CN101481730A - 一种检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的基因芯片及其套组和方法 - Google Patents
一种检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的基因芯片及其套组和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可判断幽门螺杆菌毒力型以及耐药基因型的基因芯片及其套组和检测方法。它是利用PCR扩增将核酸样品中含有的靶序列标记上标记物,利用特异探针与靶序列的杂交作用,使基因芯片上该特异探针点位置上积聚标记物,从而使该点可被特异地检出。经过扫描仪观察杂交结果并对照基因芯片点阵排布图进行分析,便可获得样品的相关基因型信息。这种方法具有基因芯片的高度并行性、多样性、操作简便、结果可靠等特点,可省去繁琐的培养法药敏检测过程以及昂贵的药敏试纸条,检测快捷经济,在临床诊断和科研领域都具有强大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域的体外诊断技术和检测领域,更具体地,涉及一种基因芯片,以及包括该芯片的检测幽门螺杆菌毒力型以及耐药基因型的寡核苷酸芯片套组和方法。
背景技术
幽门螺杆菌全世界人群感染率高达50%我国的感染率达60%-90%,而在活动性慢性胃炎、消化性溃疡病人中的幽门螺杆菌感染率更是达到98%和100%。研究表明幽门螺杆菌是消化性溃疡、慢性胃炎、胃部恶性肿瘤的高危致病因素。而且学者们还发现,幽门螺杆菌的毒力基因决定其毒力强弱,从而导致不同程度的临床症状,直接影响诊治及预后。研究表明,感染幽门螺杆菌的CagA+患者胃中幽门螺杆菌的定植密度是CagA-患者的5倍多,可以增加多核细胞的浸润,诱导胃上皮细胞分泌过多的炎症因子,因此对胃粘膜上皮造成更大的损伤。同时反复的炎症可刺激胃酸分泌过多,诱导胃溃疡的发生。另外,VacA也是幽门螺杆菌的重要致病因子,其致病机制主要是通过受体介导的内吞作用进入细胞内,引起晚期溶酶体与胞内体的融合和积累,导致细胞内空泡样变性,同时还可使细胞间的紧密连接松弛,增强极化上皮单层细胞的渗透性,导致细胞死亡,另外还可抑制细胞增殖。并认为胃溃疡和胃癌与其s1型、m1型VacA显著相关,十二指肠溃疡与s1型显著相关而与m型不相关。因此,检测Hp细胞毒性相关基因了解细菌毒性有重要意义。
另外,在根除幽门螺杆菌的治疗当中,药物的长期使用会有耐药菌株的产生,如甲硝唑在某些地区的耐药率高达80%,影响治疗效果,浪费医疗资源,增加患者负担。甚至有些病人因为其自身基因型,天生便对某些药物产生耐药。在中国,原先敏感性较强的抗生素一次性根治率从90%多下降到40%-60%,而且治疗时间越长,治愈的希望越小。主要原因在于医生在未得到明确诊断依据的情况下仅凭感觉给患者使用抗生素,及长期使用某抗生素却未能及时发现患者所感染的菌株已对该药物产生耐药。在提倡个体化治疗的今天,对幽门螺杆菌耐药型的检测便显得非常有意义。然而,传统的药敏检测方法均须通过幽门螺杆菌的培养实现。由于幽门螺杆菌是微需氧细菌,对于培养的条件要求较高,培养时间一般需要5到7天,因此目前各个医院基本都没有开展幽门螺杆菌的耐药型临床检测项目。
随着研究的深入,研究发现幽门螺杆菌种存在很多耐药基因,这些基因中位点的突变会使得治疗药物的最低有效浓度值提高十几倍甚至几十倍,产生严重的耐药现象。耐药的产生是很复杂的过程,涉及到诸多方面,如:患者个体、菌株、环境等等,虽然目前对个别耐药基因位点与耐药的产生关系仍不明朗,但这些位点的检测无疑为临床医师提供了非常有价值的参考标准,可以帮助医师了解患者自身状况,选择有效、敏感的治疗药物和治疗方案。可见,对于幽门螺杆菌耐药相关基因相关位点的快速检测具有广阔的应用前景及迫切的市场需求。
发明内容
1.发明目的:
本发明的目的之一是提供了一种检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的基因芯片,包括片基,多个检测区域的微阵列排列的核苷酸片段,连接于片基之上。所述核苷酸片段,为一组长度在11-2000个碱基的人工编码寡核苷酸序列,每个序列由支持片段和特异片断组成。支持片段为胸腺嘧啶的重复序列(poly T),长度为5-30个碱基,位于序列的5’端。特异片段为至少包括序列号为SEQ ID NO.1至32的核苷酸序列或具有与上述序列85%以上同源的连续核苷酸序列的人工编码序列,或者是具有上述特征的PCR产物,该特异片段的5’端的第一个碱基与上述支持片段的3’端的最后一个碱基相连。多个检测区域为12个或少于12个包含相同探针排列、但彼此独立的检测区,每个检测区里排列了15~100个探针点,探针点直径不大于5mm。所述的片基包括玻璃、硅芯片、陶瓷材料、金属、聚二氟乙烯膜或醋酸纤维膜等材料。
本发明的目的之二是提供一种检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的套组。该套组包括(a)上述检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的芯片;(b)PCR扩增液(c)特异性引物,为一组部分序列的5′端带有标记物修饰的寡核苷酸片段(d)杂交溶液。
以期解决目前幽门螺杆菌毒力型及耐药型检测技术——培养法所存在的成本昂贵、检测周期长、灵敏度低、原料来源困难等方面的问题。
2.技术方案:
本发明主要提供了一种基因芯片,一种由多种特异性片段连接于片基上所得的具有多个检测区域的芯片,以及一套含有多条特异性扩增引物的PCR扩增体系和杂交液体系所组成的检测套组,同时提供了该套组的检测流程。所涉及的这些特异性核苷酸序列详细列于下表(序列编号与序列表中的序列鉴别号一一对应)。特别的,本发明所提供的特异性核苷酸序列包括下表中的序列以及具有与下表中的序列85%以上同源的连续核苷酸序列的所有人工编码序列或PCR产物。
表一.核苷酸序列总表
序列编号 | 序列 | 长度 |
1 | ggtatgcacggttacgag | 18 |
2 | gtggttgcgttagtgcc | 17 |
3 | agcttygttgagttggtc | 18 |
4 | atgccattggtacctgt | 17 |
5 | tgactgcattgggacct | 17 |
6 | cgcagaaacattgccata | 18 |
7 | gcttgcttgatggcctg | 17 |
8 | gttgcggtgtgatgctg | 17 |
9 | tgcggtatggcgctaat | 17 |
10 | gctraccaatarccccact | 19 |
11 | atgggatcrtttggcgt | 17 |
12 | gtcttttcgtcttgccg | 17 |
13 | gtctttccgtcttgccg | 17 |
14 | gtcttctcgtcttgccg | 17 |
15 | gtctcttcgtcttgccg | 17 |
16 | caagtaatygcatcaact | 18 |
17 | caagtaatygtatcaact | 18 |
18 | ctcttrcccaawgcgat | 17 |
19 | ctcttrcacaawgcgat | 17 |
20 | aaccgcgttatcgcca | 16 |
21 | aaccgcgatatcgcca | 16 |
22 | aaccgctttatcgcca | 16 |
23 | aaccgccttatcgcca | 16 |
24 | agtgcatcataaaccgc | 17 |
25 | agtgcataataaaccgc | 17 |
26 | agtgcaccataaaccgc | 17 |
27 | caaaacgcgcataaaaac | 18 |
28 | caaaacgcacataaaaac | 18 |
29 | cccggttttaccggc | 15 |
30 | cccgcttttaccggc | 15 |
31 | gcctcctgtcgctcct | 16 |
32 | gcctcctgccgctcct | 16 |
33 | taaccgtgcatacccct | 17 |
34 | ccatgaaaaccacgctc | 17 |
35 | gaagagcttaaattcgg | 17 |
36 | gttccgccaccaatcat | 17 |
37 | catttacgctcaagttgc | 18 |
38 | tttagcttctgataccgc | 18 |
39 | gtggatgctcatacagctma | 20 |
40 | rtgagcttgttgatattgac | 20 |
41 | atggaaatacaacaaacacac | 21 |
42 | ctgcttgaatgcgccaaac | 19 |
43 | ttccacacagaaccacc | 17 |
44 | aggttaagaggatgcgt | 17 |
45 | tttacagagagccagacag | 19 |
46 | aaacacccctaaaagagcg | 19 |
47 | tttaccggacgctagag | 17 |
48 | atagaagtcgccatccc | 17 |
49 | cttagcgttagagtccttg | 19 |
50 | caggaggcgttgtgag | 16 |
上表所列的各序列的用途在于:
用于特异性检测幽门螺杆菌标记基因ureasA和ureasB基因的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号1-2。
用于特异性检测幽门螺杆菌毒力基因cagA基因和vacA基因的m1a、m1b、m1c、m2、s1a、s1b、s1c以及s2基因型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号3-11。
用于特异性检测幽门螺杆菌23SrRNA基因2142位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号12-13。
用于特异性检测幽门螺杆菌23SrRNA基因2143位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号12和14。
用于特异性检测幽门螺杆菌23SrRNA基因2144位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号12和15。
用于特异性检测幽门螺杆菌rdxA基因616位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号16-17。
用于特异性检测幽门螺杆菌rdxA基因565位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号18-19。
用于特异性检测幽门螺杆菌gyrA基因260位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号20-21。
用于特异性检测幽门螺杆菌gyrA基因261位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号20、22和23。
用于特异性检测幽门螺杆菌gyrA基因271位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号24-25。
用于特异性检测幽门螺杆菌gyrA基因272位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号24和26。
用于特异性检测幽门螺杆菌pbp1基因206位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号27-28。
用于特异性检测幽门螺杆菌pbp1基因1667位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号29-30。
用于特异性检测幽门螺杆菌pbp1基因1777位核苷酸突变类型的寡聚核苷酸,列于序列鉴别号31-32。
用于扩增ureA基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号33-34。
用于扩增ureB基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号35-36。
用于扩增cagA基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号37-38。
用于扩增vacA基因编码区m区段的DNA,列于序列鉴别号39-40。
用于扩增vacA基因编码区s区段的DNA,列于序列鉴别号41-42。
用于扩增23SrRNA基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号43-44。
用于扩增rdxA基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号45-46。
用于扩增gyrA基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号47-48。
用于扩增pbp1基因编码区特异区段的DNA,列于序列鉴别号49-50。
本发明可通过以下技术方案来加以实现:经过对临床诊断为幽门螺杆菌阳性病人的胃镜组织、体液(如外周血等)或排泄物(如唾液、粪便等)的抽提处理从样品中提取出幽门螺杆菌核酸,然后经过PCR扩增,使得靶序列带上标记物;然后以此靶序列去结合芯片中的特异探针,并最终被固定在芯片检测区的相应探针捕获;然后用扫描仪对检测点阵进行观察并对照芯片的探针排布图,确定该靶序列的特性。
本方法检测过程可按如下步骤进行:
(1)芯片制备是将合成的幽门螺杆菌种属特异性探针以及耐药相关基因特异性探针按照一定的区域排布顺序点制到基片上,封闭后干燥备用。上述的探针排布不要求对探针序列的认识,具体位置排布也与探针序列无关。
(2)样品制备是选用去杂质溶液、裂解液等溶液对样品进行处理,使组织细胞以及幽门螺杆菌细胞裂解,释放其内含的核酸,作为下续扩增步骤的模板。
(3)PCR扩增是选用特异性的引物对裂解所得的核酸中的ureasA、ureasB、cagA、vacA、23SrRNA、pbp1、rdxA、gyrA等基因片断进行扩增,该扩增体系中的引物或4种脱氧核苷三磷酸中的一种(或几种)带有标记物,因此扩增反应完成后产物也带上标记物。
(4)杂交过程是将扩增产物与杂交混合液按一定比例混合后加到点制好的芯片检测区上,用杂交盒形成一个密封的杂交环境,并将之置于一定温度下孵育一定时间,杂交过程中,扩增产物被检测区里特定位置上的探针捕获,并最终堆积在该特定位置上。
(5)扫描仪检测该点阵,对照探针点阵排布图,当某耐药基因型的特异探针点的位置上显示有标记物的堆积现象(可表现为荧光信号等),则可判断样品为该基因型,并由此获取样品的幽门螺杆菌对于克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、莫西沙星等药物的耐受性的信息以及幽门螺杆菌致病毒力信息。。
3.优点及效果:
基因芯片是90年代中期发展起来的一项前沿生物技术,它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术,具有高度并行性、多样性、微型化和自动化这四大特点,同时,它还具有操作简便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势,因而备受青睐。
本方法通过在特异扩增产物上标记标记物,并使之积聚在相应特异探针点的位置上,形成可通过扫描仪观察的检测点阵。它既避免了传统的药敏检测法繁琐、耗时、高成本等缺点,又保持了上述基因芯片的各种优点,因此必将在临床和科研领域得到广泛应用。
具体实施实例
下文将以幽门螺杆菌几种耐药类型的鉴定为例说明本发明的具体实施方案。然而,下述实施例仅仅是本发明的一个个例,因此,本发明不仅限于下述实施例。
1.设计特异性探针和引物
从Genbank等数据库获得可靠的幽门螺杆菌ureasA、ureasB、cagA、vacA、23SrRNA、pbp1、rdxA、gyrA序列,并对这些序列进行BLAST分析,获得同源序列。利用生物信息学软件,根据以上各个幽门螺杆菌耐药相关基因的同源序列,设计探针;同样利用生物信息学软件,按同样的方法设计引物。
2.合成探针和引物
按照表1和表2列出的序列,交由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物的5′端带有Cye5荧光素标记,探针的5′端加氨基修饰。
3.制备芯片
根据探针杂交动力学要求及点样仪操作说明设计探针点阵排布图,并根据该排布图设定点样程序。用50%的二甲亚砜(DMSO)将合成的探针溶解,浓度为10μmol/L。使用点样仪按预先设定好的程序进行点样。按照不同要求从十几点到一百点,点的大小为100-1000微米,点间距根据点的数量确定。点好的芯片于室温晾干,然后以封闭液封闭玻片,洗涤后离心甩干备用。
4.处理样品
取胃镜所取的胃窦组织一块,先研磨匀浆,然后加入裂解液提取DNA,备用。如需长时间保存,应置-20℃下冻存。
5.PCR扩增
在反应管中加入扩增反应混合物,包括Taq酶、上游带有荧光素Cye5标记的引物对、足量的dNTP、适量的镁离子等。扩增条件如下:94℃预变性10分钟;94℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环30次;最后72℃延伸7分钟
6.杂交
把步骤3制备的芯片置于杂交盒中,并覆盖上盖片,吸取13μL步骤5的扩增产物,通过盖片上的进样口进样至芯片的特定检测区域中,盖上杂交盒盖,并用铁扣将杂交盒密封,然后将整个杂交盒置于42℃水浴锅中保温2小时。
保温结束后,将杂交盒水平取出,打开铁扣取出芯片,先于洗液中轻涮数下,再于蒸馏水中轻涮数下,取出芯片并离心甩干。
7.检测
杂交信号通过激光扫描仪进行检测,获得的图像用分析软件分析每个基因探针位点的杂交信号的强弱,从而确定样品中幽门螺杆菌相关毒力基因及耐药基因的类型。
序列表
<110>上海芯超生物科技有限公司
<120>一种检测幽门螺杆菌毒力型及耐药基因型的基因芯片及其套组和方法
<160>50
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<210>2
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<400>49
<210>50
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
Claims (13)
1、一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,包括片基,多个检测区域的微阵列排列的核苷酸片段,连接于片基之上,其特征在于所述核苷酸片段,为一组长度在11-2000个碱基的人工编码寡核苷酸序列,每个序列由支持片段和特异片断组成。
2 根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及的支持片段为胸腺嘧啶的重复序列(poly T),长度为5-30个碱基,其5’端与片基连接。
3、根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及的特异片段至少包括序列号为SEQ ID NO.1至32的核苷酸序列或具有与上述序列85%以上同源的连续核苷酸序列的人工编码序列,或者是具有上述特征的PCR产物,该特异片段的5’端的第一个碱基与权利要求2所述的支持片段的3’端的最后一个碱基相连。
4、根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及的片基包括玻璃、硅芯片、陶瓷材料、金属、聚二氟乙烯膜或醋酸纤维膜等材料。
5、根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及的片基是经过表面修饰的,修饰的手段包括醛基修饰、氨基修饰、特殊标记物表面包被等化学及生物学表面处理。
6、根据权利要求1或2所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及核苷酸片段的5′端可带有氨基修饰。
7、根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片,其特征在于所述及的多个检测区域的微阵列,是12个或少于12个包含相同探针排列、但彼此独立的检测区,每个检测区里排列了15~100个探针点,探针点直径不大于5mm。
8、一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的套组,其特征在于包括:
(a)权利要求1—7中任一项所述的检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片;
(b)PCR扩增液
(c)特异性引物,为一组部分序列的5′端带有标记物修饰的寡核苷酸片段;
(d)杂交溶液。
9、根据权利要求8所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的套组,其特征在于所述及的特异性引物至少包括序列号为SEQ ID NO.33至50的核苷酸序列或具有与上述序列85%以上同源的连续核苷酸序列的人工编码序列,或者是具有上述特征的PCR产物。
10、根据权利要求8所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的套组,其特征在于所述及的标记物为荧光基团或其它化学发光基团。
11、一种检测检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的方法,包括:
(a)提供权利要求9、10所述的引物和PCR扩增液与待测样品进行以下反应,94℃预变性10分钟;94℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环30次;最后72℃延伸7分钟。
(b)提供权利要求1-7任一项所述的检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的基因芯片与(a)项反应产物杂交;
(c)用扫描仪扫描芯片。
12、根据权利要求11所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的方法,其特征在于所述及的待测样品提纯于临床诊断为幽门螺杆菌阳性病人的胃镜组织、体液(如外周血等)或排泄物(如唾液、粪便等)。
13、根据权利要求11所述的一种检测幽门螺杆菌毒力基因型及耐药基因型的方法,其特征在于该法可运用于幽门螺杆菌对于克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、莫西沙星等药物的耐受性的辅助判断以及幽门螺杆菌致病毒力大小的辅助判断。
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