CN103060455A - 一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物工程类检测产品及其用途。具体说是一种幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片,该芯片能同时检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G、喹诺酮耐药突变位点Asn87(N87K)和Asp91(D91G/Y/N)和人细胞色素酶CYP450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)位点的多态性。该芯片检测法快速、准确,可进行幽门螺杆菌病原的鉴定、克拉霉素及喹诺酮耐药分析以及质子泵抑制剂代谢个体化差异的分析,用于指导幽门螺杆菌感染“三联法”治疗的个体化用药。
Description
技术领域
本发明涉及一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片及应用,涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。是一种用于幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片,可同时对人基因组CYP4502C19*2,CYP4502C19*3多态性和幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮类耐药位点进行检测。
背景技术
幽门螺杆菌(H.pylori,HP)是WHO国际癌症研究机构确定的I类致癌因子。我国HP感染率为40%-90%,平均为59%,属于HP相关疾病的重灾区。HP感染是引起慢性胃炎以及导致消化性溃疡发生和复发的重要原因,且与低度恶性胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生、发展密切相关。研究表明,幽门螺杆菌感染为胃癌发生的病因,对幽门螺杆菌的根除可明显降低人群胃癌的发生风险。然而HP耐药是一个全球性问题,是HP根治率下降的主要原因。以质子泵抑制剂(PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或甲硝唑)的三联疗法,是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合[6]。喹诺酮类药物是HP根治的二线药物。抗HP治疗的疗效主要受到以下两个因素影响:一是由于近年来抗生素的滥用,克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮耐药不断上升,使得三联疗法中的克拉霉素或喹诺酮类药物的有效率下降;另外一个影响三联疗法用药成功率的重要影响因素是PPI抑制剂的使用。PPI代谢与人细胞色素P450(CYP450)同工酶CYP2C19密切相关,CYP2C19的基因多态性型决定了PPI在人体内的代谢速度(强代谢、中代谢和弱代谢)[7;8]。因此,在使用三联疗法之前,如果能够提供准确的克拉霉素或甲硝唑、喹诺酮药敏结果和CYP2C19的类型,针对性地选择药物进行个体化用药,则能够保证治疗成功率,同时减少抗生素滥用带来的不良反应和资源浪费。
HP克拉霉素、喹诺酮耐药及人CYP450基因多态性主要是由于相关基因的单核苷酸多态性(SNP)导致的。针对基因分型的检测,传统的培养和药敏方法,对实验室和操作人员的要求高,实验耗时长(约1周),工作量大,且上述方法并不能提供人CYP450多态性信息,因此限制了其在实际中的应用。PCR等快速检测方法灵敏度高、特异性强,但检测通量较低,一次仅能检测2-3个靶点,也不能完全满足临床实际需要。同样,测序技术虽然为我们提供了方便、快捷的检测方法,但其需要昂贵的仪器,而且检测灵敏度也远远不及芯片技术。基因芯片技术是近年来出现的一种程序化、规模化的基因结构分析与表达研究的新技术,可同时进行单基因多位点或多基因多位点的多态性分型检测,具有信息量大、灵敏度高、平行快速检测等特点。一旦前期研究工作完成得到成熟的基因芯片产品(检测探针与杂交反应条件确定),即可实现一次对成千上万个等位基因进行基因分型的程序化与常规化,这是其他基因分型技术无法比拟的优越性所在。
基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。DNA芯片的制备方法主要有两种:一种是直接在固定面上原位化学合成一系列寡核苷酸,另一种是将预先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式点样、固定在固相面上。制备好的芯片通过化学处理后即可进行杂交反应。病原微生物,包括细菌、病毒的基因序列研究逐步测出,为其分析提供了一个很好的切入点,二基因芯片又为检测和平行研究病原微生物提供了有力的工具。将基因芯片技术用于疾病的诊断预测已成为全球研究的热点,并已研制成功检测部分细菌等微生物的基因芯片。基因芯片技术用于疾病诊断预测的优点有以下几个方面:一是高度的灵敏和准确性,用样本极少;二是快速简便、时间短;三是可同时检测多人的多种疾病。鉴于生物芯片技术具有巨大的理论意义和实际应用价值,我国一些科研实力较雄厚的单位已开展了这方面的研究工作。然而,国内实用芯片研究多刚刚起步,截至目前,国内外尚未见用于针对我国人群的幽门螺杆菌感染个体化治疗的快速基因检测芯片。
发明内容
本发明是建立一种用于幽门螺杆菌感染个体化治疗的检测型基因芯片,这种芯片能不经培养在一次实验中同时检测人基因组CYP4502C19*2,CYP4502C19*3多态性和幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮类耐药位点。通过分析筛选人基因组CYP4502C19*2,CYP4502C19*3的DNA及幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类耐药位点DNA序列,分别设计不同的寡核苷酸片段,建立了包括检测及鉴定基因芯片技术在内的综合分析检测方法,以期达到快速、准确、特异的检测目的,并进行应用。
全球有超过半数的人感染HP,80%-90%感染者有临床症状,10%-15%发展为消化性溃疡,1%-2%发展为恶性肿瘤。幽门螺杆菌与消化道疾病的关系已经被广泛接受,对HP进行根除可以治愈其引起的疾病,并能避免发展为更严重的疾病,有着重大的社会应用前景。
本发明主要针对幽门螺杆菌感染个体化治疗,通过分析筛选人基因组CYP4502C19*2,CYP4502C19*3的DNA及幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类耐药位点DNA序列,分别设计不同的寡核苷酸片段,建立了包括检测及鉴定基因芯片技术在内的综合分析检测方法,以期达到快速、准确、特异的检测目的,并进行了应用。除研制出能同时给出人基因组CYP4502C19*2、CYP4502C19*3多态性及幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮耐药信息的基因芯片,还为更多的细菌性疾病的分子生物学检测和鉴定以及防制建立了理论和技术基础。
一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片,其特征在于芯片包括(1)幽门螺杆菌23s基因上的克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(2)幽门螺杆菌gyrA基因上的喹诺酮耐药突变位点Asn87(N87K)和Asp91(D91G/Y/N)对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(3)人细胞色素酶CYP450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(4)芯片质量控制寡核苷酸探针;(5)寡核苷酸探针固化在载体材料上形成的探针阵列。
所谓的幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片是指同时检测人CYP450代谢相关基因2C192、2C193的基因类型以及幽门螺杆菌对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药基因型的寡核苷酸阵列;
所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚寡核苷酸,长度十到五十个碱基;
所谓的质量控制探针至少包括两种探针,即阳性对照,阴性对照:阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位,阴性对照用于检测杂交信号错误或污染;
所谓的载体材料包括玻片、金属片、硅片、硝酸纤维素膜。
该检测型基因芯片特征在于设计选择了幽门螺杆菌23s基因上的克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野生型和突变型、幽门螺杆菌gyrA基因上的喹诺酮耐药突变位点Asn87(N87K)和Asp91(D91G/Y/N)对应的野生型和突变型、人细胞色素酶CYP450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)对应的野生型和突变型共15条SNP分型寡核苷酸探针。
设计了多组对上述靶基因进行检测的高特异性的扩增引物,其设计原则为每一个引物必须在对应的靶基因的高度特异性部位,每对引物的扩增区域为靶基因的特征序列;引物包括了针对芯片检测所需的聚合酶链反应(PCR)、多重聚合酶链反应、常规PCR、不对称PCR等特异性引物,每一对特异性引物能够扩增出对应靶基因片段。
这些探针的固相载体材料包括玻片、金属片、硅片、硝酸纤维素膜等。
这些固相载体表面以具有双活性基因的长链有机化合物进行修饰,常用的具有双活性基团的长链有机化合物试剂有:戊二醛、三羟甲基氨基硅烷(APTES)、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸,可采用其中的一种或其中的两种组合。
扩增的PCR产物可通过标记荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素的引物进行标记等,也可在基因扩增过程中加入荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素等标记的dUTP或dCTP。
该检测型基因芯片,能在幽门螺杆菌感染“三联法”治疗用药前的检测、诊断、监测中应用。可用于质子泵抑制剂代谢、克拉霉素及喹诺酮耐药情况的检测。
我们在查阅历年来大量文献的基础上,从GeneBank获取人CYP2C19*2、CYP2C19*3和幽门螺杆菌的核苷酸序列,采用Clustalx1.8.msw Alignment软件进行同源性比对分析,确定相对保守区,结合了Primer Premier5.0等专业用语PCR测序引物设计和评估的分析软件,再应用NCBI的BLAST程序进行筛选,结合扩增要求和引物筛选要求,进行了PCR引物设计。
基因芯片中应用的探针为核酸分子探针,是已知的特定序列的核酸片段,能与互补的核酸序列发生分子杂交,因此可以利用探针杂交技术来检测样品中特定基因的特征片段和或测定位置基因的序列。针对靶基因组的特征性片段、染色体DNA的序列多态性、基因变异的位点及特征等,设计和选择合适的核酸探针并制成芯片。通过与样品中提取的核酸(DNA)杂交,一步检测就可以获得人CYP450代谢相关基因2C19*2、2C19*3的代谢信息以及幽门螺杆菌对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药信息。
根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、肽核酸探针和寡核苷酸探针等。寡核苷酸探针的优点是可以根据需要来随心所欲地调整和合成相应的序列,避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响。寡核苷酸探针具有以下特点:探针长度一般为10~50bp,并且由于序列的复杂性低,杂交所需的时间较短。寡核苷酸探针还可以用于检测个别碱基的变异,用于单核苷酸多态性(SNP)分析。
我们采用了合成寡核苷酸探针的方法。探针选择的正确与否,将会直接影响杂交结果的分析。选择探针最基本的原则上应具有高度特异性,同时考虑Tm值、碱基数目和制作的方便等因素。
探针设计的原则如下:
(1)高度的特异性和敏感性:筛选出的探针应该位于特异性引物扩增序列中的高保守区,以保证探针的特异性和敏感性;同时,筛选的探针应该与其他细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低,以避免假阳性结果;分型探针无交叉反应。寻找和筛选出高度特异性的探针,这是至关重要的。
(2)探针的Tm值尽可能一致:因为在一张芯片上要同时进行多个探针的杂交反应,在一定的温度下,此时各探针Tm值至关重要,如果Tm值不一致,差距过大,杂交后的信号强弱会受到相当的影响。一般Tm值相差小于三度比较适宜。
(3)筛选的探针尽可能避免二级结构:探针一个最好没有发夹结构、自身二聚体、错配等。否则容易形成错误的结果。
(4)尽量避免选取C、G富集区域的序列作探针。
(5)各探针的互补序列之间不形成二聚体和错配等。
从Gene Bank调出所需的基因序列,比较同一靶基因序列有无存在变异的情况。确定要扩增的靶基因片段及引物后,根据上述探针设计的原则,用Primer Primer5.0等生物学软件在所需基因的碱基对齐图上PCR扩增区域内寻找出所有可能的探针,结合Clustalx1.8.mswAlignment等同源性分析软件找出特定靶基因序列扩增区域内的高度保守区和各自特异性序列,在特定的扩增片段内的高度保守区,并且具有属、种特异性结构的序列作为分型探针。登录美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)选择核酸序列的BLAST,进行数据库类似检索,在核酸扩增区域内筛选的探针与已知的其它常见细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低,Tm值平均近似60,G+C含量约为50%,根据Blast结果,再结合需求和经验,手工对筛出的探针进行微调和修整。在后面实际的芯片杂交检测中,根据总体需要和检测结果,调整了部分使用的探针。
选择醛基修饰载玻片为芯片的载体,玻片为国产优质醛基片。
将合成的探针溶于特制点样液内,采用芯片点样仪点样。将15条探针、1条阴性对照探针和一条阳性质控探针设计形成一个点样阵列,每个玻片有10各相同的点样阵列。除阳性质控探针外每条探针点3各点,在阵列上方平行点8个阳性质控探针点。点样完毕,芯片常温干燥保存备用。
为了洗脱芯片上未与醛基结合的寡核苷酸,将芯片依次用洗脱液和ddH2O冲洗后,自然干燥后即可投入使用。
我们收集样本,测试比较并优化了各种被检样本的处理方法,建立了快速提取高质量目的DNA片段的标准操作程序。相同的样本尽量采取相同的处理方法。针对所需片段基因,设计了相应的PCR扩增方法:在95℃,变性15分钟;然后95℃,30秒;65℃,1min;这样运行44个循环;最后在72℃,延伸5分钟。杂交和洗涤方法:将PCR产物与杂交液混合,加到所述的芯片上在45℃水浴锅中杂交1小时后洗涤;然后加入Streptavidin-Nanogold37℃反应30min后洗涤,置室温晾干。显色方法:将银染试剂A液和B液等体积混合,加到芯片上,待芯片上出现肉眼可见的灰色或黑色圆点后停止显色,用去离子水清洗,晾干。
实验结果表明,制备的幽门螺杆菌感染个体化治疗检测芯片未见有非特异性的交叉反应。对多份样品进行检测,均显示了较好的特异性和敏感性。与测序技术及荧光定量PCR方法相比,此方法可在一次实验中同时分析幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮耐药位点和PPI代谢相关人CYP2C19的基因多态性,提高了检测效率。同时,此方法的准确性与测序技术相同,而检测灵敏度则远远高于基因测序技术,能够检测到患者胃部少量的幽门螺杆菌,在感染初期发现细菌,以便在早期采取相应的治疗措施。与传统的药敏培养检测技术相比,可视化基因芯片检测技术能不经培养,在6小时内给出准确可靠的结果,相对药敏培养的6~7天,可以大量节省了工作人员及患者的等待时间,为及时治疗争取宝贵的时间。
本发明的优点
(1)高特异性:芯片检测的特异性是经过双重筛选的,与测序结果特异性一致;
(2)对样品的高通量检测和多样品的平行检测:能同时给出人CYP450代谢相关基因2C19*2、2C19*3的代谢信息以及幽门螺杆菌对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药信息;
(3)高灵敏度和可靠性:检测芯片是分子杂交技术和生物素标记技术相结合的新型分子诊断方法,并且在模板和探针杂交时,反应条件和反应体积完全一致,消除了实验过程中人为的和其它误差;
(4)检测时间短,耗样量少,反应体积小,适合于临床检测的需要;
(5)重现性好。
附图说明
图1:幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片最终的探针阵列图。图中一个圆点代表探针的一次点样,垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。虚线框内的圆点为15种特异性探针,最后一条为空白对照。虚线框外的圆点为标识列。
图2:幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片特异性评价结果图。图中1为克拉霉素2142W-2143W,喹诺酮87-WC,喹诺酮91-MG;2为克拉霉素2142W-2143M,喹诺酮87-MG,喹诺酮91-W;3克拉霉素2142M-2143W,喹诺酮87-MA,喹诺酮91-W;4为克拉霉素2142W-2143M,喹诺酮87-WT,喹诺酮91-MA;5为CYP450-2C19*2W,CYP450-2C19*3W;6为CYP450-2C19*2M,CYP450-2C19*3M。
图3:幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片灵敏度检测分析结果图。以幽门螺杆菌耐药基因检测位点克拉霉素2142W-2143M,喹诺酮87-WT,喹诺酮91-MA及人基因组CYP4502C19*2-W,CYP4502C19*3-W为例,其中图中A-I代表其灵敏度评价结果。A-I依次表示幽门螺杆菌102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml、阻性对照,人基因组10ng/μl、5ng/μl、2ng/μl、阴性对照。
具体实施方式
一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片,包括了模板的处理和扩增;寡核苷酸探针及其固化;检测和分析等。
实施例一:一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片的制备
1.制备特异引物
选择幽门螺杆菌23s基因克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G;幽门螺杆菌gyrA基因上的喹诺酮耐药灾变位点Ash87、Asp91;选择人细胞色素酶CYP450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)作为检测靶
标进行特异性引物设计(见表1)。所有下游引物5’端标记生物素。
表1特异性引物及其对应的扩增靶基因种类
2.设计并筛选人质子泵抑制剂代谢相关位点及幽门螺杆菌耐药位点探针
针对A2142G、A2143G、N87K、D91G/Y/N、G681A、G636A分别设计野生型和突变型SNP分型探针(如表2所示)。同时设计片基质控探针、阴性对照和阳性对照探针。所有寡核苷酸探针3’段进行氨基修饰。
表2特异性探针序列及对应的靶基因
3.制备寡核苷酸芯片
将合成的寡核苷酸探针冻干粉中加入适当的无菌注射用水溶解,用去离子水作为空白对照,UV测浓度,读取OD260数值后,按1OD=33μg/ml计算探针浓度,将各个探针用灭菌注射用水稀释至100μM,待用。点样时,寡核苷酸探针用2×点样液(6×SSC,0.1%SDS)稀释至终浓度50μM,取20μl转移至384孔板。用基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上,点样仪内保持温度为23℃,相对湿度大于85%。寡核苷酸芯片制备完毕后,使用前至少在室温放置干燥18小时,待用。芯片寡核苷酸探针阵列中分别包括人细胞色素酶P450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)和幽门螺杆菌耐药检测探针,其探针在芯片上排布阵列如表3所示。
表3寡核苷酸探针阵列
片基质控 | 片基质控 | 片基质控 | 片基质控 | 片基质控 | 片基质控 | 片基质控 | 片基质控 |
2C192W | 2C192M | 2C193W | 2C193M | 42W43W | 42M43W | 42W43M | 42M43M |
2C192W | 2C192M | 2C193W | 2C193M | 42W43W | 42M43W | 42W43M | 42M43M |
2C192W | 2C192M | 2C193W | 2C193M | 42W43W | 42M43W | 42W43M | 42M43M |
87WT | 87WC | 87MA | 87MG | 91W | 91MG | 91MA | H2O |
87WT | 87WC | 87MA | 87MG | 91W | 91MG | 91MA | H2O |
87WT | 87WC | 87MA | 87MG | 91W | 91MG | 91MA | H2O |
4.提取幽门螺杆菌和人基因组DNA
将胃粘膜吸入干净0.5ul EP管中,加入50ul DNA提取液(货号:S070001,深圳市瑞康生物技术有限公司),100℃煮沸10min,4℃放置30min;然后室温13000rpm离心2min,取上清放入新EP管中,-20℃冻存备用。
5.制备检测参考品
为了筛选质子泵抑制剂代谢相关位点和幽门螺杆菌耐药突变检测探针,通过对人基因组DNA和幽门螺杆菌菌株DNA扩增后测序,制备了4种类型的人基因组DNA参考品和4种类型幽门螺杆菌DNA参考品。每种参考品梯度稀释制备灵敏度参考品。
6.建立并优化PCR体系
PCR体系为一管四重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。2C19*2上下游引物终浓度为0.12μM∶1.2μM;2C19*3上下游引物终浓度为0.12μM∶1.2μM,23s上下游引物终浓度为0.1μM∶0.1Mm;23s,gyrA上下游引物终浓度为0.2μM∶0.2μMHotMasterTaq DNA Polymcrase酶用量为2.5U/体系时,参考品的探针灰度值较强,且幽门螺杆菌低拷贝模板103CFU/ml、人基因组低拷贝模板2ng/μl时仍然可以检出。最终确定的PCR体系如表4所示。优选的PCR扩增条件为:95℃,变性15分钟;然后95℃,30秒;65℃,1min;运行44个循环;最后在72℃,延伸5分钟。
表4PCR体系配方
7.建立并优化杂交体系
合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合,杂交液各成分终浓度为4×SSC,0.3%SDS,5%甲酰胺,16μM20T-NH2。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC,0.2%SDS),洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
8.制备可视化检测试剂及建立显色方法
在芯片每个杂交区加入按1∶40比例稀释的Streptavidin-Nanogold10μl,稀释液成分:1×PBS+0.1%BSA,37℃放置30min;取出后用PBST洗液清洗20s,重复三次,用去离子水冲洗,置室温晾干。后将银染试剂A液(醋酸银的水溶液,浓度4mg/mL)和B液(氢醌的柠檬酸缓冲液溶液,浓度10mg/mL)等体积混合,每个杂交区立即避光加入30ul的A、B混合液,待芯片上出现肉眼可见的灰色或黑色圆点后停止显色,用去离子水清洗,晾干。
实施例2:基因芯片阳性判定标准的确定
所有结果判断以软件计算的信号值为准,信号值反映的是探针的灰度值。芯片中片基质控点、阴性质控点及人基因组和幽门螺杆菌各耐药位点探针的阳性值判读标准均根据统计学方法计算得到。对于CYP450-2C19*2的两条探针(2C19*2-W和2C19*2M)当某一条探针的平均灰度值为另一条的两倍及以上时,则判断此条探针为阳性;当两者平均灰度值比值小于2时,则判断此位点为杂合。CYP450-2C19*3的两条探针(2C19*3-W和2C19*3M)判读标准同于CYP450-2C192。对于克拉霉素耐药位点的4条探针(42W-43W,42M-43W,42W-43M和42M-43M)当某一条探针的平均灰度值为另三条的两倍及以上时,则判断此条探针为阳性。对于喹诺酮耐药位点87的四条探针(87WT,87WC,87MA和87MG)判读标准同于克拉霉素耐药位点的探针。对于喹诺酮耐药位点91的三条探针(91W,91MG和91MA)判读标准也同于克拉霉素耐药位点的探针。
实施例3:幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片特异性评价
特异性是诊断方法最重要的考核指标,本发明使用优化好的体系和条件,检测了各种常见变异情况的菌株和人基因组,芯片检测结果见附图2。由图可以看出,利用本发明可以将常见变异情况的菌株和人基因组正确区分,特异性良好。
实施例4:幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片灵敏度评价
为了评价芯片各检测探针的灵敏度,我们将经培养的不同基因型的4株幽门螺杆菌菌株及构建的人基因组靶基因质粒作为参考品。以人基因组DNA为模板,使用对应的引物(下游引物为标记)进行RT-PCR扩增,产物经过纯化后使用T4DNA连接酶连接至PGM-Tvector(TIANGEN),转化感受态大肠杆菌DH5α(TIANGEN),用质粒提取试剂盒(TIANGEN)提取质粒,经测序验证重组质粒序列正确。共制备了4种含有靶基因的人基因组质粒DNA参考品。用无RNase酶的水分别溶解相应的幽门螺杆菌菌株和人基因组质粒后定量待用,分装并于-70℃保存,作为DNA参考品。每种DNA参考品梯度稀释制备灵敏度参考品。
使用幽门螺杆菌菌株和人基因组质粒灵敏度参考品对芯片的检测灵敏度进行了评价,结果发现芯片对每种菌株均能够检测到103CFU/ml体系的质粒DNA,对人基因组DNA能够检测到2ng/μl体系的质粒DNA。以克拉霉素2142W-2143M,喹诺酮87-WT,喹诺酮91-MA及人基因组CYP4502C19*2-W,CYP4502C19*3-W为例,选择102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml的幽门螺杆菌和10ng/μl、5ng/μl、2ng/μl人基因组DNA及阴性对照进行芯片检测,结果见附图3,由图可以看出,芯片能够检测到103CFU/ml的幽门螺杆菌和2ng/μl质粒DNA。
除上述实施例外,本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均在本发明要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片,其特征在于芯片包括(1)幽门螺杆菌23s基因上的克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(2)幽门螺杆菌gyrA基因上的喹诺酮耐药突变位点Asn87(N87K)和Asp91(D91G/Y/N)对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(3)人细胞色素酶CYP450上质子泵抑制剂代谢相关的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)对应的野生型和突变型SNP分型寡核苷酸探针;(4)芯片质量控制寡核苷酸探针;(5)寡核苷酸探针固化在载体材料上形成的探针阵列。
所谓的幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片是指同时检测人CYP450代谢相关基因2C192、2C193的基因类型以及幽门螺杆菌对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药基因型的寡核苷酸阵列;
所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚寡核苷酸,长度十到五十个碱基;
所谓的质量控制探针至少包括两种探针,即阳性对照,阴性对照:阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位,阴性对照用于检测杂交信号错误或污染;
所谓的载体材料包括玻片、金属片、硅片、硝酸纤维素膜;
SNP分型对应的15条基因探针如下表所示:
表1.特异性探针序列
2.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)设计SNP分型探针:以幽门螺杆菌23s基因和gyrA基因以及人细胞色素酶CYP450基因为靶,从中选取权利要求1所述的探针序列;
2)合成探针:使用DNA合成仪合成;
3)探针处理:在3’或5’末端加上polyT尾巴,并进行氨基修饰,使它能够固化在基质上;
4)基因芯片的制备:使用点样仪在基质上按预先设定好的顺序进行点样;
5)将点好的芯片在室温放置干燥18小时以上,使探针牢固固定在基质上。
3.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片的使用方法,其特征在于包括如下步骤:
1)核酸提取:将胃粘膜标本按提供的试剂盒提取以获得细菌DNA和人基因组DNA备用;
2)PCR扩增标记样品:PCR扩增:在PCR反应管仲加入PCR待反应物、处理好的标本和标记引物,按如下程序进行PCR扩增:
在95℃,变性15分钟;然后95℃,30秒;65℃,1min;这样运行44个循环;最后在72℃,延伸5分钟;
3)杂交和洗涤:将PCR产物与杂交液混合,加到所述的芯片上在45℃水浴锅中杂交1小时后洗涤;然后加入Streptavidin-Nanogold37℃反应30min后洗涤,置室温晾干。
4)显色:将银染试剂A液和B液等体积混合,加到芯片上,待芯片上出现肉眼可见的灰色或黑色圆点后停止显色,用去离子水清洗,晾干。
4.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌感染个体化治疗检测基因芯片在幽门螺杆菌病原的鉴定、克拉霉素及喹诺酮耐药分析和指导质子泵抑制剂个体化用药中的应用。
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