CN109750068A - 一种使外泌体携带外源microRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使外泌体携带外源microRNA的方法，包括以下步骤：将外源microRNA转染入外泌体内，然后用vivaspin 50,000D进行离心。本发明具有以下优点：以往转染的方法只用于转染细胞，本发明是转染外泌体。本发明将vivaspin用来浓缩转染后的外泌体，并去除游离的未转染入外泌体中的micro RNA以及转染试剂。外源的micro RNA必须进入外泌体中，被外泌体包裹，才会被输送到特定位置，而不会被提前降解。本发明操作方法简便，可导入多种micro RNA，导入效率高，可用于临床。

Description

一种使外泌体携带外源microRNA的方法

技术领域

本发明涉及一种使外泌体携带外源microRNA的方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是由多种细胞都可分泌的带有膜状结构的一种囊泡。该囊泡内包含有来源细胞的细胞质以及细胞膜的许多蛋白，细胞因子，以及DNA和RNA等遗传物质。近几年研究表明细胞外囊泡是细胞间通讯的一种新型的工具和方式，细胞内的许多分泌蛋白，细胞因子，以及DNA和RNA等遗传物质都可以通过细胞外囊泡以外泌的方式传递给邻近或远处的细胞，从而参与调节许多生物进程。因此，细胞外囊泡介导的细胞与细胞间的通讯在生物体内的许多环节中都发挥了非常重要的作用，例如在肿瘤的发展环节中如组织浸润，免疫逃避，血管生成以及远处转移，都发挥了重要作用。

细胞外囊泡主要由微泡(Microvesicles)、癌泡(Oncosome)和外泌体(Exosomes)组成。Exosomes是体积最小的一种细胞外囊泡，由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm-100nm，外泌体的常用标记蛋白分子为CD63,CD81，Alix and Tsg101。外泌体可被受体细胞摄取，或与受体细胞膜融合，从而进入受体细胞。外泌体中包含多种蛋白，脂肪分子，DNA，以及各种类型的RNA，如mRNA,长链非编码RNA(lnc RNA),miRNA，核糖体RNA等，从而能够诱导受体细胞的重新转录和翻译。通过分析高转移性肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡的基因表达谱，发现其中富含多种与肿瘤迁移和侵袭相关的基因及其mRNA，这些基因涉及到细胞运动、迁移、粘附和创伤应答等多个方面。

肿瘤细胞分泌的Exosomes还可以调节基质成分之间的相互作用，促进受体细胞的基因稳定性，诱导恶性转化，可以诱导成纤维细胞的形态和功能改变，使其分化成为癌相关成纤维细胞，从而导致基质重构，为肿瘤的侵袭和转移奠定基础。肿瘤细胞分泌的Exosomes中同时携带有肿瘤抗原，可触发树突状细胞介导的免疫应答，从而改善肿瘤的微环境。另外，目前的研究表明许多类型的细胞在培养过程中都分泌Exosomes，而且在多种类型的体液，如外周血液，唾液，尿液，胆汁，腹水，乳液和脑脊液中也都存在Exosomes。Exosomes中存在的蛋白和RNA由于有膜的包裹，不会被轻易降解，大部分游离的miRNA都存在于Exosomes中，而且Exosomes具有很好的稳定性，生命周期长。因此近年来，体液中Exosomes的表达和变化已经成为研究的热点，可用于肿瘤的早期诊断，治疗监控的指标以及预后的监测。Exosomes还可用作药物的载体，将特异性的药物传递至相应的靶点。因此，Exosomes的研究具有切实而重大的临床意义。

外泌体(Exosomes)是从细胞释放的膜包被的纳米囊泡，由于可在细胞之间转运分子信号而在细胞通讯中发挥重要作用，参与许多生物和病理过程。研究已经表明在细胞外囊泡中有大量的RNA分子存在，包括mRNA,miRNA,核糖体RNA(rRNA),转运RNA(tRNA),长链非编码RNA(LncRNA),piwi相互作用RNA(piRNA),小核RNA以及小核仁RNA(snoRNA)。其中，miRNA是Exosomes中表达最丰富的一种RNA分子。miRNA由于被包裹在Exosomes膜的结构中能够自我保护而不被RNA酶降解。研究表明由Exosomes作为中介转运miRNA可以通过直接释放到受体细胞或是受体细胞摄入Exosomes后诱发相应信号通路导致转录后的表达上调或下调，改变受体细胞的相应miRNA的表达水平，从而改变受体细胞的表型。许多肿瘤中有多种miRNA表达明显下降，使其相应miRNA表达上调可以起到抑制肿瘤的作用。因此，可以利用Exosome作为载体，给外泌体加载外源的能够治疗肿瘤的micro RNA，利用外泌体包裹不会导致micro RNA降解的优势，发挥其治疗肿瘤的作用。

现有技术中采用的外泌体加载micro RNA的方法为：

1、直接将相应的micro RNA加入提取好的外泌体中，由于micro RNA的片断较小(20kb左右)依靠外泌体自身的容纳作用将其纳入。缺点：导入效率较低。

2、先将相应的micro RNA通过转染的方式导入细胞中，再从细胞培养液中提取外泌体。缺点：转染后的细胞受损，大量细胞死亡，活细胞数量显著下降，产生外泌体的量大大降低。另外，如今后用于临床，手续繁琐，成本高，效价低。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种方法，本发明利用从正常细胞中提取好的大量外泌体，用转染的方式直接将外源micro RNA转染入外泌体中，然后用vivaspin 50,000D通过离心的方法，使导入外泌体中的外源micro RNA浓缩，同时又能去除未被转染入外泌体的游离micro RNA。该方法既可高效地导入高浓度的外源micro RNA，又操作简便，得到的携带有外源micro RNA的外泌体可直接用来瘤内注射等。

本发明提供一种使外泌体携带外源microRNA的方法，包括以下步骤：将外源microRNA转染入外泌体内，然后用vivaspin 50,000D进行离心。

作为优选，所述离心是1000-2000g离心5min。

作为优选，所述外泌体的提取方法为：收集细胞培养液，先依次用300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g离心30min)，均保留上清，接着用超速离心机100000×g离心70min，保留沉淀。

作为优选，所述转染的方法为：将外泌体、microRNA和RNA iMAX转染试剂按照一定比例分别稀释，静置后将稀释后的microRNA和RNA iMAX转染试剂混合静置，最后将混合物加入稀释的外泌体中静置。

作为优选，所述转染时，外泌体、microRNA和RNA iMAX转染试剂的比例为：30μg：2μl：1μl。

作为优选，将混合物加入稀释的外泌体中静置时，是在室温下静置6小时。

本发明还提供一种携带外源microRNA的外泌体，是应用上述的方法得到的。

本发明还提供上述携带外源microRNA的外泌体的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的，所述应用为通过携带外源microRNA的外泌体直接释放到受体细胞或受体细胞摄入携带外源microRNA的外泌体后，改变受体细胞相应miRNA的表达水平。

本发明利用从细胞中提取好的大量外泌体，用转染的方式直接将外源micro RNA转染入外泌体中，然后用vivaspin 50,000D通过离心的方法，使外泌体中的外源micro RNA浓缩，并去除未被转染入外泌体的游离micro RNA。这种方法既可高效地导入高浓度的外源micro RNA，又操作简便，得到的携带有外源micro RNA的外体泌体可直接用来瘤内注射等。

相对于现有技术中的方法，本发明具有以下优点：

1.以往转染的方法只用于转染细胞，本发明是转染外泌体。

2.本发明将vivaspin用来浓缩转染后的外泌体，并去除游离的未转染入外泌体中的micro RNA以及转染试剂。

3.外源的micro RNA必须进入外泌体中，被外泌体包裹，才会被输送到特定位置，而不会被提前降解。本发明操作方法简便，可导入多种micro RNA，导入效率高，可用于临床。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为使用转染试剂以及vivaspin和不用转染试剂的转染效果对比图。

图2为使用vivaspin以及不使用vivaspin时获得的micro RNA的量的对比图。

图3为转染micro RNA-335至外泌体(exosome)中，与转染PBS(没有外泌体)相比，进入外泌体中micro RNA-335的量的对比图。

图4为以注射转染NSM为对照，注射了转染micro RNA-335-5p的外泌体后，动物瘤组织内的miR-335-5p的表达量对比图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

以下以间充质干细胞来源的外泌体中导入外源miR-335-5p为例来说明本发明的方法：

1.细胞培养液中外泌体的提取：

收集细胞培养液，先依次用300×g(10min)、2000×g(10min)、10000×g(30min)离心，目的是去除大的细胞以及细胞死亡碎片，因此这几步均保留上清，弃沉淀。接着用超速离心机100000×g(70min)离心，弃上清，保留沉淀，-80℃保存，即为Exosomes。可用于下一步的实验。

2.外泌体的定量

用BCA试剂盒按照常规定量蛋白质的方法对提取的外泌体进行定量。

3.外泌体中micro RNA的转染

所用的micro RNA mimic或micro RNA对照NSM分别是：hsa-miR-335-5p,miRNA mimic(Life Techologies Corporation,ThermoFisher,USA),序列为:UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU；对照NSM：mir Vana miRNA mimic negative control(LifeTechologies Corporation,ThermoFisher,USA)。

去血清培养基Opti-MEM^TM的购买厂家为：Gibco公司。

将定量好的外泌体(30μg)加入六孔板中，加入250μl去血清培养基(optimalmedium)稀释。用两个1.5ml Enpendrof管，其中一个加入2μl micro RNA mimic或NSM，用25μl去血清培养基稀释，另一个加入1μl RNA iMAX转染试剂(Lipofectamin RNAiMAXReagent,Life technologies)，也用25μl去血清培养基稀释，各室温下静置5分钟。5分钟后将两者混合起来，室温静置15分钟。最后将两者混合物加入稀释好的外泌体六孔板中，放入培养箱中室温下静置6小时。

4.micro RNA的浓缩及去除多余的未转染入的miR/siRNA

由于经过转染后，仍然会有一部分micro RNA并没有进入外泌体，而是处于游离状态。游离的micro RNA进入体会很快被降解而无法发挥功能作用。因此，我们想到利用vivaspin装置来浓缩转染了micro RNA的外泌体，也可同时去除游离的micro RNA。由于micro RNA的分子量约为15KD，因此我们选用50,000D的vivaspin(GE company)。

具体操作如下：将转染完毕的外泌体全部导入vivaspin中，在离心机上1500g离心5min，收集管中的浓缩部分。即可用于下一步的应用。

5.外泌体中miR的鉴定

为了鉴定外源的micro RNA是否导入了外泌体，以及导入的量，同时为了对比使用vivaspin浓缩装置前后外源micro RNA的量。我们使用Taqman microRNA ReverseTranscription Kit，用qPCR的方法进行鉴定。

如图1，我们对比了转染试剂以及vivaspin和不用转染试剂后，给相同量外泌体中导入同等micro RNA-335-5p，外泌体中micro RNA的量，发现用了转染试剂后与不用转染试剂的相差170倍。说明用了转染法能够使外源micro RNA大量进入外泌体中，而不用转染法，外源micro RNA没有进入外泌体中，经过vivaspin离心后就被清除了。

如图2，我们对比了转染后，用了vivaspin以及没有用vivaspin后micro RNA的量。发现用了vivaspin离心后，外泌体中micro RNA的量减少了一些，约为未使用vivaspin的82％。而残留的液体中仍存在游离的micro RNA，约为18％。说明用vivaspin离心可以去除未转染入外泌体中的游离micro RNA。

图1为使用转染试剂以及vivaspin和不用转染试剂的转染效果对比图。

图2为使用vivaspin以及不使用vivaspin时获得的micro RNA的量的对比图。

对比实验：

用本发明方法，以给外泌体转染micro RNA-335为例，以同样的micro RNA转染PBS为对照，说明本发明方法的可行性。具体实施方式过程同实施例1。

实验结果如图3所示，用本发明方法转染micro RNA-335至外泌体中，与转染PBS(没有外泌体)相比，进入外泌体中的micro RNA-335多达6550倍。一方面说明该技术的可行性，可以高效转入高浓度外源micro RNA；另一方面说明未转染入外泌体的外源micro RNA很快会被降解。

图3为转染micro RNA-335至外泌体(exosome)中，与转染PBS(没有外泌体)相比，进入外泌体中micro RNA-335的量的对比图。

应用实施例

首先建立免疫缺陷动物的皮下移植瘤模型(在小鼠的皮下注射1×10⁶肿瘤细胞，使小鼠荷瘤)。然后，我们将应用本发明方法转染了micro RNA-335的外泌体(50μg)注射入小鼠瘤组织内，一周三次，共四周后，处死动物，取瘤组织，提取RNA，用qPCR进行miR-335-5p的鉴定。结果如图4。

图4为以注射转染NSM为对照，注射了转染micro RNA-335-5p的外泌体后，动物瘤组织内的miR-335-5p的表达量对比图。

以注射转染NSM为对照，注射了转染micro RNA-335-5p的外泌体后，动物瘤组织内的miR-335-5p的表达(Exo-miR-335)明显高于对照组(Exo-NSM)。说明用本发明方法转染了外源micro RNA的外泌体可用于动物体内注射，且外泌体中包裹的外源micro RNA可以被动物组织吸收利用，从而发挥功能。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种使外泌体携带外源microRNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：将外源microRNA转染入外泌体内，然后用vivaspin 50,000D进行离心。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心是1000-2000g离心5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外泌体的提取方法为：收集细胞培养液，先依次用300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g离心30min，均保留上清，接着用超速离心机100000×g离心70min，保留沉淀。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染的方法为：将外泌体、microRNA和RNA iMAX转染试剂按照一定比例分别稀释，静置后将稀释后的microRNA和RNA iMAX转染试剂混合静置，最后将混合物加入稀释的外泌体中静置。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染时，外泌体、microRNA和RNA iMAX转染试剂的比例为：30μg：2μl：1μl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将混合物加入稀释的外泌体中静置时，是在室温下静置6小时。

7.一种携带外源microRNA的外泌体，是应用权利要求1-6任一项所述的方法得到的。

8.权利要求7所述的携带外源microRNA的外泌体的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的，所述应用为通过携带外源microRNA的外泌体直接释放到受体细胞或受体细胞摄入携带外源microRNA的外泌体后，改变受体细胞相应miRNA的表达水平。