CN110846433B

CN110846433B - 一种与小麦白粉菌抗药性相关的kasp标记及其应用

Info

Publication number: CN110846433B
Application number: CN201911198505.2A
Authority: CN
Inventors: 龚双军; 杨立军; 向礼波; 史文琦; 袁斌; 薛敏峰; 刘美玲; 陈婷婷; 曾凡松; 喻大昭
Original assignee: Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110846433A

Abstract

本发明涉及了一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及应用，属于植物病原真菌抗药性分子检测技术领域。该标记位于小麦白粉菌cyp51基因的133位，标记为CYP51S1‑133，该CYP51S1‑133位点处碱基为C或T，本发明还基于该位点开发了KASP标记专用引物，使用KASP法对CYP51S1‑133进行检测，可快速、高效、高通量检测出小麦白粉菌抗药菌株在生产实际中分布情况，利用建立的高效抗药性分子检测手段，划分抗药性水平，为小麦白粉病化学防治分区治理提供科学依据。

Description

一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及其应用

技术领域

本发明属于植物病原真菌抗药性分子检测技术领域，具体涉及一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及其应用。

背景技术

由专性寄生菌（Blumeria graminisf.sp.tritici, Bgt）引起的小麦白粉病，是小麦生产最重要病害之一。该病害在小麦整个生育期均可发生，尤其影响籽粒灌浆，造成空瘪粒增加，导致产量下降。在我国常年发生面积 685-730万公顷，一般发病田会减产5%～10%，重病田减产达 20%以上。化学药剂作为当前防治小麦白粉病的重要防治措施，在保障小麦安全生产中发挥着重要作用。目前，生产上防治小麦白粉病药剂主要以靶向14-α脱甲基酶的麦角甾醇合成抑制剂，唑类药剂为主。国内登记防治小麦白粉病杀菌剂中，三唑类已占到89.9%（单剂和复配），主要以三唑酮、戊唑醇、丙环唑等药剂为主。但由于大面积、长时间使用作用机制相同的杀菌剂会给病原菌群体造成选择压力，逐渐形成抗药性菌群，最终导致药剂防效丧失。

小麦白粉菌是专性寄生菌，抗药性的表型鉴定周期长, 易受环境影响,导致鉴定结果无法精准。相对于表型鉴定, 利用与抗药性相关的靶标基因开展分子鉴定具有省时、经济等特点。小麦白粉菌对三唑类药剂的抗性机理目前主要是cyp51靶标基因的点突变。靶标编码的CYP51基因突变导致降低抑制剂蛋白的亲和性，在很多植物病原真菌和人类病原菌已有很多报道。过去的20年时间已经发现至少有30个抗药相关的突变位点，如：Y136F、K147Q、Y137F、L50S等；另外还存在同义突变引起抗性表型变化，例如葡萄白粉中A1119C位点突变，Lynn推测，A1119C突变可能是导致CYP51基因表达量的增加。其中Y136F和K147Q是最常见的抗药突变基因型，前者主要是在葡萄白粉菌和禾谷类白粉菌抗药有关，后者主要与大麦白粉菌高度抗药有关。Y136F突变型是Délye等1997年首次在葡萄白粉菌中检测出来，随后Brown 在大麦和小麦白粉菌也检出Y136F突变位点；同时，Brown等2005年在大麦白粉菌首次检测出高抗的K147Q突变类型。本团队对全国8个小麦种植区采集的小麦白粉菌1098份标样敏感性测定，结果显示：超过90.23%的菌株对三唑酮产生抗性。我们对这1098份标样也进行分子检测，发现大部分抗性菌株的136位点没有突变，这说明还存在未知的抗性位点。申请人选择具有代表性的100个菌株进行全基因组测序，测定100个菌株的表型，通过基因型-表型关联分析，找到了新的抗性位点。同时，比较100个菌的cyp51基因变异，寻找与表型相关的新SNP位点。

目前，有关大麦、小麦白粉菌对三唑类杀菌剂抗性分子检测技术已有很多的报道，包括PCR，Real-time PCR和数字PCR。马忠华等人开发出“小麦白粉病菌对三唑酮抗性频率的快速检测方法（CN101397585 B）”，该方法是基于Y136F位点的SYBR Green 荧光探针检测技术，进行抗性分子检测；Zulak等人采用数字PCR技术对澳大利亚西部的大麦白粉菌对戊唑醇抗药性进行高通量表型鉴定。无论是Real-time、数字PCR，还是CAPS标记, 皆存在通量小、费用高的问题, 无法达到高通量检测的要求, 使其在分子标记辅助选择应用中具有局限性。KASP (kompetitive allelespecific PCR)是具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术, 通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行精准的双等位基因分型, 该技术在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用，而在植物病原微生物的检测上尚没有看到相关报道。

因此，本领域需要开发与小麦抗药性相关的新的分子标记，从而利用该标记用于快速正确评价白粉菌的抗性水平，为抗性监测提供技术支撑，进而为药剂精准防治提供依据。

发明内容：

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一个与小麦抗药性相关的SNP位点，并基于该位点开发了KASP标记专用引物，该KASP标记引物可以用来评价抗性水平，对田间抗性发生动态监测，正确评估田间小麦白粉菌抗性频率具有重要意义。

本发明目是提供一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及其应用，通过关联分析，从cyp51基因中获得与小麦白粉菌抗药性相关的特有SNP位点，标记为CYP51S1-133，该标记CYP51S1-133 SNP位点处碱基为C或T，所述CYP51S1-133SNP使用KASP检测，引物序列为：

Primer_AlleleFAM：TCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAC

Primer_AlleleHEX：CCTTCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAT

Primer_Common：CACGATCGGTGGCTCATTTGGATTT。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

发明人对国内采集的不同生态区100个白粉菌，对其中1个菌株21-2进行从头测序，剩余99个菌株重测序。利用生物信息学分析获得小麦白粉菌cyp51基因的全长（见序列表SEQ ID NO:1）），全长1693bp，两个内含子，长度分别为50bp和52bp，发现存在5个SNPs，对应的位点分别为：T133C、T235A、A407T、A525T和C1326A，其中T133C属于同义突变，对应的单倍型分别为：CYP51133T，CYP51133C/235A，CYP51133C/235T/1326A，CYP51133C/235T/1326C（表1）；和4个氨基酸位点的改变，对应的位点分别为S79T、F136Y、K175N、F442L；对应的氨基酸单倍型为Ⅰ：79T、136F、175N、442F；单倍型Ⅱ：79S、136Y、175K、442L；单倍型Ⅲ：79S、136Y、175K、442F。三种氨基酸单倍型各占的比例分别为：12%，8%和 80%（表2）。单倍型Ⅱ和单倍型Ⅲ未发生Y136F 的突变且有64%属于抗性菌株，也就说明这64%的抗性不能通过cyp51靶基因的变化解释其抗性机理，进一步证明存在其它未知基因控制其抗性。

根据cyp51基因不同的SNP位点进行单倍型分析和聚类，发明人还发现1个该抗药性基因特有SNP位点，T133C，发现表型和基因型存在对应的关系，即133T基因型完全属于敏感菌，133C基因型完全属于抗性菌（见附图1）。为了证实了这一推测，对这100个自然群体菌株进行表型验证，依据抗性水平划分出敏感、低、中和高抗四种表型（见附图3），结果显示133T的菌株对三唑酮的EC₅₀的范围在0.03-0.45mg/L,133C的菌株对三唑酮的EC₅₀的范围在0.81-112.5mg/L。这与我们发现大部分的抗性菌株Y136F没有发生点突变相吻合，这一发现也正好说明，检测Y136F点突变不能完全代表实际生产中小麦白粉菌的抗性频率，基于有Y136F的分子检测将可能会低估了田间实际发生的抗性频率。根据这一发现，发明人开发了1对KASP标记kaspS1-133,利用自然群体验证了该标记的分型结果（见附图3）。

kaspS1-133的引物序列为：

Primer_AlleleFAM：TCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAC（见序列表SEQ ID NO:2）；

Primer_AlleleHEX：CCTTCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAT（见序列表SEQ ID NO:3）；

Primer_Common：CACGATCGGTGGCTCATTTGGATTT（见序列表SEQ ID NO:4）。

表1 小麦白粉菌cyp51基因核苷酸单倍型分布

﹡代表同义突变；﹡﹡代表非同义突变

表2 小麦白粉菌cyp51基因氨基酸单倍型分布

本发明与现有技术相比有以下优点：

1）本发明获得cyp51-133位点的SNP标记，可以准确检测实际抗性水平，反应田间实际抗性频率，较之前报道的Y136F突变类型更为准确和客观。

2）属于KASP标记，具有高通量、操作简便等特点，可用于大规模田间菌株材料的高通量筛选，提高抗性监测的效率。

附图说明

图1 为cyp51基因不同的SNP位点进行单倍型分析和聚类图；

图2为不同抗性水平的小麦白粉菌；

图3为cyp51s1-133标记的KASP分型结果，靠近横轴圆点代表C(抗性菌株）基因型，靠近纵轴圆点代表T（敏感菌株），对角线附近的圆点代表不确定基因型。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做详细描述，但是不用来限制本发明的保护范围。

实施例子1：小麦白粉菌的提取

1）小麦白粉菌孢子的收集：温室隔离培养高感小麦苗至第一叶完全展开，剪取叶片中段，叶片正面朝上放置在琼脂保鲜培养基上，在接种装置内对上述离体叶段接种预先繁殖好的新鲜分生孢子，接种后置于17±l℃，18 h光照条件下培养，待大量产生孢子，置于超净工作台上，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，分生孢子生物量在100-200mg之间为最佳。

2）利用高质量的DNA提取，置于-20℃保存备用：具体提取方法如下：

①收集100-200mg孢子粉（3颗直径3mm不锈钢钢珠放入液氮预冷的2ml的离心管中），研磨器中研磨3次（具体参数：频次30下/秒，时间间隔30秒）；注意：每次研磨之前离心管都要处于液氮保护中。

②加入十二烷基肌氨酸钠300 μL剧烈震荡；加入溶液 B 700 μL剧烈震荡，置于65℃的水浴锅中15-30min；注意：可以在此步骤中取出钢珠，以免被后续的三氯甲烷污染。

③加入氯仿600μL，剧烈震荡，14000rpm离心10min（4℃），收集上清；注意：带上防护手套氯仿操作的过程中。

④加入1倍体积的预冷的异丙醇，大约700μL；颠倒离心管6-8次后，14000rpm离心10min(4℃)，倒掉上清保留沉淀，放置冰上15min，用450μLTE溶解沉淀（300μL已足够）注意：先将异丙醇加入到各管中，全部加完后再依次上下颠倒各离心管6-8次，如果必要，在30℃孵育1h或4℃过夜。

⑤将溶解的核酸片段吸入到AmiconUltra -0.5ml（Millipore，Ultracel型号UFC5030BK,LOT No:R8JA97944），14000rpm离心30min（4℃），弃掉滤液；再加入300μL TE冲洗，直接轻微加到Amicon Ultra -0.5ml,14000 rpm 离心（4℃），将滤器倒置放到新的离心管中，1000rpm 离心1min；注意：如果剩下的液体颜色黑，可以再加450μLTE再次离心。

⑥加入300μLTE和4μL RNAse到富集的DNA管中，37℃孵育1h，然后加入300μL酚-氯仿混匀6-8次，14000rpm离心10min(4℃)，转移上清到新离心管中（300μL），加入2.5倍体积的100%无水乙醇（大约750μL）和0.01体积3M醋酸钠（大约3μL），-20℃过夜。

⑦15000rpm离心30min(4℃)，加入450μL70%无水乙醇，13000rpm 离心10min(18℃)，倒掉乙醇，在冰上干燥沉淀15min(最长不超过30min)，加入30-50μLTE或去离子水重悬沉淀；

3)DNA质量的检测：采用Nanodrop one检测核酸质量，经过检测样品浓度≥135ng/μL（表3）

表3 40个待测样品DNA浓度检测结果

实施例子2：cyp51基因133位点引物设计

根据发明内容中找到的cyp51基因SNP位点133，利用Primer 5.0,将这些SNP位点转化成KASP检测标记，设计时剔除有发夹结构的，引物间能形成引物二聚体、上下游引物之间Tm值超过3℃的标记，共设计16个，通过在随机检测样本中进行基因分型，有1个KASP检测标记能够很好的区分各个体的基因型。

实施例子3：引物稀释与KASP检测引物混合

将三条引物用Tris HCL稀释到100um后，按照体积比AlleleFAM：AlleleHEX：Common：Tris HCL=6:6:15:23的比例混合，分装后于-20℃保存，作为KASP检测引物。

实施例子4：PCR扩增体系和程序

PCR反应体系：依下表在冰上配制体系，KASP引物由（Laboratory of theGovernment Chemist 有限公司提供）

反应物	体积
		DNA模版（20ng/ul）	3ul
2X master mix	3ul
		Kasp引物	0.0825ul
总和	6.0825ul

PCR反应条件:

1）94℃预变性5min；

2）94℃变性20s;

3）65℃退火30s，步骤2）-3）循环10次，每个循环退火温度降低0.8℃；

4）94℃变性20s;

5）57℃退火30s，步骤4）-5）循环38次；

6）4℃保存。

实施例子5：结果分析

利用ABI Quant Studion TM 12K Flex实时荧光定量PCR系统对扩增好的PCR体系进行SNP分布结果的收集，如图3所示，其中横轴为抗药性基因型，纵轴为敏感性基因型。对自然群体40个菌株进行检测，cyp51s1-133标记的KASP分型结果，靠近横轴圆点代表C(抗性菌株）基因型25个，靠近纵轴圆点代表T（敏感菌株）13，对角线附近的圆点代表不确定基因型2个，可能是由于模版原因造成。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本清的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO:1

<110>湖北省农业科学院植保土肥研究所

<120>一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及其应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1693

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgggaatac cagaaagctt tatgtctccatacttgcagc cgttgctcca attcggcttt 60

agcattgcgt tggctagtgg aattataagtttattattac tattaacctt cttgaatgta 120

ttgaagcagc tactattcaa aaatccaaatgagccaccga tcgtgtttca ttggattcct 180

atcattggta gtacaatttc atatggaatgaatccctata aattctttca tgaatcccaa 240

gccaaggtca gttgccattg atatattctggggaacacga aattaattga agtaaagtac 300

ggaaatattt tcactttcat attactgggtaaaaagacga cagtatatct aggtcgacag 360

ggaaacaatt ttattcttaa tggaaaactgagggatgtta atgctgaaga agtttattca 420

gtcttaacga ctcctgtctt cgggactgatgtagtgtttg actgtcctaa ttcaaaatta 480

atggaacaaa agaaggttat aaaatcatatggataacttt cagtatcaga ttctgatatt 540

tgcacagttc atgaaagcag cccttacaactgaggccttc cgctcttatg tacctatcat 600

ccaaaatgaa gtggagagct ttataaaaaaatgcgacgat tttcgaaaat cagaaggtat 660

catcaatatc gctgccgtaa tggctgaaattacgatatat accgcttcac acaccctaca 720

aggaaaagag gttcgcgata gatttgattcttctttggca gttttgtatc atgacctaga 780

tatgggcttt accccaatca atttcatgcttcactgggca ccacttccgc acaatcgagc 840

tcgtgatcat gcccaacgga cagtcgcaaaaatatacatg gagattatca acagccgtcg 900

gacgcagaaa gaaactgata attccaatttagatatcatg tggcaattaa tgcgctcttc 960

ctacaaagat ggcactcccg taccggataaagaaattgca catatgatga tcgcgctcct 1020

gatggctggg caacattctt cgtcctcgtccagcacatgg atcatgctgt ggcttgctgc 1080

tcgaccagat atcactgaag aactctaccaagaacagcta gaaatattgg gatcagaatt 1140

acctcctgtt aaatatgaag atctctcgaaacttactctg catcaaaatg tagtgaaaga 1200

ggtcctccgt ctgcatgctc ccatacattcgatcttacga aaagtaaaga atccaatgcc 1260

cgttccagga actagttatg taatacctaagaccaattct ctcttggcgg cccctgggtg 1320

gacaagtcga gacgcctcat acttccctaatccgcttacg tgggacccac atcgttggga 1380

cactggatct agtggggtga taggcacggatatggaggat gaaaaattcg actatgggta 1440

tggattaatt agcacagggg cagcaagcccttacttaccg tttggggccg gacggcatcg 1500

ctgcataggc gagcagtttg caacggtgcaattagttaca atcatggcca ccatggttcg 1560

cagtttcaag tttcacaacc ttgacggaagggagggcgtt gccgaaactg attactcaag 1620

tatgttttct cggccaatgg cacctgccataattgcatgg gagaagaggg acaaaaagga 1680

taaaacggattgt1693

SEQ ID NO:2

<210>2

<211>24

<212>DNA

<400>2

tcttgaatgt attgaagcagctac24

SEQ ID NO:3

<210>3

<211>27

<212>DNA

<400>3

ccttcttgaa tgtattgaagcagctat27

EQ ID NO:4

<210>4

<211>25

<212>DNA

<400>4

cacgatcggt ggctcatttg gattt 25

SEQ ID NO:1

<110> 湖北省农业科学院植保土肥研究所

<120> 一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1693

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggaatac cagaaagctt tatgtctcca tacttgcagc cgttgctcca attcggcttt 60

agcattgcgt tggctagtgg aattataagt ttattattac tattaacctt cttgaatgta 120

ttgaagcagc tactattcaa aaatccaaat gagccaccga tcgtgtttca ttggattcct 180

atcattggta gtacaatttc atatggaatg aatccctata aattctttca tgaatcccaa 240

gccaaggtca gttgccattg atatattctg gggaacacga aattaattga agtaaagtac 300

ggaaatattt tcactttcat attactgggt aaaaagacga cagtatatct aggtcgacag 360

ggaaacaatt ttattcttaa tggaaaactg agggatgtta atgctgaaga agtttattca 420

gtcttaacga ctcctgtctt cgggactgat gtagtgtttg actgtcctaa ttcaaaatta 480

atggaacaaa agaaggttat aaaatcatat ggataacttt cagtatcaga ttctgatatt 540

tgcacagttc atgaaagcag cccttacaac tgaggccttc cgctcttatg tacctatcat 600

ccaaaatgaa gtggagagct ttataaaaaa atgcgacgat tttcgaaaat cagaaggtat 660

catcaatatc gctgccgtaa tggctgaaat tacgatatat accgcttcac acaccctaca 720

aggaaaagag gttcgcgata gatttgattc ttctttggca gttttgtatc atgacctaga 780

tatgggcttt accccaatca atttcatgct tcactgggca ccacttccgc acaatcgagc 840

tcgtgatcat gcccaacgga cagtcgcaaa aatatacatg gagattatca acagccgtcg 900

gacgcagaaa gaaactgata attccaattt agatatcatg tggcaattaa tgcgctcttc 960

ctacaaagat ggcactcccg taccggataa agaaattgca catatgatga tcgcgctcct 1020

gatggctggg caacattctt cgtcctcgtc cagcacatgg atcatgctgt ggcttgctgc 1080

tcgaccagat atcactgaag aactctacca agaacagcta gaaatattgg gatcagaatt 1140

acctcctgtt aaatatgaag atctctcgaa acttactctg catcaaaatg tagtgaaaga 1200

ggtcctccgt ctgcatgctc ccatacattc gatcttacga aaagtaaaga atccaatgcc 1260

cgttccagga actagttatg taatacctaa gaccaattct ctcttggcgg cccctgggtg 1320

gacaagtcga gacgcctcat acttccctaa tccgcttacg tgggacccac atcgttggga 1380

cactggatct agtggggtga taggcacgga tatggaggat gaaaaattcg actatgggta 1440

tggattaatt agcacagggg cagcaagccc ttacttaccg tttggggccg gacggcatcg 1500

ctgcataggc gagcagtttg caacggtgca attagttaca atcatggcca ccatggttcg 1560

cagtttcaag tttcacaacc ttgacggaag ggagggcgtt gccgaaactg attactcaag 1620

tatgttttct cggccaatgg cacctgccat aattgcatgg gagaagaggg acaaaaagga 1680

taaaacggat tgt 1693

SEQ ID NO:2

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<400> 2

tcttgaatgt attgaagcag ctac 24

SEQ ID NO:3

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<400> 3

ccttcttgaa tgtattgaag cagctat 27

EQ ID NO:4

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<400> 4

cacgatcggt ggctcatttg gattt 25

Claims

1.一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记，其特征在于：从基因cyp51中获得1个与小麦白粉菌抗药性相关的特有KASP标记，标记为CYP51S1-133；所述CYP51S1-133使用KASP检测，引物序列为：

Primer_AlleleFAM：TCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAC

Primer_AlleleHEX：CCTTCTTGAATGTATTGAAGCAGCTAT

Primer_Common：CACGATCGGTGGCTCATTTGGATTT。

2.如权利要求1所述的一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记，其特征在于：所述KASP检测包括如下步骤：

（1）提取待测小麦白粉菌样品的DNA;

（2）取浓度为20ng/ul的模版DNA3μl,SEQ IDNO.2-4所示混合引物0.0825

μl,2XMasterMix 3μl，进行PCR扩增；

（3）采用荧光检测仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型。

3.如权利要求2所述的一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记，其特征在于：所述步骤（2）中PCR扩增的条件为：

1）94℃预变性5min；

2）94℃变性20s；

3）65℃退火30s,步骤2）-3）循环10次，每个循环退火温度降低0.8℃；

4）94℃变性20s；

5）57℃退火30s,步骤4）-5）循环38次；

6）4℃保存。

4.一种与小麦白粉菌抗药性相关的KASP标记的应用，其特征在于：所述标记CYP51S1-133 可用于小麦白粉菌对三唑酮抗药性的检测。