CN110904037A - 一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。本发明外泌体通过对羊膜的分离、洗涤、除上皮细胞、剪碎、消化、离心取第二层悬液、重悬、接种培养以及后续的抽提制备等步骤得到。该外泌体在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用，能使得血管内皮细胞聚集，血管新生，进而重建微循环增加血流灌注，并且不会引起其他功能的缺失等良好功效，应用前景好；本发明对细胞提取过程进行了优化，羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高，获取更多细胞的前提下，能够保证更大量的外泌体的获取。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。
背景技术
创伤、感染或肿瘤切除引起的骨缺损的修复仍是颌骨缺损面临的主要挑战。自体骨移植的应用，最常见的来自髂骨，被认为是黄金标准。不足在于供体部位的发病率和移植物的大小限制。从健康的骨骼中获取自体移植物的过程增加了手术时间，并可能与潜在的失血和感染风险相关。此外，患者的年龄和代谢紊乱也可能影响自体移植物的质量。内源性间充质干细胞(MSCs)浓度不一致或较低会显著降低自体移植的疗效。因此，有助于克服这些问题的骨组织工程方法近年来引起了人们的兴趣。虽然同种异体骨移植可能比自体骨移植在骨科手术中更有优势，但植入后初期存在血管化不足的问题。在3D组织构建中，宿主血管的长入量通常限制在每天十分之一微米，并且可能需要几周时间才能达到植入支架的中心。此外，炎症反应诱导新生血管容易出现的早期消退。与此同时，移植物内细胞的存活及其与宿主组织的融合强烈依赖于血液微循环提供的营养和氧气交换以及废物的清除。在骨组织中，血管系统还提供矿化过程中所必需的钙和磷酸盐。因此如何促进血管化新生骨的形成成为修复颌骨缺损的重要影响因素。
血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管内皮生长因子(VEGF)，为单一基因编码的同源二聚体糖蛋白，能直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，并增加微血管通透性。它是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后，直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成管腔样结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的血管形成刺激因子。骨是高度血管化的组织，血管生成先于骨生成，是骨生成的先决条件，而与骨化类型无关。在软骨内成骨过程中，肥大的软骨细胞释放血管生成生长因子，诱导软骨内血管的侵袭，形成骨骼的大部分骨骼。新的血管系统有助于软骨模板被骨痂取代。内皮细胞构成血管内层，分泌生长因子，控制破骨细胞、成骨细胞和骨形成细胞的募集。膜内骨化是扁平骨和锁骨发育的基础，也是组织工程骨移植的基础。在膜间骨化过程中，骨组织直接由骨祖细胞凝聚而成，没有软骨作为中介。内皮细胞与这些冷凝物结合形成血管网络，作为骨矿物质沉积的“模板”。此外，骨形成与血管形成的功能依赖不仅发生在骨骼发育过程中，而且还发生在骨重建和愈合过程中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用。
本发明是这样实现的，一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用。
优选地，该药物的剂型包括液体剂型和凝胶颗粒型。
优选地，所述药物的剂型为液体剂型，该液体剂型包括所述外泌体和稀释液，所述稀释液为水凝胶或PBS，所述外泌体的浓度为150～200μg/mL。
本发明进一步公开了上述羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)选用人羊膜来源的间充质干细胞进行分离培养与传代
A1、将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；
B1、将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
C1、将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/LⅡ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNaseⅠ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；
D1、将羊膜消化悬液1/2X mL叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；
E1、将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养；
(2)羊膜间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备
A2、采用培养基在10cm直径的培养皿培养羊膜间充质，48h～72h后收取培养上清液；
B2、将上清液于4℃、300×g、10min离心除去细胞碎片；4℃、2000×g，10min离心去除死细胞等杂质；0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃100000×g，120min超速离心得到外泌体沉淀，去除上清液后加入约200uL PBS洗涤一遍；再次4℃100000×g，120min超速离心，弃去上清液，加入100uL PBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体。
优选地，在步骤A1中，所述胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得；所述洗涤为将羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤；
在步骤B1中，所述十二烷基硫酸钠浓度为0.03％(w/v)，所述乙二胺四乙酸浓度为0.1％(w/v)，所述浸泡的时间为0.5h；所述羊膜机械剪碎至2mm*2mm大小；
在步骤C1中，所述Ⅱ型胶原酶浓度为2g/L，所述DNaseⅠ浓度为0.05g/L；所述消化的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05；
在步骤D1中，所述分离液为由1份10XPBS与9份聚乙烯吡咯烷酮贮存液混合而成的等渗聚乙烯吡咯烷酮分离液；所述分离液初始密度为1.1294g/mL；所述离心转速为1500rpm；
在步骤E1中，所述培养基为由双抗混合液与15％胎牛血清的α-MEM培养液充分混合均匀后制成；所述双抗混合液为青霉素80万u+pbs 4mL，链霉素100万u+pbs 5mL，各自混匀后，再一起混匀制得；所述培养的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05。
优选，在步骤A2中，所述的培养基配方为：含有质量百分比10％FBS和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基。
人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)具有免疫原性低、利用方便等优点，特别是在促进血管生成方面具有巨大的优势，因此作为有希望的种子细胞而受到广泛关注。HAMSCs显著表达和分泌高水平的代表性促血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2和血管生成素-1。我们之前的研究已经证明，HAMSCs在体内和体外都能促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的发芽和成管。
到目前为止，越来越多的证据表明，骨髓间充质干细胞在修复过程中的营养作用是由骨髓间充质干细胞释放的旁分泌因子引起的，而不是分化成所需的细胞。血管生成被认为是由一系列血管生成相关的细胞因子调控的，如促血管生成因子VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(ANG)、血管生成抑制剂vasohibin-1(VASH1)和血小板因子4(PF4)。细胞外囊泡主要包括两个不同的群体：(i)微囊泡，微囊泡是尺寸在150～1000nm之间的微颗粒；(ii)外泌体，直径在40～150nm之间的纳米颗粒。它们都是旁分泌信号的关键生物效应因子，由应答细胞起作用。它们包括可溶性、生物活性因子(蛋白质、脂质等)和RNA(主要是调节性microRNA)作为它们的复杂载体。
本发明研究表明，羊膜间充质干细胞分泌的外泌体内包含大量促血管生成因子(VEGF)以及血管生成素(ANG)等。当外泌体和靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子以胞吞的形式被接收，在靶细胞中得以释放并发挥作用。外泌体的脂质双分子膜不仅可以保护活性物质在细胞外环境中不被降解或稀释，还可以利用膜表面的特异配体，识别特定细胞并定向聚集，与受体细胞高效率结合，纳米级的体积使得外泌体可以随着血液或其他体液无障碍地通过生物屏障，远距离抵达并作用于各种靶细胞：如血管内皮细胞，骨髓间充质干细胞等，从而对血管化新骨形成产生促进作用。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)羊膜间充质干细胞来源广泛，产品易于制备及贮藏，通过梯度离心、过滤及超速离心后的外泌体纯度很高并且可以储存于-80℃冰箱至少6个月依然保持活性以及功能；
(2)安全系数高，易于吸收：羊膜间充质干细胞本身不具有免疫原性，避免了干细胞本身潜在的致瘤隐患。外泌体通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子生物因子(如蛋白质，RNA)被细胞的磷脂双分子膜所阻挡，不容易被细胞吸收的问题；
(3)具有靶向性：干细胞外泌体其中包含了多种促血管新生因子、mRNA和miRNA，使得血管内皮细胞聚集，血管新生，进而重建微循环增加血流灌注。并且不会引起其他功能的缺失；
(4)给药途径广泛：除对组织器官缺血区域直接注射，或与凝胶颗粒混匀后移植入受区，皆不影响外泌体活性及作用。
(5)本发明对羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法中，对细胞提取过程进行了优化，羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高，获取更多细胞的前提下，能够保证更大量的外泌体的获取。
附图说明
图1是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析BT/TV图；
图2是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析Tb/Th图；
图3是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析Tb/sp图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)选用人羊膜来源的间充质干细胞进行分离培养与传代：
A1、将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；
在步骤A1中，所述胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得；所述洗涤为将羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤；
B1、将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
在步骤B1中，所述十二烷基硫酸钠浓度为0.03％(w/v)，所述乙二胺四乙酸浓度为0.1％(w/v)，所述浸泡的时间为0.5h；所述羊膜机械剪碎至2mm*2mm大小；
C1、将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/LⅡ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNaseⅠ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；
在步骤C1中，所述Ⅱ型胶原酶浓度为2g/L，所述DNaseⅠ浓度为0.05g/L；所述消化的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05；
D1、将羊膜消化悬液1/2X ml叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；
在步骤D1中，所述分离液为由1份10XPBS与9份聚乙烯吡咯烷酮贮存液混合而成的等渗聚乙烯吡咯烷酮分离液；所述分离液初始密度为1.1294g/mL；所述离心转速为1500rpm。
E1、将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养；
在步骤E1中，所述培养基为由双抗混合液与15％胎牛血清的α-MEM培养液充分混合均匀后制成；所述双抗混合液为青霉素80万u+pbs 4mL，链霉素100万u+pbs 5mL，各自混匀后，再一起混匀制得；所述培养的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05。
(2)羊膜间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备：
A2、采用培养基在10cm直径的培养皿培养羊膜间充质，48h～72h后收取培养上清液；
在步骤A2中，所述的培养基配方为：含有质量百分比10％FBS和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基；
B2、将上清液于4℃、300×g、10min离心除去细胞碎片；4℃、2000×g，10min离心去除死细胞等杂质；0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃100000×g，120min超速离心得到外泌体沉淀，去除上清液后加入约200uL PBS洗涤一遍；再次4℃100000×g，120min超速离心，弃去上清液，加入100uL PBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体。
实施例2
一种外泌体水凝胶复合物，包括占复合物质量体积分数(W/V)为1～20％的基于壳聚糖-β-甘油磷酸钠的水凝胶、150～200μg/mL温敏性水凝胶添加剂(即上述实施例1中制备得到的外泌体)以及余量生理盐水。
实施例3
一种外泌体水溶液，以无菌PBS溶解液体为溶剂，溶剂中外泌体浓度范围为150～200μg/mL。
实施例4
以上述实施例制备得到的外泌体水凝胶复合物、外泌体水溶液分别给颌骨缺损大鼠进行给药，结合对照组参照，实验结果如图1～3所示。其中，图1是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对于骨体积分数(bone volume fraction)的对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析BT/TV图；图2是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对于骨小梁厚度(bone trabecular thickness)的对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析Tb/Th图；图3是修复大鼠颌骨缺损新生骨实验1、2、3个月时，对于小梁隔(trabecular septum)的对照组、外泌体水溶液组以及外泌体凝胶组micro-CT数据分析Tb/sp图。
本发明首次对人羊膜间充质干细胞外泌(HAMSC-Exo)的蛋白成分进行蛋白组学检测，发现VEGF丰度突出；而后对与羊膜间充质干细胞外泌体共培养的血管内皮细胞进行检测，经Western Blot检测发现HIF-1α、VEGF等血管化相关蛋白量均显著增高，印证了外泌体中的因子在血管内皮细胞中具有促血管化作用。并通过等量的干细胞做对照，发现干细胞的外泌体可以发挥“干细胞样”的促血管化作用，改变受损组织周围微环境，促进血管新生，间接实现缺血部位的修复或存活。将干细胞的外泌体作为药物直接移植或者配合其他组合形成液体剂型或颗粒剂型等移植到颌骨缺损部位如囊肿手术后创面等成为一种有潜力的治疗方法。并且相比较干细胞本身，其外泌体具备精准高效的靶向作用机制、易于收集保存、结构稳定不易降解老化、规避不良分化而致的肿瘤形成等优势使得外泌体在缺血性病损治疗中具备极高的商品化潜能和转化应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，该药物的剂型包括液体剂型和凝胶颗粒型。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为液体剂型，该液体剂型包括所述外泌体和稀释液，所述稀释液为水凝胶或PBS，所述外泌体的浓度为150～200μg/mL。
4.一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)选用人羊膜来源的间充质干细胞进行分离培养与传代
A1、将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；
B1、将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
C1、将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/LⅡ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNaseⅠ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；
D1、将羊膜消化悬液1/2X mL叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；
E1、将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养；
(2)羊膜间充质干细胞来源的外泌体的抽提制备
A2、采用培养基在10cm直径的培养皿培养羊膜间充质，48h～72h后收取培养上清液；
B2、将上清液于4℃、300×g、10min离心除去细胞碎片；4℃、2000×g，10min离心去除死细胞等杂质；0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质；4℃100000×g，120min超速离心得到外泌体沉淀，去除上清液后加入约200uL PBS洗涤一遍；再次4℃100000×g，120min超速离心，弃去上清液，加入100uL PBS可得到间充质干细胞来源的外泌体。
5.如权利要求4所述的羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，其特征在于，在步骤A1中，所述胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得；所述洗涤为将羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤；
在步骤B1中，所述十二烷基硫酸钠浓度为0.03％(w/v)，所述乙二胺四乙酸浓度为0.1％(w/v)，所述浸泡的时间为0.5h；所述羊膜机械剪碎至2mm*2mm大小；
在步骤C1中，所述Ⅱ型胶原酶浓度为2g/L，所述DNaseⅠ浓度为0.05g/L；所述消化的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05；
在步骤D1中，所述分离液为由1份10XPBS与9份聚乙烯吡咯烷酮贮存液混合而成的等渗聚乙烯吡咯烷酮分离液；所述分离液初始密度为1.1294g/mL；所述离心转速为1500rpm；
在步骤E1中，所述培养基为由双抗混合液与15％胎牛血清的α-MEM培养液充分混合均匀后制成；所述双抗混合液为青霉素80万u+pbs 4mL，链霉素100万u+pbs 5mL，各自混匀后，再一起混匀制得；所述培养的温度为37℃、CO2的体积分数均为0.05。
6.如权利要求4所述的羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，其特征在于，在步骤A2中，所述的培养基配方为：含有质量百分比10％FBS和质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基。
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