CN100569298C - 编码IER5的SiRNA的DNA序列及其载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码能特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列及其载体，以及在制备提高肿瘤细胞的辐射抗性药物和治疗宫颈癌药物中的应用。其DNA序列分别命名为IER5-27和IER5-16。并将这两对DNA序列克隆到Psilencer^TM 3.1-H1 hygro载体上，以及转染获得单克隆细胞系IER5-SiRNA-HeLa。本发明可有效地抑制IER5基因的表达；本发明的细胞系属于单克隆，RNA干扰效率高，能有效抑制IER5基因的表达，该细胞系特异性强，无毒副作用；可用于对该基因有关的潜在药物开发与其反应连锁基因的研究，以及宫颈癌的放疗与药物研发。

Description

编码IER5的SiRNA的DNA序列及其载体和应用

技术领域

本发明属于医药基因工程领域，具体地说涉及编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列及其载体和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。RNAi是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御机制。双链RNA在细胞内被Dicer切成约19-22nt的小片段干扰RNA(SiRNA)进而形成SiRNA-蛋白复合物(SiRNP)，SiRNA通过识别、降解具有同源序列的mRNA最终导致特异性的基因表达沉默(gene silencing)〔Liu JY等.J.Section GenetForeign Med Sci，2004；27(1)：4-10.〕。因此，RNA干扰技术近年来日益受到人们的重视。SiRNA技术正在逐步应用在基因功能研究、细胞信号转导途径分析、冗余基因的确定、药物开发中靶标验证、基因治疗、病毒感染、癌症和显性遗传病治疗等都有广泛的用途。

目前治疗肿瘤的方法主要有三种，分别为外科手术、化疗与放射治疗，其中放射治疗约占这些肿瘤治疗的27％左右。细胞的辐射效应与细胞的辐射敏感性和临床上肿瘤放射治疗有关。在临床上，辐射敏感性已成为提高肿瘤放疗效果的一个重要因素，这种辐射敏感性与辐射敏感基因有关。与辐射有关的早期反应基因IER5(Immediate Early Response 5，简称为IER5，中文名称为早期反应基因5)，人的该基因位于1号染色体上1q25.3处，全长2369bp；而鼠的该基因也是位于1号染色体上181.5CM处，长度为2123bp。目前有关IER5的研究主要有：IER5基因序列(Williams M等.Genomics，1999，55：327-334)、在睡眠与清醒状态下在大脑中IER5基因表达(Cirelli C等.Brain research，2000，885：303-321)、辐射对IER5基因表达的影响(Tunde E等.InternationalJournal of radiation oncology biology and physics，2006：1506-1514.；Tachiiri S等.International Journal of Radiation Oncology Biology andPhycics，2006，64：272-279)等。Long XH等研究发现辐射后IER5基因有高表达现象(Long XH等.Int J Mol Med.2007Apr；19(4)：607-15)。说明IER5有可能与辐射敏感性有关，这种敏感性可用于对耐肿瘤辐射敏感药物的开发。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA。

本发明的第二个目的在于提供一种含有能稳定表达上述DNA的载体，优选地，载体是Psilencer^TM 3.1-H1 hygro-SiRNA。

本发明的第三个目的在于提供含有上述载体的宿主细胞，优选地，宿主细胞是HeLa，更优选地，宿主细胞是IER5-SiRNA-HeLa，其已于2008年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.2338。

本发明的第四个目的在于提供一种提高肿瘤细胞辐射抗性的组合物，其含有上述编码SiRNA的DNA、含有上述DNA的载体以及含有该载体的宿主细胞，优选地，组合物是药物组合物。

本发明的第五个目的在于提供上述编码SiRNA的DNA、含有上述DNA的载体以及含有该载体的宿主细胞在制备提高肿瘤细胞的辐射抗性药物中的应用，优选地肿瘤细胞是宫颈癌细胞。

本发明的第六个目的在于提供上述编码SiRNA的DNA、含有上述DNA的载体以及含有该载体的宿主细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选地肿瘤是宫颈癌。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA，所述DNA的核苷酸序列是选自下列(a)或(b)的核苷酸序列：

(a)IER5-27：

正义链：5’-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID No.1)；

反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3’(SEQ ID No.2)；

(b)IER5-16：

正义链：5’-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID No.3)；

反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAAGAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3’(SEQ ID No.4)。

含有上述DNA的载体，优选地是含有上述DNA序列的Psilencer^TM 3.1-H1hygro-SiRNA载体。其按照如下方法构建：将特异性沉默IER5基因的编码SiRNA的DNA序列能够插入载体中形成发夹SiRNA插入片段，然后与Psilencer^TM 3.1-H1hygro载体连接，构建得到Psilencer^TM 3.1-H1 hygro-SiRNA表达载体；所述插入片段包含有21个碱基对的SiRNA作用片段、一个环(loop)、3′端突出两个碱基以及在两端的Bam HI和Hind III酶切位点。

含有上述载体的宿主细胞，优选地该宿主细胞是HeLa细胞。按照如下方法构建能稳定抑制基因IER5表达的HeLa细胞：采用阳离子脂质体Lipofectamine^M2000将上述Psilencer^TM3.1-H1 hygro-SiRNA载体导入Hela细胞株中，然后通过潮酶素B进行筛选，挑选单克隆细胞培养并检测抑制IER5基因的mRNA的水平，得到稳定表达SiRNA功能的细胞系。更优选地，该宿主细胞是IER5-SiRNA-HeLa，于2008年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2338。

一种提高肿瘤细胞辐射抗性的组合物，其含有上述DNA、或含有上述载体、或者含有所述的宿主细胞中的至少一种为活性成分，优选地该组合物是药物组合。该药物组合物除了上述活性成分外，还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

上述DNA、含有上述DNA的载体、或者含有该载体的宿主细胞用于制备提高肿瘤细胞辐射抗性的药物，优选地肿瘤细胞是宫颈癌细胞。

上述DNA、含有上述DNA的载体、或者含有该载体的宿主细胞用于制备治疗肿瘤的药物，优选地肿瘤是宫颈癌。

上述编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列的筛选过程为：

首先在NCBI GeneBank获得人的IER5全mRNA序列，编号为NM_016545，全长2369bp，其编码区序列为(CDS，coding sequence)位于402～1385。在相应的SiRNA设计网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)上进行初步设计和筛选。在筛选中设定GC含量不超过50％。靶序列在IER5mRNA中位置太靠前或太靠后都会影响其抑制效果。

通过上述网站所设计出的具有SiRNA功能的可能靶序列为：

(1)IER5-27-SiRNA-Sequence

5′-GCCTCATCAGCATCTTCGGTT-3′；

3′-TTCGGAGTAGTCGTAGAAGCC-5′；

(2)IER5-16-SiRNA-Sequence

5′-GCTGCATAAGAACCTCCTGTT-3′；

3′-TTCGACGTATTCTTGGAGGAC-5′。

然后根据靶序列设计出编码SiRNA的DNA序列，这种DNA序列分别为：

(1)IER5-27：

正义链：5’-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID No.1)；

反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3’(SEQ ID No.2)；

(2)IER5-16：

正义链：5’-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID No.3)；

反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAAGAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3’(SEQ ID No.4)。

本发明具有如下优点和有益效果：(1)、本发明提供了两对能有效地抑制IER5基因的表达的编码SiRNA的DNA序列；(2)构建了能稳定表达IER5-27-SiRNA与IER5-16-SiRNA功能的载体；(3)本发明转染成功获得含有抑制IER5基因的SiRNA功能的单克隆细胞系IER5-SiRNA-HeLa；该细胞系属于单克隆，RNA干扰效率高，能有效抑制IER5基因的表达，同时使具有SiRNA同源序列的基因表达沉默而不影响其它基因的功能，所以该细胞系特异性强，无毒副作用；该细胞系为人类揭示IER5基因的生物学功能及了解该早期反应基因的有关信号转导途径等研究提供了实验细胞，可用于对该基因有关的潜在药物开发与其反应连锁基因的研究，以及宫颈癌的放疗与药物研发。

附图说明

图1质粒载体Psilencer^TM 3.1-H1 hygro的结构示意图。

图2正常HeLa细胞与IER5-SiRNA-HeLa细胞的生长曲线图。

图3正常Hela细胞与IER5-SiRNA-HeLa细胞辐射敏感性实验曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(New York：cold Spring harbor Laboratory press，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

实施例1：筛选编码IER5基因的SiRNA的DNA序列

利用网络资源以及软件对IER5基因进行生物信息学分析，检索NCBIGeneBank得到IER5基因RNA全序列，选择编码区作为SiRNA设计的靶序列。在相应的SiRNA设计网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)上进行初步设计与筛选，找出具有SiRNA功能的可能靶序列与其对应编码SiRNA的DNA序列。然后将所选定的正义序列和反义序列与GeneBank(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中已知同物种的基因序列进行比较，排除那些和其它编码序列或EST同源的序列，排除反义链的5′端连续8个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列。排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在编码SiRNA的DNA序列。最终获得3对编码SiRNA的DNA序列。根据它们在网络设计结果中排列的顺序进行命名，分别命名为SiRNA-12(其序列见序列表：SEQ ID No.5(正义链)和SEQ ID No.6(反义链))、SiRNA-16(其序列见序列表：SEQ ID No.3(正义链)和SEQ ID No.4(反义链))、SiRNA-27(其序列见序列表：SEQ ID No.1(正义链)和反义链SEQ ID No.2(反义链)。其中编码SiRNA-12的DNA序列如下：

(1)正义链：5’-GATCCGCAGATGGAGTTCAAGCTGTTCAAGAGACAGCTTGAACTCCATCTGCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID No.5)

(2)反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGATGGAGTTCAAGCTGTCTCTTGAACAGCTTGAACTCCATCTGCG-3’(SEQ ID No.6)

其对应的SiRNA靶序列为：

5′-GCAGATGGAGTTCAAGCTGTT-3′

3′-TT CGTCTACCTCAAGTTCGAC-5′

阴性对照的DNA序列为：

(1)正义链：5’-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3’；

(2)反义链：3’-GGTGATGGCAACAATATCCACACGTTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCGA-5’。

实施例2：构建带有编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA的载体

下面以编码IER5-27SiRNA的DNA序列、编码IER5-16SiRNA的DNA序列、编码IER5-12SiRNA的DNA序列为例，说明该载体的构建方法，包括如下步骤：

1、合成SiRNA的DNA序列

将实施例1中所述的IER5-27SiRNA、IER5-16SiRNA、IER5-12SiRNA 3对编码SiRNA的DNA序列送到Invitrogen公司合成。

2、退火

将Invitrogen公司合成的正义链与反义链序列退火为互补双链。

(1)溶解：将上述合成的正义链和反义链分别用双蒸水溶解，使其终浓度为1ug/ul；

(2)在0.2ml的EP管中加入下列样品，组成10ul反应体系：

正义链：            0.4ul

反义链：            0.4ul

退火缓冲液：        9.2ul

(3)退火：

将编号分别为IER5-12TB、IER5-16TB、IER5-27TB的0.2ml EP管(每管含10ul上述(2)中样品)在90℃加热3分钟，然后在37℃，60分钟进行退火。

3.酶切

(1)试剂：

Psilencer^TM 3.1-H1 hygro(0.363ug/ul)，购自Ambion公司

Hind III及其缓冲液NE Buffer 2，购自NEB公司

BamH I及其缓冲液NE Buffer 2 BamH I购自NEB公司

BSA

双蒸水

(2)第一次酶切载体

①构建100ul反应体系：

Psilencer^TM 3.1-H1 hygro             10ul

BSA                                  1ul

Hind III酶切缓冲液                   10ul

Hind III                            2ul

双蒸水                              77ul

②将上述成分加入1.5ml EP管中，混合后离心。在37℃中酶切4小时，反应终止后置于-20℃中保存备用。

③纯化

采用博大泰克公司的纯化试剂盒，具体操作如下。

1)将上述反应液移入一干净1.5ml EP管中，向该管中加入500ul混合液PB；

2)将混合液移入离心吸附柱，并套入2ml收集管中；10000rpm离心1min；离心后倒掉收集管中的液体(可将过柱液重复上柱离心，提高DNA回收率)；

3)加入600ul漂洗液PW，10000rpm离心1min；离心后倒掉收集管中的液体；

4)室温下，将离心吸附柱在13000rpm离心2min；

5)将离心吸附柱放入干净的离心管中；加入50ul，60℃的双蒸水到中央吸附膜上；静放2min，溶解DNA。以10000rpm离心1min。再将过柱洗脱液重加到吸附膜上。以13000rpm离心1min(洗脱DNA到蒸馏水中)。

6)将离心管内已提纯的DNA放入-20℃冰箱内保存，并用1％琼脂糖电泳检测其纯度。

(3)第二次酶切载体

①构建100ul反应体系：

Hind III酶切纯化后产物                    40ul

BSA(1％)                                  1ul

BamH I缓冲液                              10ul

BamH I                                    2ul

双蒸水                                    47ul

将上述成分加到1.5ml EP管中，混合均匀，离心。在37℃下BamH I酶切4小时，反应终止后置于-20℃保存。

②纯化：用步骤(2)中③的方法进行纯化。

4.连接

(1)将退火产物稀释10倍

取1ul退火产物加9ul双蒸水，分别标注为12.10×、16.10×、27.10×。

(2)加样

①取3支0.2ml EP管，分别标注12.Lig、16.lig、27.Lig；取1支0.2mlEP管，标注对照。

②向标注为12.Lig、16.lig、27.Lig的3个0.2ml EP管内加入下列物质：

上述(1)稀释过的退火产物              1ul

经酶切纯化后的载体                   1ul

10×连接缓冲液                       1ul

T4DNA连接酶(Promega)                 1ul

双蒸水                               6ul

③向用于做对照的0.2ml EP管内加入下列物质：

1×PCR Buffer                         1ul

经酶切后纯化的载体                    1ul

10×连接缓冲液                        1ul

T4DNA连接酶                           1ul

双蒸水                                6ul

④将加好的样品放到14-37℃(16℃左右)中静置8h，反应终止后置于-20℃冰箱中保存。

5.转化

(1)前期操作：在冰上用DH5a感受态细胞(购自博大泰克公司产品)。

①将冰上融化的感受态细胞50ul和上述连接产物(目的DNA)3-5ul一起混合，轻轻地混匀。

②将其冰浴30min(最好全插在碎冰上)。

③在42℃水浴中热激90s。

④快速冰浴2-3min使细胞冷却。

⑤向每个EP管中加入500ul LB培养基(不含抗生素)，并混匀。

⑥置于恒温震荡器(培英牌THZ-C恒温震荡器)：200转/分钟，37℃，培养1h，使细菌复苏。

⑦铺板：将上述EP管内容物混匀(离心后去一部分上清，余下约60ul，可涂小LB琼脂培养板；100ul，可涂大LB琼脂培养板)。取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB琼脂培养板(直径约60mm)，用玻璃铺板器将细胞均匀涂开，待板子上液体吸收后倒置该培养板，再将其置于37℃，培养16h。

(2)挑菌：培养16h后会发现培养板的LB琼脂上出现多个直径约1mm左右的白色菌群斑点。用移液器的枪头挑出后溶于10ul水中(挑周围噬菌体少的菌斑)，本实验有27号、16号、12号与对照4个LB琼脂培养板。每板上菌斑取10-20个10ul水中，用于PCR模板，电泳检测有无所需要的条带。

(3)PCR实验

①PCR实验体系

H₂O                                        6.6ul

10×PCR Buffer                             1ul

dNTP                                       0.8ul

上游引物                                   0.2ul

(m13f通用序列：GTTTTCCCAGTCACGAC)

下游引物                                   0.2ul

(对应于各个编码SiRNA的DNA序列的反义链)

Tag酶(Promega)                             0.2ul

模板(挑出溶在水中的菌)                     1ul

②PCR实验条件

1)32个循环，10ul体系/样品

2)反应条件：94℃变性5min，94℃/20s，退火温度59℃/20s，延伸72℃/30s，32个循环，最后72℃ 7min；

(4)电泳检测

①配琼脂糖凝胶

②将PCR实验后的样品5ul与3ul Loading buffer混合，加于胶孔中，最后在新胶孔中加入5ul的marker。

③60-100v电压下进行电泳。

④紫外灯下观察条带。成功第一次挑菌的样品27-1至27-13；第二次挑菌的样品：16-2、16-3。

5.摇菌

(1)将PCR用去1ul后所余下的9ul样品加到含有5000ul LB培养基(含氨苄抗生素)中，摇菌过夜，37℃，200转/分恒温震荡器中。

(2)第二天若培养基变混浊，说明摇菌成功。

(3)将摇好的菌存到1.5mlEP管中，加入甘油(甘油与菌液比例为1∶1)，混合后放在-20℃冰箱中待测序。

6.测序：将样品送给测序公司

7.提取待转染的质粒DNA

若测序成功，采用提取DNA试剂盒，按照试剂盒的说明对样品进行处理：

(1)10000rpm离心5min，去上清。

(2)加入250ul溶液I，充分混合，转移到1.5ml EP管中。

(3)加入250ul溶液II，轻轻倒转4次(放置时间t≤5min)。

(4)加10ul碱性P酶，轻轻倒转4次，室温放置5min。

(5)加入350ul溶液III，立即倒转混匀4次。

(6)室温下13000rpm离心10min，过吸附柱纯化。

(7)将离心后的上清移入吸附柱内，采用离心机最大转速室温离心1min，弃上清液。

(8)加入750ul溶液IV(使用前加入35ul 95％的乙醇)，采用离心机最大转速，离心1min，弃上清液。

(9)加入750ul溶液IV，再洗一次吸附柱，采用离心机最大转速，离心1min，弃上清液。

(10)将吸附柱移入一干净的1.5ml EP管中，加入100ul无核酸酶的水，在室温采用离心机最大转速离心2min，回收质粒DNA，即带有特异性沉默IER5基因的SiRNA功能的载体——Psilencer^TM 3.1-H1 hygro-SiRNA，共构建了3个带有SiRNA序列的载体，包括IER5-27-SiRNA，然后放在-20℃冰箱中保存备用。

实施例3：检测所构建的载体

将实施例2所构建的质粒载体送到北京Invitrogen公司进行测序分析。

质粒测序的结果如下：

(1)样品编号：16-2(16表示该质粒来源于编码IER5-16SiRNA的DNA序列，2表示由该序列构建的第2号样品)质粒的测序结果见SEQ ID No.7所示，编码IER5-16SiRNA的DNA序列正确插入了质粒载体。

(2)样品编号：27-8(27表示该质粒来源于编码IER5-27SiRNA的DNA序列，8表示由该序列构建的第8号样品)质粒的测序结果见SEQ ID No.8所示，所得质粒载体序列中含有正确的编码IER5-27SiRNA的DNA序列。

(3)样品编号：27-12(27表示该质粒来源于编码IER5-27SiRNA的DNA序列，12表示由该序列构建的第12号样品)质粒的测序结果见SEQ ID No.9所示，所得质粒载体的序列中含有正确的IER5-27编码SiRNA的DNA序列。

(4)样品编号：27-10(27表示该质粒来源于IER5-27编码SiRNA的DNA序列，10表示由该序列构建的第10号样品)质粒的测序结果见SEQ ID No.10所示，所得质粒载体的序列中含有正确的编码IER5-27SiRNA的DNA序列。

测序结果表明：由IER5-12-SiRNA构建的载体，经过测序得知未带有编码IER5-12SiRNA的DNA序列或者说与IER5-12-SiRNA的DNA序列不吻合。而含有编码IER5-27SiRNA的DNA序列与编码IER5-16SiRNA的DNA序列的Psilencer^TM3.1-H1 hygro-SiRNA表达载体结果正确，说明获得了含有编码IER5-27-SiRNA和IER5-16-SiRNA的DNA序列的Psilencer^TM 3.1-H1hygro-SiRNA表达载体(见图1)。

实施例4：转染HeLa细胞

将实施例2所得到的带有编码IER5-27-SiRNA、IER5-16-SiRNA、IER5-12-SiRNA的DNA序列的六种载体转染人正常Hela细胞建立单克隆细胞系：

(1)在实验前一天将Hela细胞(人的宫颈癌细胞，购自军事医学科学院放射与辐射医学研究所)用胰酶消化到6孔板上，密度在2×10⁵左右。

(2)将4ug质粒溶到90ul Opti-MEM(无血清)培养基中。对于实施例2中的6种质粒1、2、3、4、5、6(6号为对照组)，所需要加入的体积分别为29.6ul、28.6ul、22.9ul、20.0ul、20.0ul、20.0ul与20ul。

(3)将12ul Lipofectamine^M2000试剂加入到Opti-MEM(无血清)培养基中。

(4)将上述步骤(2)、(3)中的液体轻轻混合，最好同点滴入与微微轻弹混合的方法，放置15-20min(共180ul)。在期间，将实验前一天铺板的6孔板的细胞进行换液，换成Opti-MEM(无血清)培养基(每孔量为1ml)。

(5)将步骤(4)中的混合液轻轻地滴加到6孔板中，放回培养箱放置6h，之后向每个孔中换液，换成1ml含血清的DMEM培养基。

(6)第二天观察细胞状态，若长满则需要传代。到第三天消化并接种在25cm²培养瓶中，用含有潮酶素和血清的DMEM培养基进行筛选12-15天(加入潮酶素的量可以采用依次递增的办法，在前两次潮酶素的量为10ul，后三次为20ul，最后加到30ul进行筛选)，再挑选出已形成的阳性单克隆。若培养皿内有细胞生长的空间，可不消化，直接在培养皿内筛选细胞。

(7)最后对各个型号转染成功的单克隆细胞进行培养，并保存。

实施例5：检测SiRNA对Hela细胞中IER5基因的抑制效果

细胞转染成功后，通过检测转染细胞的mRNA水平，了解各个SiRNA片段对细胞中的IER5基因的抑制效果。具体操作如下：

(1)转染细胞的总mRNA的提取

①转染细胞常规培养达到生长期时收集，在超净台中消化下细胞，转入离心管，弃去培养液，PBS漂洗再离心后加入适量的Trizol。

②将混合液转移到DEPC处理过的1.5ml离心管中(若不马上提取，可放入-70℃冰箱中冻存)。

③按1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，用手迅速剧烈摇动15s，室温放置2-3min，然后4℃，12000rgf，离心15min。

④将上清转移到另一个新的1.5ml离心管中(离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相，RNA仅存在水相中)。

⑤按1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，混合均匀，室温放置10min。

⑥离心：4℃，12000rgf，离心10min。

⑦小心弃去上清，加入1ml 75％乙醇。

⑧离心：4℃，7500rgf，离心5min。

⑨小心弃去75％乙醇，超净台吹干10min

⑩RNA溶于16-20ulDEPC水中，使RNA完全溶解。

(2)总mRNA浓度分析与纯度鉴定

从上述(1)提取的RNA中各吸取1ul，稀释至100ul后，利用紫外光光度计分别测定其在260nm、280nm波长处的吸光度(OD₂₆₀、OD₂₈₀)。两者比值在1.8-2.0之间时，说明提取的RNA纯度较好，符合下一步实验要求。

(3)逆转录合成cDNA链

以2ug总RNA为模板转录cDNA。逆转录体系为20ul。具体操作依据反转录试剂盒(Invitrogen公司)的说明书。

(4)Real Time PCR测试IER5的SiRNA转染hela细胞的抑制效果

测试IER5基因mRNA水平采用7300real-time PCR system仪器，反应循环次数为40次，反应体系为20ul，反应条件为50.0℃/2min(主要是通过UNG酶消化测试样品中残留的RNA)、95.0℃/10min(主要用于UNG酶灭活与使摸板变性)、95.0℃/15s、60.0℃/1min(退火与延伸温度都是60℃，总时间为1min)。测试数据的处理为该仪器自有的7300system SDS software。

设计了测试引物，其人的引物序列如表1如示，其中β-actin为内参基因。

表1real-time PCR测试的引物序列

引物编号	引物名称	引物序列
			B1020039	IER5-Forward	CCGGGAACGTGGCTAACC
B1020040	IER5-Reverse	TTCCGTAGGAGTCCCGAGAA
			B1020041	β-actin上游	GCGCGGCTACAGCTTCA
B1020042	β-actin下游	CTTAATGTCACGCACGATTTCC

检测转染细胞1号、2号、3号、4号、5号以及阴性对照序列转染的6号细胞mRNA水平，此外对照组的数据为该仪器测试β-actin的参考测量值，该实验独立测试三批样品，其测试结果如表2。

表2：转染细胞系的IER5基因mRNA表达结果

样品	IER5的Ct平均值	actin的Ct平均值	ΔCt	ΔΔCt	样品组/对照组＝2<sup>-Δ</sup><sup>ΔCt</sup>
						1	23.139	19.476	3.914	4.372	2<sup>-4.372</sup>
2	24.276	15.985	8.291	8.794	2<sup>-8.794</sup>
						3	23.076	15.594	7.482	7.940	2<sup>-7.94</sup>
4	24.675	21.877	2.798	3.256	2<sup>-3.256</sup>
						5	23.595	21.390	2.205	2.663	2<sup>-2.663</sup>
6	23.614	31.524	-7.910	-6.452	2<sup>+6.452</sup>
						control	31.342	31.800	-0.458	0.000	2<sup>0</sup>＝1

将6号细胞的mRNA值定为定为1，则转染细胞1号、2号、3号、4号、5号的mRNA值就分别为2^-10.824、2^-15.246、2^-14.392、2^-9.708、2^-9.115。结果(见表3)可以看出：这6种细胞中，IER5的mRNA水平表达最高的是对照组6号，相对于对照组6号，1-5号细胞中的IER5的mRNA水平表达都有显著性的下降，其中，表达量最低的是2号，其次是3号、1号、4号、5号。其中1号、2号、3号、5号来源于IER5-27-SiRNA；而4号来自于IER5-16-SiRNA，6号为阴性对照组，来源于随机设计的一个没有干扰作用与人基因组无关的小分子(不会影响IER5基因的表达)。阴性对照序列如下：

1)正义链：5’-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3’

2)反义链：3’-GGTGATGGCAACAATATCCACACGTTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCGA-5’

该实验结果说明上述设计的编码IER5基因SiRNA的DNA序列以及由此构建的质粒对IER5基因均有抑制表达的作用，抑制效果最好的属于2号转染细胞系，命名为IER5-SiRNA-HeLa。将其在2008年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2338。

实施例6：IER5-SiRNA-HeLa细胞对辐射的敏感性

利用姬姆萨(Giemsa)染色法计算不同剂量γ射线对正常HeLa细胞与转染HeLa细胞的集落克隆形成率。

(1)将对数期的这两种细胞(正常Hela细胞与实施例5中IER5-SiRNA-HeLa细胞(CGMCC No.2338))按照2Gy、4Gy的辐射剂量(将未照射细胞作为对照组)进行γ射线照射。各个剂量点与细胞个数如表3所示。

表3细胞辐射敏感性实验方案

照射后的细胞与未照射细胞立即接种一定数量的细胞于60mm直径的培养皿(添加DMEM培养基至3ml)，每个剂量组3个皿，置于37℃，5％CO₂孵箱中培养12天。

(2)采用PBS洗2次，甲醇固定10-15min，用吉姆萨(Giemsa)染色过夜；待处理、凉干后进行培养皿的底部图象扫描，变成bmp为后缀的图像文件；

(3)利用人工进行细胞克隆数计数(计数条件为大于50个细胞的单克隆)，计算出细胞存活率。对每种细胞，该细胞辐射敏感性实验独立进行各3次。

(4)对细胞集落计数结果进行数学统计处理，结果如图2所示。根据多种剂量的辐射后细胞集落克隆形成率发现：IER5-SiRNA-HeLa CGMCC No.2338细胞集落克隆形成率明显高于正常的Hela细胞，说明抑制IER5基因的表达可提高细胞的辐射抗性，诱导增加IER5基因的表达会提高细胞辐射的敏感性。

实施例7

辐射对Hela和IER5-SiRNA-HeLa细胞增殖的影响

1.细胞培养：

在CO₂细胞培养箱内采用DMEM培养基培养正常Hela细胞与实施例5中的IER5-SiRNA-HeLa CGMCC No.2338细胞。细胞生长面积接近细胞培养瓶90％时，将培养瓶放到超净台上进行操作。

2.接种细胞与细胞计数

首先弃去培养基，采用胰酶消化，再加入3ml的DMEM培养基终止胰酶对细胞的消化。10000rpm离心3min，之后在超净台中弃去上清，再加入5ml的培养基，用刻度吸管吹打均匀后取0.3ml进行细胞浓度的计数。采用计数板在显微镜上进行。根据计数得出的细胞浓度算出15000个细胞对应的体积量。如果第一次计数得出的细胞浓度很大，可采用细胞再次稀释与计数的的办法，再算出15000个细胞对应的体积量，用于后续的实验。

采用灭菌的移液器将15000个细胞的体积量加在6孔板的各个孔内。对于每种细胞，设立未照射组、2Gy辐射组、4Gy辐射组，每次实验每组要铺两块六孔板，共做3次独立实验。在铺板后第2天进行辐射组的细胞照射，在照射后次日开始进行每天固定时间的细胞计数。首先在超净台内用灭菌的移液器将6孔板中一个孔的培养基吸出，加入0.5ml的胰酶进行消化。待完全消化后加DMEM培养基至2ml，混合均匀后取0.3ml进行显微镜下计数，同时将该6孔板重新放回培养箱进行培养。通过对0.3ml的细胞浓度的计数与计算，再根据一孔细胞总体积(2ml)算出该孔中细胞的总数。每天对一种细胞的一类实验要做两个孔的细胞计数。这样连续6天对6孔板内的细胞分别进行计数与每孔内的总细胞数的计算。

3.对细胞增殖数据的处理

对于人正常Hela细胞与IER5-SiRNA-HeLa CGMCC No.2338细胞增殖数据进行双因素的统计分析，结果如图3所示。

从图3可看出，两者之间具有显著性差异，IER5-SiRNA-HeLa CGMCC No.2338细胞生长明显比HeLa生长快，即使在2Gy、4Gy的γ射线辐射下，也具有这种特性。这一特性暗示IER5基因具有减缓HeLa生长的作用，IER5基因表达抑制可增强细胞的增殖能力。

序列表

<110>首都医科大学

     中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>编码IER5的SiRNA的DNA序列及其载体和应用

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列

<400>1

gatccgcctc atcagcatct tcggtttcaa gagaaccgaa gatgctgatg aggttttttg 60

gaaa                                                              64

<210>2

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列的反义链

<400>2

agcttttcca aaaaacctca tcagcatctt cggttctctt gaaaccgaag atgctgatga 60

ggcg                                                               64

<210>3

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列

<400>3

gatccgctgc ataagaacct cctgttcaag agacaggagg ttcttatgca gcttttttgg  60

aaa                                                                63

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列的反义链

<400>4

agcttttcca aaaaagctgc ataagaacct cctgtctctt gaacaggagg ttcttatgca  60

gcg                                                                63

<210>5

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列

<400>5

gatccgcaga tggagttcaa gctgttcaag agacagcttg aactccatct gcttttttgg  60

aaa                                                                63

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码IER5基因的SiRNA的DNA序列的反义链

<400>6

agcttttcca aaaaagcaga tggagttcaa gctgtctctt gaacagcttg aactccatct  60

gcg                                                                63

<210>7

<211>1200

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IER5-16插入载体的序列

<400>7

tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt  60

gggaatctta taagttctgt atgagaccac tcggatccgc tgcataagaa cctcctgttc  120

aagagacaga ggttcttatg cagctttttt ggaaaagctt ggcgtaatcc tggtcataac  180

tggttcctgg gggaaattgg tatccgctca caattccaca caacatacga accggaagca  240

taaagtggaa agcctggggt ggctaatggg tgagctaact cacattaatt gggttgcgct  300

cactggccgc tttccagtcc ggaaacctgg cctggcagct gcattaatga atcggccaac  360

gcgcggggag aggcggtttg ggtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgg  420

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt  480

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggg cagcaaaagg  540

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg  600

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga agtggcgaaa cccgacagga ctataaagat  660

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta  720

ccggatacct gtccggcttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct  780

gtaagtatct ccagttcggt gtaggtcggt cgctccagct gggctgtggg gcacgaaccc  840

ccgttcagcc cgacgctgcg cttatccggt aactatcgtc ttgagtcacc cggtaagaac  900

gactatcgcc actggcagca gcactgtaca gatagcagag cgagtatgta gcgtgctacg  960

agtctgagtg tggctactac gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 1020

gagccagtac tcgggaaaga gtgtagctcc tggatcggca acaacacacc gctggtgacg 1080

gtgggttttg ttgcggacag cgatatccgc ccgacaagac ttcacgagat ccctggacca 1140

tccagggctg gactctgtac gcgacctcgc ttagaggtga tgtctcgcga tgtcgtacca 1200

<210>8

<211>993

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IER5-27插入质粒载体的序列

<400>8

tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct ttggatttgg   60

gaatcttata agttctgtat gagaccactc ggatccgcct catcagcatc ttcggtttca  120

agagaaccga agatgctgat gaggtttttt ggaaaagctt ggcgtaatca tggtcatagc  180

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca  240

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct  300

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac  360

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc  420

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt  480

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg  540

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg  600

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat  660

accaggcgtt tccccctgga aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt  720

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc  780

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc  840

cccgttcagc ccgaccgctg cgcttatcag tactatcgtc ttgagtccaa cccggtagac  900

acgactatcg cactgcagca gcactgtaca gattacagag cgagtatgta tgcgtgctaa  960

cgagtcttga atggtgccca actacggctc act                               993

<210>9

<211>740

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IER5-27-SiRNA序列插入质粒载体后的序列

<400>9

tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct ttggatttgg   60

gaatcttata agttctgtat gagaccactc ggatccgcct catcagcatc ttcggtttca  120

agagaaccga agatgctgat gaggtttttt ggaaaagctt ggcgtaatca tggtcatagc  180

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca  240

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct  300

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac  360

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc  420

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt  480

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg  540

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg  600

agtatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat  660

accaggcgtt tccccctgaa atctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta  720

ccggatacct gtcccgcctt                                              740

<210>10

<211>660

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IER5-27-SiRNA插入质粒载体后序列

<400>10

tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct ttggatttgg   60

gaatcttata agttctgtat gagaccactc ggatccgcct catcagcatc ttcggtttca  120

agagaaccga agatgctgat gaggtttttt ggaaaagctt ggcgtaatca tggtcatagc  180

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca  240

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct  300

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac  360

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc  420

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt    480

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg    540

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg    600

agtatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat    660

Claims (8)

1、一种编码特异性沉默IER5基因的SiRNA的DNA，其特征在于所述DNA的核苷酸序列是如下核苷酸序列：

IER5-27：

正义链：5’-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3’；

反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3’。

2、含有权利要求1所述DNA的载体。

3、含有权利要求2所述载体的宿主细胞。

4、按照权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是IER5-SiRNA-HeLa，其保藏编号为CGMCC No.2338。

5、权利要求1所述的DNA在制备提高肿瘤细胞的辐射抗性药物中的应用。

6、按照权利要求5所述的应用，其特征在于所述的肿瘤是宫颈癌。

7、权利要求1所述的DNA在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

8、权利要求3或4所述的宿主细胞在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

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