CN104726459B - 一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药基因工程领域，特别涉及一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其载体和应用。一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，以如SEQ ID NO.1所示的正义链和如SEQ ID NO.2所示的反义链设计得到；或以如SEQ ID NO.3所示的正义链和如SEQ ID NO.4所示的反义链设计得到。本发明提供的DNA序列，是在IER5基因全序列的基因编码区中寻找靶序列，利用在线siRNA设计软件，参考小干扰RNA设计原则，从众多序列中筛选得到的两对靶序列，由这两对靶序列设计的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列插入载体稳定，沉默IER5基因效果好。

Description

一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其载体和应用

技术领域

本发明涉及医药基因工程领域，具体而言，一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其载体和应用。

背景技术

小干扰RNA(short/small interferencing RNA,siRNA)能引发机体组织细胞功能的变化，一个分子可以诱发数十甚至数百个靶mRNA个体分子的降解[Tononi G,CirelliC.Modulation of brain gene expression during sleep and wakefulness:a reviewof recent findings[J].Neuropsychopharmacology 2001,25(5Suppl):S28-35.]。小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA,shRNA)是一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。作为一种成熟的分子生物学技术，主要是使特定基因功能丧失从而确定该基因的功能，其原理是将外源性双链RNA(double strain RNA,dsRNA)导入生物体的细胞中，使得与dsRNA同源的mRNA在翻译之前即快速降解，从而其相应的靶基因表达受到抑制。RNA干扰的基本过程是将外源性基因(病毒基因、人工转入基因、转座子等)随机整合到宿主细胞基因组内，利用宿主细胞进行转录，产生与外源基因互补的dsRNA，随后被类似于核糖核酸酶III的Dicer酶切割成短的21～23nt的双链siRNA。siRNA被解链为正义链和反义链后，其中反义链与核酸内外切酶、解旋酶和其他因子结合，共同构成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA，使转录的基因表达终止。每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶，因此，siRNA的反义链作为引物，以宿主细胞中序列同源互补的mRNA为靶点，在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形成新的dsRNA，重复上述过程从而形成大量的siRNA，通过促使特定基因的mRNA降解，在短时间内来高效、特异地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽，从而阻断体内特定基因表达，诱发细胞呈现出特定基因表达降低表型。RNA干扰技术以特异性强、效率高等特点被广泛应用于基因沉默领域，由于其可以阻断或抑制特定基因表达，从而成为基因治疗的新手段。

基因治疗作为治疗恶性肿瘤的一大热门研究领域，细胞、组织的生物学功能是由基因调控的，国内外多位学者通过基因芯片技术等发现多种组织细胞经辐射后，其IER5基因的转录或翻译成倍增加[Kis E,Szatm á ri T,S á fr á ny G,et al.Microarrayanalysis of radiation response genes in primary human fibroblasts[J].Int JRadiat Oncol Biol Phys.2006Dec 1；66(5):1506-14.]，可见该基因与细胞辐射后的生物学改变密切相关。IER5基因是早期反应家族中的一员，人IER5基因在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因库中编号为NM_016545.4，全长2350bp，主要参与对外界刺激的快速应答及细胞周期的调节等[WilliamsM,Lyu MS,Hunter K,et al.Ier5,a novel member of the slow-kinetics Immediate-Early Genes[J].Genomics,1999 Feb1；55(3):327-34.]。如何通过该基因与放射生物学效应的关系，并摸清它是通过哪些信号传导途径发挥作用，从而引起肿瘤细胞凋亡，把宫颈癌的放射治疗提升到一个新的层次。

申请号为200810057735.2公开了编码IER5的siRNA的DNA序列及其载体，但其使用的质粒载体较旧，重复性差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，所述的DNA序列插入载体稳定，沉默IER5基因效果好。

本发明的第二目的在于提供一种含有所述DNA序列的载体。

本发明的第三目的在于提供DNA序列及其含有该序列的载体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO.1所示的正义链和如SEQ ID NO.2所示的反义链设计得到。

一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO.3所示的正义链和如SEQ ID NO.4所示的反义链设计得到。

本发明提供的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，是在IER5基因全序列的基因编码区(Coding Sequence，CDS)中寻找靶序列，利用在线siRNA设计软件(WhiteHead)，参考小干扰RNA设计原则，进行初步设计挑选，从众多序列中筛选得到的两对靶序列，由这两对靶序列设计的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列插入载体稳定，沉默IER5基因效果好。

其中，上述靶序列，根据以下原则设计：

①GC含量在30-52％；

②第19个碱基不能为G或C；

③正义链5’端第1-4个碱基GC多，第15-19个碱基GC少；

④第1个碱基为G或C；

⑤第3个碱基为A，第10个碱基为U，第13个碱基不能为G，第16个碱基为C；

⑥3’端以UU结尾。

优选地，所述正义链与所述反义链之间的茎环序列如SEQ ID NO.5所示。得到的DNA序列导入细胞中，编码的shRNA序列被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RISC)，该复合物结合到目的mRNAs，使mRNA迅速、高效降解。

为了将编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列与载体连接，以导入细胞发挥作用，优选地，所述DNA序列的一端添加有BamH1酶切位点，另一端添加有HindIII酶切位点。

优选地，所述DNA序列的正义链如SEQ ID NO.6所示，反义链如SEQ ID NO.7所示。该DNA序列根据SEQ ID NO.1所示的正义链和如SEQ ID NO.2所示的反义链设计得到。

优选地，所述DNA序列的正义链如SEQ ID NO.8所示，反义链如SEQ ID NO.9所示。该DNA序列根据SEQ ID NO.3所示的正义链和如SEQ ID NO.4所示的反义链设计得到。

经过筛选，得到两对DNA序列，其中一对如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，另一对如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，这两对DNA序列经多方面验证具有更好的沉默效果。

本发明还提供了含有所述的DNA序列的载体。

优选地，构建所述载体的质粒为pSilencer4.1-CMV。

本发明还提供了所述的DNA序列在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

本发明还提供了所述的载体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了两对能有效抑制IER5基因的表达的DNA序列；

(2)本发明构建了能稳定表达含有编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列的载体；

(3)SiHa细胞为宫颈鳞癌细胞，该病理类型在临床中最为常见。本发明成功转染SiHa细胞，并抑制了SiHa细胞的中IER5基因的表达，对于宫颈癌的治疗具有重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列的设计原则示意图；

图2为本发明实施例1中DNA序列插入到pSilencer4.1-CMV质粒中的示意图；

图3为本发明实施例2中Western Blotting检测图；

图4为本发明实施例3中Western Blotting检测图；

图5为本发明实施例3中对Western Blotting图进行灰度分析的柱形图；

图6为本发明实施例4中实时定量PCR反应的扩增曲线图；

图7为本发明实施例4中实时定量PCR反应的溶解曲线图；

图8为本发明实施例4中Real-Time PCR检测mRNA含量的柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

1.1shRNA的设计

根据pSilencer 4.1-CMV(市售质粒)的多克隆位点，结合IER5基因全序列，在IER5基因的编码区(Coding Sequence，CDS)中寻找靶序列，利用在线siRNA设计软件(WhiteHead)，参考小干扰RNA设计原则，进行初步设计挑选，并与NCBI genebank中进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对，去除与其他物种基因片段同源性高的序列；并查找相关文献总结了以下几点设计原则，这样设计出来的成功率高。具体设计原则如下：

①GC含量在30-52％；

②第19个碱基不能为G或C；

③正义链5’端第1-4个碱基GC多，第15-19个碱基GC少；

④第1个碱基为G或C；

⑤第3个碱基为A，第10个碱基为U，第13个碱基不能为G，第16个碱基为C；

⑥3’端以UU结尾。

最终设计出4组shRNA的两个短反向重复序列及一组阴性对照。具体如下所示：

shRNA靶序列1：

正义链5’-CTGGGCAAGATCTACAACTCG-3’

反义链3’-GACCCGTTCTAGATGTTGAGC-5’

shRNA靶序列2：

正义链5’-GCTAACCTCATCAGCATCTTC-3’

反义链3’-CGATTGGAGTAGTCGTAGAAG-5’

shRNA靶序列3：

正义链5’-CGCACAGGATTTCCTAAGACG-3’

反义链3’-GCGTGTCCTAAAGGATTCTGC-5’

shRNA靶序列4：

正义链5’-GCATCAAGCTGCATAAGAACC-3’

反义链3’-CGTAGTTCGACGTATTCTTGG-5’

阴性对照：

正义链5’-GTCACCATTCCAAGCACTTCT-3’

反义链3’-CAGTGGTAAGGTTCGTGAAGA-5’

编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列的设计原则如图1所示。从图1可以看出，发卡小干扰RNA(shRNA)两端由反向互补的基因序列组成；根据IER5基因序列设计出的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，中间编码颈环的基因序列，两端为内切酶末端。其中，编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列中的编码颈环的部分基因序列为：

5’-TTCAAGAGA-3’

3’-AAGTTCTCT-5’。

本发明以pSilencer4.1-CMV质粒作为载体，利用了pSilencer4.1-CMV质粒中的多克隆位点上的HindIII和BamH1这2种限制性内切酶，DNA序列插入到pSilencer4.1-CMV质粒中的图谱如图2所示。该质粒转化细菌扩大培养时为氨苄抗性，筛选细胞时含潮霉素抗性。

其中，BamH1序列为：

5’-GATCC

3’-G；

HindIII序列为：

A-3’

TTCGA-5’

1.2编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列的合成

根据靶序列的两个短反向重复序列以及两端的酶切位点以及中间的颈环序列，设计出编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列：

DNA序列1

正义链：

5’-GATCCGGGCAAGATCTACAACTCGTTCAAGAGACGAGTTGTAGATCTTGCCCAGA-3’；

反义链：

3’-GCCCGTTCTAGATGTTGAGCAAGTTCTCTGCTCAACATCTAGAACGGGTCTTCGA-5’。

DNA序列2

正义链：

5’-GATCCTAACCTCATCAGCATCTTCTTCAAGAGAGAAGATGCTGATGAGGTTAGCA-3’；

反义链：

3’-GATTGGAGTAGTCGTAGAAGAAGTTCTCTCTTCTACGACTACTCCAATCGTTCGA-5’。

DNA序列3

正义链：

5’-GATCCCACAGGATTTCCTAAGACGTTCAAGAGACGTCTTAGGAAATCCTGTGCGA-3’；

反义链：

3’-GGTGTCCTAAAGGATTCTGCAAGTTCTCTGCAGAATCCTTTAGGACACGCTTCGA-5’。

DNA序列4

正义链：

5’-GATCCATCAAGCTGCATAAGAACCTTCAAGAGAGGTTCTTATGCAGCTTGATGCA-3’；

反义链：

3’-GTAGTTCGACGTATTCTTGGAAGTTCTCTCCAAGAATACGTCGAACTACGTTCGA-5’。

阴性对照

正义链：

5’-GATCCCACCATTCCAAGCACTTCTTTCAAGAGAAGAAGTGCTTGGAATGGTGACA-3’；

反义链：

3’-GGTGGTAAGGTTCGTGAAGAAAGTTCTCTTCTTCACGAACCTTACCACTGTTCGA-5’。

上述四组DNA序列均由公司合成，呈粉末状，分别加适量去核酸酶的水(nuclease-free water)稀释，并使用紫外分光光度计测DNA浓度，均稀释至浓度为1μg/μl。并按以下量以及程序进行退火反应：

退火体系：

正义链 2μl

反义链 2μl

1×DNA Annealing Solution 补足至50μl

反应条件：90℃，3min，然后在37℃孵箱孵育1小时，即得退火产物，用去核酸酶的水将退火产物稀释至浓度为8ng/μl，备用。

1.3酶切载体的获得

1.3.1酶切载体体系及反应条件

反应体系：

反应条件：37℃酶切过夜。

注意：构建酶切反应体系时，液体均由量多的至量少的依次加入PCR管，且内切酶均需最后加入。

1.3.2琼脂糖凝胶电泳

(1)配胶：根据DNA分子量选择琼脂糖凝胶的浓度，pSilencer4.1-CMV质粒分子量约5000bp，故选用1％琼脂糖凝胶，即0.5g固体琼脂粉+50ml 1×TAE；

(2)加热凝胶溶液约2min，使之沸腾，变清亮透明，为使琼脂粉充分溶解，可加热两次，电泳效果较好，拖尾少；

(3)待凝胶溶液冷却后(60℃左右)，加入3μl EB混匀；

(4)在凝胶板上插好梳子，灌胶；

(5)约半小时凝胶凝固后，放入电泳槽，倒入1×TAE，液面超过凝胶表面；

(6)上样，BM5000DNA Marker 5ul，酶切后的质粒加入10μl 6×loading buffer混匀，每孔上样20μl；

(7)电泳120V，15-20min；

(8)紫外照相，若需要回收质粒则在紫外(长波长UV 360nm)下直接切胶，为防止紫外线对DNA的损伤，应尽量缩短暴露于紫外线的时间；

(9)将酶切后的质粒切胶回收，按试剂盒说明书进行。

1.4连接载体与目的片段

24℃1-2小时，16℃连接过夜。

1.5转化及扩大培养

(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞DH5α冰浴融化约5min；

(2)向感受态细胞悬液中加入连接产物10μl混匀，冰浴中静置30min；

(3)将EP管置于42℃水浴中热激90秒；

(4)冰浴中冷却3min；

(5)向每个EP管中加入700μl无抗LB培养液，37℃摇床上震荡培养45min(150rpm/min)；

(6)5000rpm离心3min，弃上清，保留100μl，重悬感受态细胞；

(7)吸取100μl已转化的感受态细胞滴在含氨苄抗性的LB固体琼脂培养基上，将细胞均匀涂开，待平板上的液体被吸收后，倒置平板37℃培养12-16小时；

(8)挑选3-4个大小合适的单克隆菌落扩大培养，加入适量含氨苄抗性的LB培养液37℃摇床震荡培养16小时。

1.6提取质粒

质粒的提取按照市售的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书进行；对提取的质粒使用紫外分光光度计检测浓度与纯度，得到的质粒的OD260/OD280比值为1.7-1.9。

1.7酶切鉴定

将该质粒经HindIII和BamH1双酶切后，酶切产物得到pSilencer 4.1-CMV酶切片段(约5100bp)和IER5shRNA基因片段(55bp)，酶切后的琼脂糖凝胶电泳(使用BM2000DNAMarker)结果表明目的基因片段已成功并且正确插入pSilencer 4.1-CMV表达载体中。

1.8测序

将提取的质粒10μl送往中美泰和公司进行DNA测序，使用DNAStar软件将测序结果与所设计的靶shRNA进行比对，质粒构建成功。

实施例2

2.1脂质体瞬时转染

将测序成功的质粒1、2、3、4号、阴性对照及空载瞬时转染SiHa细胞，48小时后提取细胞蛋白进行Western Blotting检测基因沉默效果，具体步骤如下：

(1)使用直径60mm的培养皿加3μg质粒进行转染；

(2)转染前观察细胞密度，要求转染时细胞密度为80％；

(3)将分装好的双无培养液(无血清、无双抗)在37℃预温，使用双无培养液给细胞换液，放入培养箱中培养片刻；

(4)准备EP管，使质粒的质量与脂质体的体积比例为1/2，以易于转染：

①EP管1中加入50μl双无培养液，加入3μg质粒，充分混匀；

②EP管2中加入50μl双无培养液，加入6μl脂质体2000，轻轻充分混匀；

③混匀后，均室温静置5min；

(5)将脂质体加入质粒中混匀，室温静置10min；

(6)将混合液滴入培养皿中的培养液中，充分混匀，放入培养箱，培养6小时后换正常培养液；

(7)转染24小时后，开始加药筛选培养，根据预实验中的SiHa细胞潮霉素B死亡曲线，加入终浓度为50μg/ml的潮霉素B培养液；

(8)3天更换一次含药培养液，每日观察细胞死亡情况；

(9)12天后形成肉眼可见的单克隆，挑取单克隆入24孔板进行扩大培养。用PBS洗2遍后，向培养皿底滴加少量胰酶消化细胞，轻轻晃动培养皿，使胰酶覆盖所有细胞后，吸去胰酶，37℃温箱中消化1min，在显微镜下观察细胞变圆时挑单克隆。使用20μl的微量加样枪吸取少量培养液吹打到单克隆细胞团上，使其从皿底脱落下来，吸入到24孔板中，吹打几次，使其充分混合均匀，每孔加入500μl培养液，使用25μg/ml的潮霉素B维持筛选压力；

(10)待24孔板长满后将细胞逐次传代入12孔板、6孔板、直径60mm培养皿继续培养；

(11)48小时后终止培养，提取细胞总蛋白，做Western Blotting检测蛋白。

其中，正常培养液为MEM-EBSS+10％胎牛血清；双无培养液为MEM-EBSS培养液不加血清和双抗。

Western Blotting检测结果如图3所示。

图3中，从左往右依次为空载体、阴性对照、DNA序列4、DNA序列3、DNA序列2、DNA序列1。从图3可以看出，经Western Blotting检测结果显示编号为DNA序列3、DNA序列2的质粒敲低IER5基因成功。

2.2脂质体稳定转染

还对脂质体瞬时转染的稳定性进行了观察，稳定转染的质粒为连接DNA序列3的载体、连接DNA序列2的载体、连接阴性对照的载体以及空载体。此外，转染前观察细胞密度，当细胞密度为40％-60％时转染效率最高。

实施例3

3.1细胞总蛋白的提取

(1)从孵箱中分别取出培养好的不同细胞，包括：原始SiHa细胞、转入空载体的SiHa细胞，转入含有阴性对照的载体的SiHa细胞、转入连接DNA序列3的载体的SiHa细胞、转入连接DNA序列2的载体的SiHa细胞，分别弃培养液，PBS冲洗2遍；

(2)加胰酶消化细胞，放入37℃孵箱约3min，显微镜下见细胞变成圆形、透明，加培养液终止消化；

(3)将消化下来的细胞悬液吸入1.5ml EP管中，1000rpm离心3min；

(4)弃上清，加入约1.5ml的PBS重悬细胞，5000rpm离心3min；

(5)弃上清，加入蛋白裂解液，直径60mm的皿细胞长满后加入60μl蛋白裂解液，将细胞吹打均匀；

(6)冰上裂解15-30min；

(7)4℃条件下(防止蛋白被酶分解)，12000rpm离心15min；

(8)将上清液吸取到一个新的EP管中，即为提取的蛋白；

(9)按比例加入6×loading buffer混匀，此时蛋白样品变为蓝色，将其在沸水煮5min，放入-20℃保存待用；

(10)BCA法测蛋白浓度。

3.2Western Blotting

IER5蛋白的分子量为34kD，其分离胶浓度为12％。

配置好分离胶倒入后，使用无水乙醇或双蒸水液封，等待15min待胶凝固倒入浓缩胶，插入梳子，等待约40-50min待胶凝固，第一个孔上marker：protein ladder 3μl，每个孔上样40μg总蛋白。

SDS-PAGE电泳：80V恒压跑50min，将电压调至120V恒压跑30min，结束电泳。

转膜(半干法)：提前使用转膜液将薄、厚两张滤纸浸泡至少10min，切胶后，按从下到上：厚滤纸、NC膜、胶、薄滤纸的顺序铺好，20V恒压转膜34min。

丽春红染色：将膜放入1×丽春红中，可见蛋白条带红染，迅速拿出使用TBST缓冲液洗膜3遍，洗去红色。

封闭：将NC膜浸入封闭液中(10％脱脂奶粉，5g脱脂奶粉+50ml TBST配制而成)摇床室温孵育2小时。

一抗封闭：IER5的一抗购自Abcam公司的抗山羊多克隆抗体，可抗人IER5蛋白中的248-260个氨基酸(IER5基因蛋白共含327个氨基酸)，使用时需1/500-1/1000稀释，蛋白分子量为34kDa。将IER5抗体使用5％封闭液按1/500稀释，封闭NC膜室温2小时后，4℃过夜。

洗膜：使用TBST在脱色摇床上洗膜8min*3次。

二抗封闭：二抗使用兔抗山羊抗体，按1/2000使用5％封闭液稀释，室温摇床孵育1小时。

洗膜：使用TBST在脱色摇床上室温洗膜10min*3次。

ECL化学发光、显影、定影：将ECL的A和B试剂等体积加入到2ml的EP管中混合，注意避光。在暗室中，往NC膜上滴加发光液，稍待1min发光液吸收，盖上预先铺好的保鲜膜，将裁好的X光片放在膜上，合上压片夹压片10min。曝光完成后打开压片夹，将胶片浸入显影液中显影，出现条带后即终止，将胶片在清水中轻轻漂洗后放入定影液中定影3min，显影完成。

将NC膜用TBST洗膜20min*3次。

β-actin一抗封闭：β-actin的一抗为抗小鼠的单抗抗体，使用5％封闭液按1/1000稀释，封闭NC膜室温2小时。

洗膜：使用TBST在脱色摇床上洗膜8min*3次。

二抗封闭：二抗使用山羊抗小鼠抗体，按1/4000使用5％封闭液稀释，室温摇床孵育1小时。

洗膜：使用TBST在脱色摇床上洗膜8min*3次。

发光、显影、定影：方法同上，β-actin显影时通常只需压片10秒。

图像分析：将胶片进行扫描，结果如图4所示；将图4用Quantity One软件进行灰度分析，得到的柱形图如图5所示。

从图4和图5可以看出，本发明提供的含有DNA序列2的载体转入SiHa细胞(2号细胞)后和含有DNA序列3的载体转入SiHa细胞(3号细胞)后，均达到了很好的抑制IER5基因的表达的效果。

实施例4

Real-Time PCR检测mRNA含量

4.1细胞总RNA的提取

(1)使用胰酶消化细胞，离心2次后，直径60mm的培养皿的细胞加入1ml的Trizol溶液裂解细胞提取RNA，室温放置5min；

(2)按1mlTrizol：0.2ml氯仿的比例，加入200ul氯仿，震荡混匀15秒，室温放置3min，4℃条件下12000rpm离心15min；

(3)小心收集上清入经去RNA酶处理过的1.5mlEP管(此时液体分为3层，RNA仅存在于最上层的水相中)；

(4)按1mlTrizol：0.5ml异丙醇的比例，加入500ul异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃条件下12000rpm离心10min，获取RNA沉淀；

(5)小心弃去上清液，按1mlTrizol：1ml 75％乙醇的比例，加入1ml 75％乙醇，将沉淀吹匀，4℃条件下8000rpm离心5min；

(6)小心弃去乙醇上清，将白色RNA沉淀置于37℃恒温箱中烘干至变成透明薄膜，约30min；

(7)用20μlDEPC水溶解RNA沉淀，置于37℃恒温箱中孵育10min，使RNA充分溶解；

(8)利用紫外分光光度计测定所提RNA浓度；

注意：收细胞应在超净台中进行，全程尽量避免RNA酶的污染。

4.2逆转录cDNA的合成(根据TOYOBO公司的试剂盒说明书进行)

4.3上下游引物的合成

根据文献报道及NCBI GeneBank数据库中IER5及β-actin的基因序列，结合引物设计原则，设计出检测IER5基因mRNA的Real-Time PCR引物序列。

IER5上游引物序列：5’-CCGGGAACGTGGCTAACC-3’

IER5下游引物序列：5’-CCGGGAACGTGGCTAACC-3’

β-actin上游引物序列：5’-GCGCGGCTACAGCTTCA-3’

β-actin下游引物序列：5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’

上述2对引物送交北京奥科鼎盛生物科技公司合成。

4.4实时定量PCR反应(按RealMasterMix试剂盒说明进行，此步需避光！)

PCR反应条件：

4.5Real-Time PCR的数据处理和分析

荧光扩增曲线：如图6所示。从图6可以看出，经过了背景信号阶段、指数扩增阶段，进入平台期后，扩增曲线的形状是一条平滑的S型曲线，表示实时荧光信号强度好，PCR产物的量与起始模板量存在线性关系。

溶解曲线：如图7所示。从图7可以看出，溶解曲线的每一个波峰代表一个PCR样品，被测的多个样品的波峰单一并且一致，说明被检测基因的扩增特异性好，所得Ct值可信、有意义。

计算公式：ΔCt＝Ct(IER5)-Ct(β-Actin)

ΔΔCt＝ΔCt-ΔCt₀

mRNA的相对表达量：2^-ΔΔCt

注：ΔCt₀为正常SiHa或HeLa的mRNA值(未照射/转染空载)，故其对应的2^-ΔΔCt＝2⁰＝1。

通过Real-Time PCR从mRNA水平定量验证，结果如图8所示。其中，**表示与空载体进行配对t检验p<0.01。从图8可以看出，2号和3号细胞系中IER5基因成功沉默。

综上可以看出，Western Blotting和Real-Time PCR结果均显示构建的2号和3号SiHa细胞系中IER5基因成功沉默。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列以如SEQ IDNO.3所示的正义链和如SEQ ID NO.4所示的反义链设计得到。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述正义链与所述反义链之间的茎环序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1或2所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的一端添加有BamH1酶切位点，另一端添加有HindIII酶切位点。

4.根据权利要求1或2所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的正义链如SEQ IDNO.8所示，反义链如SEQ ID NO.9所示。

5.含有权利要求1-4任一项所述的DNA序列的载体。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，构建所述载体的质粒为pSilencer4.1-CMV。

7.权利要求1-4任一项所述的DNA序列在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

8.权利要求5-6任一项所述的载体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。