提取液的制备方法：将聚乙二醇18g和氯化钠3g，加入80ml超纯水中溶解，定容至100ml)，颠倒混匀，20℃静置4h，所得混合液10℃，8000g离心3h，弃上清液，所得沉淀即为粗制超微因子；
(12)将粗制超微因子用无菌PBS重悬，装入透析袋，并将透析袋置于100倍以上体积的透析液中透析24h去除杂质，期间分别在2-4h、6-8h和10-14h间更换透析液，所得产物即为超微因子。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养：将P1-P10代脐带间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后收集上清液，离心去除细胞碎片，得到包含超微因子的溶液；
分离：使用0.22μm无菌过滤膜对所述包含超微因子的溶液进行过滤，所得滤液在0-20℃，50000-200000g离心30-90min，弃上清；
提取：用无菌PBS重悬，加入提取液，颠倒混匀，0-20℃静置2-24h后，在0-20℃，2000-10000g离心0.5-4h，所得沉淀即为粗制超微因子；
纯化：用无菌PBS重悬，装入透析袋，在0-20℃透析2-24h，即得到超微因子。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述干细胞培养基为无动物源成分培养基。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述离心去除细胞碎片的步骤包括：在0-20℃，800-1200g离心25min，取上清液，在0-20℃，800-1200g再次离心30min，保留上清液，即得到包含超微因子的溶液。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述提取液通过以下方法获得：将15-30g聚乙二醇和3-10g氯化钠添加到80ml超纯水中，溶解混匀，定容至100ml。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述无菌PBS和提取液在使用前，进行0-20℃预冷处理。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述P1-P10代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：
(1)将脐带快速置于脐带保存液中；
(2)脐带纵向剖开，剔除脐带内的动静脉血管，将所得华通氏胶剪成组织匀浆块，滤网过滤；
(3)将过滤得到的组织匀浆块平铺于细胞培养皿，置于细胞培养箱孵育；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，向细胞培养皿中加入干细胞培养基，置于细胞培养箱内培养；
(5)24-48h后，弃去原有培养基，更换为新鲜培养基；
(6)待细胞培养皿中贴壁细胞铺满60-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，得到P0代细胞；
(7)将所得P0代细胞进行传代，传至P1-P10代时收获细胞；
(8)对收获的细胞进行鉴定及检测。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脐带是健康、足月、行剖宫产的初产妇在胎儿娩出后结扎的人脐带；所述脐带保存液的组成如下：在PBS溶液的基础上，添加1％青霉素钠和1％硫酸链霉素。
8.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-2mm3；所述滤网孔径为200目。
9.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，所述细胞培养箱条件为3-8％二氧化碳、温度36-39℃、湿度85-100％；所述培养/孵育为静置培养/孵育。
10.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，P0代细胞悬液按1：2-4的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)，待贴壁细胞生长铺满60-90％时，重复步骤(6)的操作，继续进行传代至P1-P10代。
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