CN111394305A - 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用 - Google Patents

一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111394305A
CN111394305A CN202010269310.9A CN202010269310A CN111394305A CN 111394305 A CN111394305 A CN 111394305A CN 202010269310 A CN202010269310 A CN 202010269310A CN 111394305 A CN111394305 A CN 111394305A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesenchymal stem
hamscs
expression
cell
mir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010269310.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111394305B (zh
Inventor
靳建亮
谢春凤
朱剑云
苗登顺
王嵘
于珍珍
孙海建
陈海云
周佳雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN202010269310.9A priority Critical patent/CN111394305B/zh
Publication of CN111394305A publication Critical patent/CN111394305A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111394305B publication Critical patent/CN111394305B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，制备方法为：分离培养获得人羊膜间充质干细胞后，培养并进行传代扩增，培养第3‑5代人羊膜间充质干细胞，密度达到70％‑80％时弃去培养基，用PBS洗涤后换用含5％无细胞外囊泡的胎牛血清的α‑MEM(不含酚红)培养液，继续培养48h后收集细胞培养上清，最后通过梯度及高速离心制备得到细胞外囊泡。该细胞外囊泡可通过携带的miRNAs21‑5p/128‑3p/221‑3p，直接靶向结合肥大的心肌细胞内的PIK3R1 mRNA的3’‑UTR区，抑制PI3K/Akt通路，因此可用于制备防治病理性心肌细胞肥大药物。

Description

一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)来源的细胞外囊泡及其应用。
背景技术
病理性心肌细胞肥大(pathological cardiomyocytes hypertrophy,PCH)主要由衰老及神经体液失调控(如血管紧张素II升高)所引起，是多种心血管疾病(如高血压、心肌梗塞、缺血性心脏病等)的共同过程，被认为是引起心力衰竭和死亡的重要独立危险因素，防治PCH对治疗多种心血管病症有着重要的意义。传统的药物和干预措施仅可部分改善临床症状，探索新的临床治疗方法和策略从而抑制甚至逆转病理性心肌细胞肥大逐渐成为心血管领域研究的重要方向。
人羊膜间充质干细胞(humanamniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)由产后被“废弃”的羊膜组织中获取，具有取材方便、来源广泛且无伦理学争议、低免疫原性、有较强的多分化潜能等优势，是治疗心血管疾病理想的一种间充质干细胞。研究发现：间充质干细胞(MSCs)的移植治疗作用中的80％是通过其旁分泌作用实现的。旁分泌物质被称为干细胞释放分子组，包括蛋白质，microRNA(miRNA)，生长因子和抗氧化剂等，发挥免疫调节，促进血管发生，抗氧化和抗凋亡，促进组织再生修复等作用。作为旁分泌的主要方式，MSCs来源的细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)具有与MSCs相似的生物学效应，而且易于提取、改造，比干细胞移植致瘤的风险低，在损伤修复治疗中具有重要意义。细胞分泌的EVs中包含miRNA，这些miRNA可被运送至受体细胞并通过改变靶基因的表达调控受体细胞的功能。EVs主要包括了微囊泡及外泌体，细胞在受到物理化学刺激后，胞吞形成早期胞内体，随着与高尔基体和内质网的相互作用，胞膜内发生内陷，形成多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合后再通过胞吐作用，将多囊泡体中的囊泡释放到胞外而形成了直径不同的微囊泡(100-2000nm)或外泌体(40-100nm)。
相关的现有技术有：公开号为CN106635976A的中国发明专利公开了获得羊膜间充质干细胞的方法及试剂盒，公开号为CN104488850A的中国发明专利公开了一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，但是目前尚无关于hAMSCs来源的细胞外囊泡及其在制备防治病理性心肌细胞肥大药物中的应用方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其在制备防治病理性心肌细胞肥大药物中的应用，其中所述细胞外囊泡制剂源自人羊膜间充质干细胞，主要包含了miRNAs21-5p/128-3p/221-3p，可以通过细胞间传递的方式将miRNAs传递至肥大的心肌细胞，直接靶向结合肥大的心肌细胞内的PIK3R1mRNA的3’-UTR区，抑制PI3K/Akt通路，防治病理性心肌细胞肥大。
技术方案
一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，直径为40-300nm，所述细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：
(1)分离培养获得人羊膜间充质干细胞后，培养并进行传代扩增，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基培养第3-5代人羊膜间充质干细胞，密度达到70％-80％时，弃去培养基，使用PBS洗涤细胞3-5次，换用含5％无细胞外囊泡的胎牛血清的α-MEM(不含酚红)培养液，继续培养48h后，收集细胞培养上清；
(2)取10ml细胞培养上清，梯度离心后取上清，过滤去除细胞碎片，以100000g的转速4℃离心100-150min，得到的沉淀即为细胞外囊泡。
步骤(1)中，所述无细胞外囊泡的胎牛血清的制备方法：将Gibco胎牛血清以100000-120000g的转速4℃离心12h后，分为3层，轻轻吸取最上层透明层，即为无细胞外囊泡的胎牛血清。
进一步，步骤(1)中，所述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法包括如下步骤：
1)使用含双倍青链霉素的PBS缓冲液反复冲洗羊膜组织，然后将羊膜组织剪碎，按羊膜组织:消化液＝1:(1-2)的体积比加入消化液，37℃孵育7-10min，得到消化后的羊膜组织；所述消化液为含有2.4U/ml蛋白酶Dispase的1x磷酸盐缓冲液(PBS)；
2)将消化后的羊膜组织加入到含有10％胎牛血清的α-MEM完全培养基中，室温静置5-10min后，按羊膜组织:消化液＝1:(2-3)的体积比将羊膜组织放入消化液中，37℃下消化，得到消化后的组织液；所述消化液为含有0.75mg/ml胶原酶collagen D和5％胎牛血清的α-MEM完全培养基；
3)将消化后的组织液离心，去上清，留沉淀，反复用PBS冲洗、离心，沉淀，直至上清清澈为止，弃去上清，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬沉淀，获得贴壁的细胞克隆，快速扩增成为纺锤样细胞，即为原代人羊膜间充质干细胞。
进一步，步骤(2)中，所述梯度离心是指：先以300g转速4℃离心10min，再以2000g转速4℃离心10min分钟，最后以10000g转速4℃离心30min。
上述hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)来源的细胞外囊泡在制备防治病理性心肌细胞肥大药物中的应用。细胞外囊泡主要通过携带的miRNAs21-5p/128-3p/221-3p，直接靶向结合肥大的心肌细胞内的PIK3R1mRNA的3’-UTR区，抑制PI3K/Akt通路，防治血管紧张素II诱导的病理性人源心肌细胞肥大。
一种药物，其唯一活性成分为上述hAMSCs来源的细胞外囊泡，所述药物用于防治病理性心肌细胞肥大。
进一步，所述药物还包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
进一步，所述药物剂型为针剂或冻干粉。
本发明的有益效果：本发明首先分离培养了大量、高纯度及良好干细胞特性的人羊膜间充质干细胞，然后通过梯度及高速离心采集制备得到细胞外囊泡，该细胞外囊泡通过携带的miRNAs21-5p/128-3p/221-3p，直接靶向结合肥大的心肌细胞内的PIK3R1mRNA的3’-UTR区，抑制PI3K/Akt通路，防治血管紧张素II诱导的病理性人源心肌细胞肥大，为抑制甚至逆转病理性心肌细胞肥大提供了新的临床治疗方法及策略。
附图说明
图1为hAMSCs的光显微镜图(200×)；
图2为hAMSCs表面间充质干细胞标记分子的表达情况检测结果；
图3为hAMSCs表面胚胎干细胞标记分子、造血干细胞标记分子、单核细胞标记分子、B淋巴细胞标记分子以及人类白细胞抗原HLA-DR的表达情况检测结果；
图4为hAMSCs-EVs的透射电镜图；
图5为hAMSCs-EVs的Nanosight检测图；
图6为Western blot检测标志性蛋白CD63和TSG101的表达图；
图7为DiI标记的hAMSCs-EVs与心肌肥大的细胞共培养后的激光共聚焦显微镜照片；
图8为hAMSCs-EVs处理Ang II诱导的肥大心肌细胞后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图；
图9为不同处理条件下心肌细胞AC16的心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC及cTnI的mRNA和心肌特异性标志物Desmin的mRNA表达图；
图10为心肌细胞肥大相关蛋白ANP、BNP、β-MHC及Troponin I和正常心肌骨架蛋白Desmin表达的Westernblot检测结果图；
图11为基于KEGG数据库对miRNA芯片检测到的hAMSCs-EVs中的miRNAs进行生物通路富集的分析图；
图12为hAMSCs-EVs对肥大AC16心肌细胞中PI3K/Akt信号通路相关指标蛋白表达影响的Western blot检测结果图；
图13为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p与PI3K-Akt信号通路的PIK3R1基因存在结合位点的生物信息学预测分析图；
图14为未经Ang II诱导的对照组(Con)心肌细胞、经5×10-6mol/LAng II诱导的肥大心肌细胞和三个不同样本来源的hAMSCs中，hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p表达的Real time RT-PCR检测结果图；
图15为转染miRNAs mimic或miRNAs inhibitor用于高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后的Real-time RT-PCR检测结果图；
图16为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图；
图17为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，ANP mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图；
图18为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，PIK3R1mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图；
图19为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，PI3Kp85α蛋白表达的Westernblot检测结果图；
图20为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，PI3KR1mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图；
图21为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，PI3KR1编码的PI3Kp85α蛋白表达的Western blot检测结果图；
图22为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图；
图23为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，心肌肥大标志分子β-MHC mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡(hAMSCs-EVs)的制备
hAMSCs的分离培养方法：
(1)使用含双倍青链霉素的PBS缓冲液反复冲洗羊膜组织，然后将羊膜组织剪碎，按羊膜组织:消化液＝1:(1-2)的体积比加入消化液，37℃孵育7-10min，得到消化后的羊膜组织；所述消化液为含有2.4U/ml蛋白酶Dispase的PBS；
(2)将消化后的羊膜组织加入到含有10％胎牛血清的α-MEM完全培养基中，室温静置5-10min后，按羊膜组织:消化液＝1:(2-3)的体积比将羊膜组织放入消化液中，37℃下消化，得到消化后的组织液；所述消化液为含有0.75mg/ml胶原酶collagen D和5％胎牛血清的α-MEM完全培养基；
(3)将消化后的组织液离心(1500rpm离心10min)，去上清，留沉淀，反复用PBS冲洗、离心，沉淀，直至上清清澈为止，弃去上清，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬沉淀，获得贴壁的细胞克隆，快速扩增成为纺锤样细胞，即为原代人羊膜间充质干细胞。
用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基将人羊膜间充质干细胞培养于37℃、含5％CO2培养箱中，72h换一次培养基，培养3天后，hAMSCs的普通光显微镜图(200×)见图1，可以看出，分离培养hAMSCs 3天后，贴壁细胞迅速增多，可见细胞贴壁生长，呈梭形、多角形等，通过传代扩增的第2代hAMSCs呈均一的纺锤样间质细胞样表型(图1)。通过胰酶细胞消化液消化1-2min后，使用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基终止胰酶消化，1000-1200g室温离心5-10min，收集细胞沉淀，进行传代扩增，收集第3-5代人羊膜间充质干细胞。
hAMSCs的鉴定：
为了明确hAMSCs的多能性特性及其间质细胞的特征，通过流式细胞术和CellQuest software软件鉴定表面分子标志物，包括间充质干细胞标记分子CD29、CD44、CD73、CD90和CD105；胚胎干细胞标记分子SSEA-4；造血干细胞分子标记CD34和CD45；单核细胞标记分子CD14；B淋巴细胞标记分子CD79b；人类白细胞抗原HLA-DR。结果见图2-3，图2为hAMSCs表面间充质干细胞标记分子的表达情况检测结果，图3为hAMSCs表面胚胎干细胞标记分子、造血干细胞标记分子、单核细胞标记分子、B淋巴细胞标记分子以及人类白细胞抗原HLA-DR的表达情况检测结果，可以看出，第2代hAMSCs能够高表达典型的间充质干细胞标记分子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105(图2)，高表达胚胎干细胞标记分子SSEA4(图3A)，不表达造血干细胞标记分子CD34和CD45(图3B-C)，低表达单核细胞标志分子CD14(图3D)，不表达B淋巴细胞标志分子CD79b(图3E)，同时也发现hAMSCs不表达HLA-DR(图3F)，提示hAMSCs具有较低的免疫源性。这些结果说明hAMSCs具有间充质干细胞的表型特征。
hAMSCs-EVs的制备：
(1)用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基培养第3-5代人羊膜间充质干细胞，密度达到70％-80％时，弃去培养基，使用PBS洗涤细胞3-5次，换用含5％无细胞外囊泡的胎牛血清的α-MEM(不含酚红)培养液，继续培养48h后，收集细胞培养上清；
所述无细胞外囊泡的胎牛血清的制备方法：将Gibco胎牛血清以100000-120000g的转速4℃离心12h后，分为3层，轻轻吸取最上层透明层，即为无细胞外囊泡的胎牛血清；
(2)取10ml细胞培养上清，先以300g转速4℃离心10min，再以2000g转速4℃离心10min分钟，最后以10000g转速4℃离心30min，取上清，使用0.22μm孔径滤器去除细胞碎片，以100000g的转速4℃离心140min，得到的沉淀即为细胞外囊泡。使用100μl的PBS重悬，-80℃保存，备用。
hAMSCs-EVs的鉴定：
(1)透射电镜鉴定细胞外囊泡的形态及大小：取出分离纯化的hAMSCs-EVs悬浮溶液，浓度调制成500μg/ml，戊二醛固定，将10μl固定好的hAMSCs-EVs滴加在直径为2mm的载样铜网上，置于室温下1min，吸去铜网边缘的液体。在铜网上滴加3％磷钨酸溶液(PH＝6.8)，室温下染色5min，白炽灯烘干，将铜网置于透射电镜的样品室，电镜下观察细胞外囊泡的形态及大小。
hAMSCs-EVs的透射电镜图见图4，可以看出，hAMSCs产生和离心收集到的细胞外囊泡呈圆形或椭圆形的囊泡状，直径为40-300nm。
(2)通过Nanosight鉴定细胞外囊泡的体积以及浓度：将hAMSCs-EVs用PBS液稀释以达到仪器检测的最适浓度(1.0×108～2.5×109个/ml)。将稀释的hAMSCs-EVs注入到Nanosight样本分析仪样品室内，用可视型纳米颗粒分析仪Nanosight自带软件分析记录粒子的布朗运动，检测hAMSCs-EVs的浓度和颗粒大小等参数。
hAMSCs-EVs的Nanosight检测图见图5，可以看出，经可示踪纳米级颗粒的Nanosight检测观察到hAMSCs细胞外囊泡呈不规则布朗运动，平均直径在226nm，浓度为7.17×108particles/ml。
(3)通过Western blot检测标志性蛋白CD63和TSG101的表达，结果见图6。由图6可以证实，分离得到的沉淀物能够表达标志物分子CD63和TSG101。
实施例2hAMSCs-EVs经细胞间传递进入肥大心肌细胞内
使用荧光活性染料DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)标记hAMSCs-EVs，DiI是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色，将实施例1中分离提取的hAMSCs-EVs用PBS重悬，与1μM DiI染液在37℃、含5％CO2细胞培养箱中避光孵育5min后放入离心肌中，以4℃、100000g离心1h，弃掉过多的染液，用PBS冲洗3次后，PBS重悬。将DiI标记的hAMSCs-EVs与心肌肥大的细胞共培养6-8h，PBS冲洗3次后，并用麦胚凝集素(WGA)标记心肌肥大细胞的细胞膜，以WGA染色显示心肌细胞表面积，用激光共聚焦显微镜观察心肌肥大细胞中DiI的表达情况。
图7为DiI标记的hAMSCs-EVs与心肌肥大的细胞共培养后的激光共聚焦显微镜照片，可以看出心肌细胞发出红色点状荧光(图中白色三角箭头标示)。结果提示hAMSCs-EVs可通过细胞间传递的方式将内容物传递至肥大心肌细胞。
实施例3hAMSCs-EVs防治病理性心肌细胞肥大
构建心肌肥大细胞模型：为了明确构建心肌肥大细胞模型Ang II最佳处理浓度，使用5×10-7M、5×10-6M和1×10-5M血管紧张素II(Ang II)三个梯度浓度分别诱导人心肌细胞AC16肥大，通过Real-time PCR检测心肌肥大相关指标确定心肌肥大细胞模型的构建成功。图8为hAMSCs-EVs处理Ang II诱导的肥大心肌细胞后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图，结果显示，使用5×10-6MAng II处理AC16心肌细胞，与5×10-7M和1×10-5M相比，细胞肥大表型更明显，细胞表面积显著增加(图8)。图9为不同处理条件下心肌细胞AC16的心肌肥大相关指标心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的mRNA和心肌特异性标志物心肌结蛋白(Desmin)的mRNA表达图，结果显示，5×10-6MAng II处理AC16心肌细胞，与5×10-7M和1×10-5M相比，ANP、BNP、β-MHC和cTnImRNA表达水平显著升高，心肌特异性标志物Desmin无显著差异(图9)。因此，5×10-6M的Ang II是诱导AC16心肌细胞肥大最佳处理浓度。
同时，为了进一步明确hAMSCs-EVs处理心肌肥大细胞时的最佳处理浓度，根据Nanosight分析检测出hAMSCs-EVs的浓度，我们使用10μl和20μl hAMSCs-EVs处理经5×10- 6MAng II诱导的AC16心肌细胞，细胞表面积显著缩小(图8)，心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC和cTnI的mRNA表达水平显著降低，而心肌骨架蛋白Desmin的mRNA表达水平无显著差异。但是，与10μl的hAMSCs-EVs处理组相比，20μl hAMSCs-EVs处理组心肌细胞表面积和心肌肥大指标ANP和BNP的mRNA表达水平下调更显著(图9)。因此，选用20μl hAMSCs-EVs作为最佳处理浓度。上述结果提示hAMSCs-EVs对Ang II诱导的心肌细胞肥大有着显著的保护作用。
为了进一步明确hAMSCs-EVs处理对心肌细胞肥大相关蛋白表达的影响，设定如下实验：将正常心肌细胞于37℃、含5％CO2细胞培养箱进行培养，镜下观察正常心肌细胞形态为成肌细胞样，贴壁生长，细胞状态良好；吹打混匀后传代至6孔培养板，培养24h镜下观察细胞生长状态良好，随机分为对照组、模型组和hAMSCs-EVs处理组，对照组正常换液培养，模型组更换为等体积含5×10-6M的Ang II的DMEM培养基培养48-72h，hAMSCs-EVs处理组在5×10-6M的Ang II处理的同时给予20μl的hAMSCs-EVs处理，然后收集细胞。通过Westernblot进行肥大相关蛋白心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)、心肌β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌肌钙蛋白I(Troponin I)，和正常心肌骨架蛋白心肌结蛋白(Desmin)的表达水平检测。
图10为心肌细胞肥大相关蛋白ANP、BNP、β-MHC及Troponin I和正常心肌骨架蛋白Desmin表达的Western blot检测结果图，可以看出，与对照组相比，5×10-6MAng II诱导的肥大心肌细胞AC16经20μl的hAMSCs-EVs处理后，心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC和心肌肌钙蛋白I(Troponin I)的蛋白表达水平降低，而心肌骨架蛋白Desmin表达水平显著升高(图10)。该结果进一步证实hAMSCs-EVs对肥大心肌细胞的保护作用。
实施例4 hAMSCs-EVs携带的miRNAs检测及生物信息学分析
(1)筛选hAMSCs-EVs中可能与心肌细胞肥大有关的miRNAs
为了明确hAMSCs-EVs是否通过携带的miRNAs调控心肌细胞肥大相关信号通路发挥作用，首先利用miRNA芯片筛选分析hAMSCs-EVs中miRNA的表达谱，并筛选出表达水平位于前40名的miRNAs，见表1：
表1
Figure BDA0002442499070000081
Figure BDA0002442499070000091
备注：*表示生物信息学软件预测可能作用于肾上腺素能信号通路的miRNAs.NormalizedValue:归一化后的数据，即使用RPM公式(RPM＝number ofreadsmapping to miRNA/numbers ofreads in Clean data×106)校正后得到的miRNAs的表达量。
结果显示：hAMSCs-EVs中富含大量的miRNAs。
(2)生物信息学分析hAMSCs-EVs中与心肌细胞肥大有关的高表miRNAs
基于上述miRNA芯片结果，进一步利用生物信息学方法，使用miRNA靶基因预测软件(miRanda、PITA和RNAhybrid)分别对miRNAs的靶基因进行预测并统计结果。图11为基于KEGG数据库对miRNA芯片检测到的hAMSCs-EVs中的miRNAs进行生物通路富集的分析图。结果显示：心肌细胞中肾上腺素能信号(adrenergic signal in cardiomyocytes)(图11中方框框选标示)通路的基因最具有相关性。
同时，我们发现hAMSCs-EVs中表达水平位于前40名的miRNAs被发现有21种与该条生物通路有关。为了明确生物信息学分析筛选出的21种高表达miRNAs能够与心肌细胞中肾上腺素能信号通路的调控基因结合，从而抑制调控基因的表达，最终发挥防止心肌肥大的作用。我们使用targetscan7.1靶基因预测软件分析这些miRNAs基因序列与预测出的调控基因3’UTR区的互补性，筛选出8种miRNAs与KEGG数据库的生物通路富集分析的结果高度重合，这8种miRNAs与预测的靶基因存在1个及以上结合位点，因此，这些miRNAs被认为是hAMSCs-EVs最有可能发挥作用的miRNAs，包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p，见表2：
表2
Figure BDA0002442499070000101
结果提示：这8种miRNAs是hAMSCs-EVs在心肌肥大中发挥调控作用相关性最高的miRNAs。
实施例5：hAMSCs-EVs中高表达的miRNAs靶向作用于PI3K/Akt信号PIK3R1基因发挥防治心肌细胞肥大作用
(1)明确hAMSCs-EVs通过PI3K/Akt信号通路对心肌肥大发挥调控作用
为了明确hAMSCs-EVs是否通过调控PI3K/Akt信号通路在心肌细胞肥大中发挥抑制作用，我们通过Western blot检测了20μl hAMSCs-EVs处理经5×10-6mol/LAng II诱导的肥大AC16心肌细胞后，细胞中PI3K/Akt信号通路相关指标蛋白表达的变化。结果见图12，hAMSCs-EVs对肥大AC16心肌细胞中PI3K/Akt信号通路相关指标蛋白表达影响的Westernblot检测结果图。
由图12可以看出：与对照组相比，经5×10-6mol/LAng II诱导的肥大心肌细胞经20μl hAMSCs-EVs处理后，心肌细胞中PI3K/Akt信号通路相关指标PI3Kp85α和p-Akt表达水平显著降低，这说明hAMSCs-EVs通过抑制PI3K/Akt信号通路来防治Ang II诱导的病理性心肌细胞肥大。
(2)明确hAMSCs-EVs中高表达的三个miRNAs抑制PI3K/Akt信号通路防治心肌细胞肥大
对靶基因预测软件分析结果进行综合性分析，发现hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p与心肌肥大相关的PI3K/Akt信号通路的靶基因存在结合位点，分析结果见图13，为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p与PI3K-Akt信号通路的PIK3R1基因存在结合位点的生物信息学预测分析图。为了进一步明确hAMSCs-EVs在防止心肌细胞肥大中发挥主要调控作用的miRNAs,通过Realtime RT-PCR检测分析了在未经Ang II诱导的对照组(Con)心肌AC16细胞、经5×10-6mol/LAng II诱导的肥大心肌细胞和三个不同样本来源的hAMSCs中，与PI3K-Akt信号通路的靶基因存在结合位点的上述四种miRNAs的表达差异，结果见图14。
由图14可以看出，与正常心肌细胞相比，经5×10-6mol/LAng II诱导后，hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p表达水平均显著下调；同时，在三个不同来源的hAMSCs中，除hsa-miR-10a-5p的表达差异相对不明显外，其他3种miRNAs的表达水平均显著高于Ang II处理组。
我们分别构建合成了miRNAs mimic或miRNAs inhibitor用于高表达或低表达这三种miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p)，并通过Real-time RT-PCR进行了验证，结果见图15，为转染miRNAs mimic或miRNAs inhibitor用于高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后的Real-time RT-PCR检测结果图，结果显示转染后可以有效高表达或低表达上述三种miRNAs。
图16为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图；图17为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，ANP mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图。在Ang II诱导的肥大心肌细胞中，分别转染miRNAs mimic高表达上述三种miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p)后，心肌细胞表面积(图16)、ANP mRNA表达(图17)明显减少；反之，转染miRNAs inhibitor低表达这三种miRNAs后，心肌细胞表面积(图16)、ANPmRNA表达(图17)明显增加。这些结果说明：hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p是hAMSCs-EVs防治心肌细胞肥大的主要miRNAs。hAMSCs-EVs通过hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p靶向调控PI3K/Akt信号通路，从而防止心肌细胞肥大。
(3)hAMSCs-EVs中高表达的三个miRNAs通过靶向抑制PIK3R1基因及其编码的PI3Kp85α蛋白介导的病理性心肌细胞肥大
通过分析生物学信息软件预测结果发现上述3种miRNAs均与PI3K-Akt信号通路的PIK3R1基因存在结合位点(图13)。图18为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，PIK3R1mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图；图19为高表达或低表达hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p后，PI3Kp85α蛋白表达的Western blot检测结果图。结果显示：在Ang II诱导的肥大心肌细胞中，分别转染miRNAsmimic高表达上述三种miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p)后，PIK3R1mRNA(图18)和PI3Kp85α蛋白(图19)表达明显减少；反之，转染miRNAs inhibitor低表达这三种miRNAs后，PIK3R1mRNA(图18)和PI3Kp85α蛋白(图19)表达明显增加。因此，hAMSCs-EVs中高表达的三个miRNAs能靶向抑制PIK3R1基因表达，进而下调PIK3R1基因编码的PI3Kp85α蛋白表达。
为了明确PI3KR1和其编码的PI3Kp85α蛋白介导了Ang II诱导的病理性心肌细胞肥大，我们进一步通过构建合成PI3KR1 siRNA，转染Ang II诱导的肥大心肌细胞AC16后，分别通过Real-time RT-PCR和Western blot检测了PI3KR1的mRNA表达和PI3Kp85α蛋白表达。图20为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，PI3KR1mRNA表达的Real-timeRT-PCR检测结果图；图21为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，PI3KR1编码的PI3Kp85α蛋白表达的Western blot检测结果图。结果显示：与阴性对照组相比，PI3KR1siRNA能明显下调PI3KR1的mRNA表达(图20)和PI3KR1编码的PI3Kp85α蛋白表达(图21)。图22为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，通过麦胚凝集素(WGA)标记心肌细胞膜，激光共聚焦显微镜观察细胞表面积的变化图；图23为PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，心肌肥大标志分子β-MHC mRNA表达的Real-time RT-PCR检测结果图。结果显示：PI3KR1 siRNA转染Ang II诱导的肥大心肌细胞后，心肌细胞表面积(图22)和β-MHC mRNA表达(图23)明显减少。因此，PI3KR1和其编码的PI3Kp85α蛋白介导了Ang II诱导的病理性心肌细胞肥大。

Claims (8)

1.一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，其特征在于，直径为40-300nm，所述细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：
(1)分离培养获得人羊膜间充质干细胞后，培养并进行传代扩增，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基培养第3-5代人羊膜间充质干细胞，密度达到70％-80％时，弃去培养基，使用PBS洗涤细胞3-5次，换用含5％无细胞外囊泡的胎牛血清的α-MEM(不含酚红)培养液，继续培养48h后，收集细胞培养上清；
(2)取10ml细胞培养上清，梯度离心后取上清，通过0.22μm孔径滤器过滤去除细胞碎片，以100000g的转速4℃离心100-150min，得到的沉淀即为细胞外囊泡；
步骤(1)中，所述无细胞外囊泡的胎牛血清的制备方法：将Gibco胎牛血清以100000-120000g的转速4℃离心12h后，分为3层，轻轻吸取最上层透明层，即为无细胞外囊泡的胎牛血清。
2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，其特征在于，步骤(1)中，所述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法包括如下步骤：
1)使用含双倍青链霉素的PBS缓冲液反复冲洗羊膜组织，然后将羊膜组织剪碎，按羊膜组织:消化液＝1:(1-2)的体积比加入消化液，37℃孵育7-10min，得到消化后的羊膜组织；所述消化液为含有2.4U/ml蛋白酶Dispase的1x磷酸盐缓冲液；
2)将消化后的羊膜组织加入到含有10％胎牛血清的α-MEM完全培养基中，室温静置5-10min后，按羊膜组织:消化液＝1:(2-3)的体积比将羊膜组织放入消化液中，37℃下消化，得到消化后的组织液；所述消化液为含有0.75mg/ml胶原酶collagenD和5％胎牛血清的α-MEM完全培养基；
3)将消化后的组织液离心，去上清，留沉淀，反复用PBS冲洗、离心，沉淀，直至上清清澈为止，弃去上清，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬沉淀，获得贴壁的细胞克隆，快速扩增成为纺锤样细胞，即为原代人羊膜间充质干细胞。
3.如权利要求1或2所述的人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度离心为：先以300g转速4℃离心10min，再以2000g转速4℃离心10min分钟，最后以10000g转速4℃离心30min。
4.权利要求1或2或3所述人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡在制备防治病理性心肌细胞肥大药物中的应用。
5.一种药物，其特征在于，其唯一活性成分为权利要求1或2或3所述人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡，所述药物用于防治病理性心肌细胞肥大。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
8.如权利要求5或6或7所述的药物，其特征在于，所述药物剂型为针剂或冻干粉。
CN202010269310.9A 2020-04-08 2020-04-08 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用 Active CN111394305B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010269310.9A CN111394305B (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010269310.9A CN111394305B (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111394305A true CN111394305A (zh) 2020-07-10
CN111394305B CN111394305B (zh) 2022-03-11

Family

ID=71436863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010269310.9A Active CN111394305B (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111394305B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112641955A (zh) * 2021-01-18 2021-04-13 四川大学 人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109880797A (zh) * 2019-04-08 2019-06-14 济南磐升生物技术有限公司 一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法
CN110904037A (zh) * 2019-11-28 2020-03-24 南京医科大学附属口腔医院 一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109880797A (zh) * 2019-04-08 2019-06-14 济南磐升生物技术有限公司 一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法
CN110904037A (zh) * 2019-11-28 2020-03-24 南京医科大学附属口腔医院 一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
苏亚洲等: "外泌体在心肌疾病中的研究新进展", 《世界最新医学信息文摘》 *
黄宁等: "外泌体与心血管疾病研究进展", 《中南医学科学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112641955A (zh) * 2021-01-18 2021-04-13 四川大学 人间充质干细胞小囊泡作为靶向递药平台的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111394305B (zh) 2022-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Coura et al. Human periodontal ligament: a niche of neural crest stem cells
CN108359636B (zh) 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法
CN103930542A (zh) 棕色脂肪细胞组合物及方法
CN111484969B (zh) 毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途
CN113969304A (zh) 细胞外囊泡在制备治疗或预防代谢性炎症综合征疾病的制剂中的应用
CN111621475A (zh) 脐带间充质干细胞膜片及其制备方法
CN109750068A (zh) 一种使外泌体携带外源microRNA的方法
CN111394305B (zh) 一种人羊膜间充质干细胞来源的细胞外囊泡及其应用
Rutering et al. Improved method for isolation of neonatal rat cardiomyocytes with increased yield of C-Kit+ cardiac progenitor cells
KR20160108925A (ko) 배아줄기세포에서 유래한 인공 나노베시클을 이용하여 세포 증식을 향상시키는 방법
Chai et al. Dedifferentiation of human adipocytes after fat transplantation
CN110121555B (zh) 包含工程化内皮细胞的血脑屏障
CN112251411A (zh) 一种miR-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用
CN106148277B (zh) 一种适用于干细胞的线粒体分离方法
CN112553289A (zh) 一种评价car-t细胞有效性的方法
CN110499279B (zh) 一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法
KR101223396B1 (ko) 배아줄기세포의 추출물을 이용한 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포
CN113801843B (zh) 一种增强人尿源性干细胞干性的方法
CN101074428B (zh) 一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法
CN115948330A (zh) 适合骨髓间充质干细胞增殖的无血清培养基及应用
CN115607689A (zh) Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用
CN115029305A (zh) 猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途
CN111944751B (zh) 一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用
CN108823149B (zh) 一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法
CN103173405B (zh) 一种人胎盘成肌纤维母细胞的简易分离及鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 210029 No. 140, Hanzhoung Road, Gulou District, Jiangsu, Nanjing

Applicant after: NANJING MEDICAL University

Address before: 211166 No. 101 Longmian Avenue, Jiangning District, Nanjing City, Jiangsu Province

Applicant before: NANJING MEDICAL University

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant