CN114438238A - 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，特别涉及检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒。本发明提供了引物探针组合，其具有包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.39中任意所述的核苷酸序列。本发明主要检测链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体和巴尔通体共12种能引起感染性心内膜炎的病原体，单次能够检测4个检测通道和1个内控通道、对12种无关的人类常见病原体无非特异性扩增、能够进行绝对定量。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒。
背景技术
感染性心内膜炎(Infective endocarditis，IE)指因病原体直接侵犯心脏瓣膜而引起的一系列以瓣膜受累为特征的致命性疾病。活动期感染性心内膜炎(Activeinfective endocarditis，AIE)以血流动力学紊乱、难以控制的脓毒血症、瓣周脓肿、脑动脉瘤或脑出血、或大赘生物为主要临床表现。感染性心内膜炎患者早期症状缺乏特异性，首次就诊可出现在多个科室，临床通常采用传统或改良的Duke标准来诊断疑似IE的患者。近些年，IE的发病率呈明显增加趋势，尤其是老年人和住院患者中，风险因素主要包括细菌耐药、人工瓣膜置换术、植入器械术以及各种血管内检查治疗操作、年龄、血液透析、静脉注射毒品等。对于病原体诊断，血培养是公认的金标准，然而，血培养检测周期长、污染风险、采血量大、多菌复合检测能力差，且由于既往抗生素治疗、微生物量少、病原体生长缓慢等其他因素，约30％的IE患者的血培养假阴性，而且苛养微生物等非典型病原体无法培养，导致感染性心内膜炎的诊断和治疗存在滞后性、不科学性、滥用抗菌药物等问题。此外，由于抗生素治疗和污染，瓣膜培养结果存在争议。综上所述，IE由于临床症状不典型、心内结构破坏严重、血培养困难、病情进展迅速、病人院内死亡率高(15％～20％)等特点，往往在早期诊断和对症治疗上存在困难，亟需研发快速、灵敏的分子诊断方法对IE的多种病原体进行精准检测。
目前，不依赖培养的聚合酶链式反应(PCR)具有检测周期短、高灵敏高特异等优点，同时，定量PCR可用于监测治疗效果和预后评估，在诊断IE的病原体方面逐渐得到认可。主流的分子检测以荧光定量PCR为主，但随着技术的发展，新一代分子检测技术——数字PCR逐渐崭露头角。数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其核心是通过大规模单分子扩增实现拷贝数的直接绝对定量，直接获知目标核酸分子的数目，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR具有超高灵敏度、高特异性、绝对定量、高耐受性等优势，能够为IE提供早期、快速、准确、定量的病原菌诊断结果。
与本发明最接近的技术方案为荧光定量PCR技术，步骤：a.核酸提取；b.荧光定量PCR反应体系配制；c.扩增，收集荧光信号；d.标准曲线和CT值确定病原体拷贝数。
但荧光定量PCR技术的缺点主要有：
(1)荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR，可造成漏检，出现假阴性；
(2)荧光定量PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测，无法兼顾内控通道；或者检测两份，即分别采用两个基因和一个内控基因构成检测体系；
(3)荧光定量PCR实现拷贝数的定量依赖于标准曲线，经已知浓度标准品推算未知浓度的样本，没有实现真正的绝对定量。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒，能单次能够检测4个检测通道和1个内控通道、对12种无关的人类常见病原体无非特异性扩增、能够进行绝对定量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两种以上：
组合X：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.(3X-2)所示的核苷酸序列；和/或
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.(3X-1)所示的核苷酸序列；和/或
(3)、探针具有如SEQ ID No.(3X)所示的核苷酸序列；和/或
(4)、如(1)～(3)任意所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)～(3)的相同或相似；和/或
(5)、与(1)～(4)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
其中，X选自1～13中的任意整数；
所述多个为2个至5个。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的引物组的核苷酸序列与上述引物组的核苷酸序列的同源性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰为成倍扩增。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为1个、2个、3个、4个和/或5个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的缺失为1个、2个、3个、4个和/或5个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为1个、2个、3个、4个和/或5个碱基。
本发明还提供了上述的引物探针组合在制备检测链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体和/或巴尔通体的试剂、试剂盒和/或装置中的应用。
本发明还提供了上述的引物探针组合在制备检测感染性心内膜炎的试剂、试剂盒和/或装置中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述检测包括提取核酸、微液滴生成、PCR扩增和/或芯片扫描。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述检测把12种检测项目分成3组进行。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的3组分别为链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌；肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、立克次体、巴尔通体。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述检测的反应体系为15μL，包括3μL的5×mix、0.15μL的100μM的上游引物、0.15μL的100μM的下游引物、0.0375μL的100μM的探针和/或模板。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述检测的反应程序为：
本发明还提供了试剂，包括上述引物探针组合以及可接受的辅料和/或助剂。
本发明还提供了试剂盒，包括上述引物探针组合以及可接受的辅料和/或助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括DMSO、TMAC、SSB、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱、非离子型洗涤剂、dNTPs、UDG酶、Tth酶和/或MgCl2。
本发明还提供了检测装置，包括包被有上述引物探针组合，以及可接受的部件。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的检测装置包括芯片或检测卡。
本发明还提供了检测方法，使用上述引物探针组合进行数字PCR。
本发明的检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒有如下效果：
1、多重病原体检测。可以检测链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体和/或巴尔通体共12种能引起感染性心内膜炎的病原体，单次可检测4个检测通道和1个内控通道。
2、特异性好。对12种其他人类常见的病原体培养物，包括肠道沙门氏菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟菌、鼻疽伯克霍尔德菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、皮疽诺卡菌、新生隐球菌、烟曲霉等进行检测，未发现非特异性扩增。
3、可进行绝对定量。所采用的数字PCR技术在定量分析中无需建立标准曲线。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示金黄色葡萄球菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为FAM，代表金黄色葡萄球菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角蓝色散点为金黄色葡萄球菌，右上角散点为同时包括内参和金黄色葡萄球菌的液滴；
图2示凝固酶阴性葡萄球菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为VIC，代表凝固酶阴性葡萄球菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角绿色散点为凝固酶阴性葡萄球菌，右上角散点为同时包括内参和凝固酶阴性葡萄球菌的液滴；
图3示肠球菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为ROX，代表肠球菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角黄色散点为肠球菌，右上角散点为同时包括内参和肠球菌的液滴；
图4示链球菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为Cy5，代表链球菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角红色散点为肠球菌，右上角散点为同时包括内参和链球菌的液滴；
图5示阴性质控一维图；横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为FAM(金黄色葡萄球菌)；灰色散点表示不含金黄色葡萄球菌，阴性；若出现蓝色散点则表示含有金黄色葡萄球菌；
图6示铜绿假单胞菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为FAM，代表铜绿假单胞菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角蓝色散点为铜绿假单胞菌，右上角散点为同时包括内参和铜绿假单胞菌液滴；
图7示嗜麦芽窄食假单胞菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为VIC，代表嗜麦芽窄食假单胞菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角绿色散点为嗜麦芽窄食假单胞菌，右上角散点为同时包括内参和嗜麦芽窄食假单胞菌的液滴；
图8示大肠埃希菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为ROX，代表大肠埃希菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角黄色散点为大肠埃希菌，右上角散点为同时包括内参和大肠埃希菌的液滴；
图9示鲍曼不动杆菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为Cy5，代表鲍曼不动杆菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角红色散点为鲍曼不动杆菌，右上角散点为同时包括内参和鲍曼不动杆菌的液滴；
图10示阴性质控一维图；横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为ROX(大肠埃希菌)；灰色散点表示不含大肠埃希菌，阴性；若出现蓝色散点则表示含有大肠埃希菌；
图11示巴尔通体阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为FAM，代表巴尔通体；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角蓝色散点为巴尔通体，右上角散点为同时包括内参和巴尔通体的液滴；
图12示肺炎克雷伯菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为VIC，代表肺炎克雷伯菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角绿色散点为肺炎克雷伯菌，右上角散点为同时包括内参和肺炎克雷伯菌的液滴；
图13示立克次体阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为ROX，代表立克次体；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角黄色散点为立克次体，右上角散点为同时包括内参和立克次体的液滴；
图14示白色念珠菌阳性二维图；其中横坐标为A425，代表内参；纵坐标为Cy5，代表白色念珠菌；左下角散点为阴性液滴；右下角紫色散点为A425内参；左上角红色散点为白色念珠菌，右上角散点为同时包括内参和白色念珠菌的液滴；
图15示阴性质控一维图；横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为VIC(肺炎克雷伯菌)；灰色散点表示不含肺炎克雷伯菌，阴性；若出现蓝色散点则表示含有肺炎克雷伯菌；
图16示金黄色葡萄球菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为金黄色葡萄球菌，示引物特异性高；
图17示凝固酶阴性葡萄球菌引物序列特异性BLAST，Description、ScientificName所描述结果均为凝固酶阴性葡萄球菌，示引物特异性高；
图18示肠球菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为肠球菌，示引物特异性高；
图19示链球菌属引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为链球菌属，示引物特异性高；
图20示铜绿假单胞菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为铜绿假单胞菌，示引物特异性高；
图21示嗜麦芽窄食假单胞菌引物序列特异性BLAST，Description、ScientificName所描述结果均为嗜麦芽窄食假单胞菌，示引物特异性高；
图22示大肠埃希菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为大肠埃希，示引物特异性高；
图23示鲍曼不动杆菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为鲍曼不动杆菌，示引物特异性高；
图24示肺炎克雷伯菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为金黄色葡萄球菌，示引物特异性高；
图25示白色念珠菌引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为肺炎克雷伯菌，示引物特异性高；
图26示立克次体引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为立克次体菌，示引物特异性高；
图27示巴尔通体引物序列特异性BLAST，Description、Scientific Name所描述结果均为巴尔通体，示引物特异性高。
具体实施方式
本发明公开了检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的主要目的在于，建立一种高灵敏度、多靶标性、绝对定量的多重数字PCR诊断感染性心内膜炎。
本发明前期通过十多年培养数据分析、全国范围的宏基因组测序数据和文献调研，确定常见引起IE的多种病原体，包括：链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体、巴尔通体等。基于以上多种病原体，设计多对特异性引物，并优化引物混合体系，优化荧光信号及算法，经模拟样本的核酸、病原体纯培养物、IE临床样本验证，确保检测性能真实可靠，力求广覆盖、多靶标诊断，在克服传统实验室检测方法的缺陷和不足，为临床诊疗IE提供充足依据，以达到降低死亡率、缩短住院时间、减少抗菌药物使用、降低医疗成本的目标。
依据引起感染性心内膜炎的多种病原体的保守区序列，采用Primer express软件设计引物探针。涵盖的感染性心内膜炎病原体包括：链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、立克次体、巴尔通体、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌。引物探针具体信息如表1所示：
表1 引物探针信息表
当表1中序列与序列表中不一致时，以表1中记载的序列为准。
实验方法：
1)核酸提取：待检测样本及阴性质控品各2mL，使用核酸提取试剂盒(CF1)进行核酸提取，常温备用；
2)微液滴生成：根据检测数量N(样本数+2)，配制检测体系，混匀，瞬时离心，按7μL/管分装；每管加样本提取物各8μL，避免气泡产生，瞬时离心；取反应液14μL，分别加入数字PCR微液滴芯片进样杯，并使用DG32进行液滴生成；
3)PCR扩增：液滴生成后的芯片放入PCR扩增仪TC1，按照PCR扩增参数进行反应；
4)芯片扫描：PCR结束后，将芯片放入生物芯片阅读仪的托架内，选择FAM、VIC、ROX、CY5、A425荧光通道，设置芯片孔位，进行芯片扫描和分析。
本发明的引物探针特异性高；灵敏度强，能够检测低至50copies/mL，避免了荧光定量可能出现的假阴性；同时进行四个检测通道和一个内控通道，减少了加样可能造成的污染；同时检测多种病原体，减少工作量，提高检测效率；液滴中实现绝对定量，无需标准曲线。
本发明提供的检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、链球菌属的检测
1、样品
(1)模拟样本的核酸：多种病原体的基因序列均由天根生物公司合成，溶解DNA粉末后按照检测panel，混匀后稀释100倍，500倍冷冻备用；
(2)内对照基因：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提口腔脱落细胞的基因组DNA，稀释到5ng/μL冷冻备用；
(3)病原体纯培养物：来自广东省人民医院检验科微生物室2015年～2021年间感染性心内膜炎赘生物样本分离培养的纯培养物，涵盖本专利中除立克次体和巴尔通体(严格胞内寄生，需要特殊培养)之外的所有病原体；培养方法：a)样本接种，包括血平板、麦康凯、巧克力平板、沙氏平板、PDA平板等；b)分纯培养，可疑致病菌再次分纯，过夜培养；c)纯培养物采用GP、GN、YST、ANC卡或直接涂靶板法、甲酸乙腈法，梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定系统和MALDI TOF MS鉴定到种；d)所有菌种菌通过甘油肉汤法或血清DMSO法冷冻保存，以待后用；e)取出保存菌株，经适宜条件培养病原体，采用Qiagen DNA提取试剂盒提取总DNA，冷冻备用；
(4)临床样本：纳入符合改良的Duke诊断标准诊断感染性心内膜炎患者，使用Streck-cell-Free抗凝血管采集符合要求的感染性心内膜炎患者外周血样本，3mL/管，3500rpm离心十分钟，分离血浆到EP管，-80摄氏度冷冻备用；使用一次性无菌干燥管收集赘生物组织样本，-80摄氏度冷冻备用。
2、提取
(1)对血浆和组织采用Qiagen DNA提取试剂盒提取cfDNA，组织提取时提前剪碎研磨，提取时加入合成的DNA片段(内参)用于质控；
(2)提取ddH2O进行质控。
3、检测体系
IE涉及12个病原体，分3个panel(表2～表4)，详细标记见表内备注，内参为A425标记。
表2 panel 1反应体系
以上引物初始浓度为100μM
表3 panel 2反应体系
以上引物初始浓度为100μM
表4 panel 3反应体系
以上引物初始浓度为100μM
4、扩增程序
扩增反应程序如表5所示。
表5 扩增程序
5、检测结果
(1)内参提取、扩增均正常，血样样本中检出IE病原体，对照水中无检出，具体拷贝数如表6所示。
表6 样本拷贝数
| 血液样本 | 浓度(copies/μL) | A425浓度(copies/μL) |
| 金黄色葡萄球菌/FAM | 303.04 | 450.61 |
| CoNS/VIC | 282.06 | 276.21 |
| 肠球菌/ROX | 165.94 | 132.11 |
| 链球菌属/Cy5 | 232.86 | 199.68 |
| 铜绿假单胞菌/FAM | 291.12 | 325.44 |
| 嗜麦芽窄食假单胞菌/VIC | 4011.46 | 4600.65 |
| 大肠埃希菌/ROX | 274.8 | 306.77 |
| 鲍曼不动杆菌/Cy5 | 691.07 | 572.33 |
| 巴尔通体/FAM | 261.32 | 325.44 |
| 肺炎克雷伯菌/VIC | 201.81 | 320.71 |
| 立克次体/ROX | 171.73 | 274.09 |
| 白色念珠菌/Cy5 | 283.56 | 203.09 |
(2)散点图分析
本专利申请包括12种感染性心内膜炎病原体，以panel 1(四种细菌联检)的结果分析为例(图1～5)。
a)阴性质控无阳性点(如阴性一维图，图5)，表明本次试验结果不存在其他污染可能，保证结果可靠性；
b)FAM、ROX、VIM、Cy5为荧光的四个通道，其阳性点分别代表金黄色葡萄球菌、CoNS、肠球菌、链球菌属检测阳性。以FAM为例，如图1，左下象限为阴性点，即无金黄色葡萄球菌、无内对照基因存在的液滴；左上象限为FAM单阳点，即只有金黄色葡萄球菌，无内对照基因存在的液滴；右下象限为A425单阳点，即无金黄色葡萄球菌，只有内对照基因存在的液滴；右上象限为FAM、A425双阳的点，即金黄色葡萄球菌和内对照基因同时存在的液滴。ROX、VIM、Cy5通道以此类推，见图2～4的附图说明。
类似的，panel 2、panel 3的检测结果如图6～15所示，结果说明见图6～15的附图说明。
结果表示，本方法可以检测金黄色葡萄球菌、CoNS、肠球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、巴尔通体、肺炎克雷伯菌、立克次体和白色念珠菌，且检测准确度高，区分度强。
实施例2：特异性验证
Blast结果显示，Description(描述)、Scientific Name(学名)所描述结果均为相应病原体，综合评分(Max Score、Total Score)在所检索数据库中得分最高，序列覆盖率(Query Cover)达100％，示引物特异性高。图6～17为Blast比对结果。除了blast结果，本发明采用12种其他人类常见的病原体培养物(包括肠道沙门氏菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟菌、鼻疽伯克霍尔德菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、皮疽诺卡菌、新生隐球菌、烟曲霉)，对研发的数字PCR体系进行特异性测试，结果显示均为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省人民医院
<120> 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒
<130> MP21032976
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttatcttg ctgtaaaacg acgc 24
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 2
gaaatgacgc ctttattacc gtg 23
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
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<212> DNA
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<400> 4
acttgaagct tacggtgcag c 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtatcgccta agcaggtagt tgc 23
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccatgaggg cacggtt 17
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<400> 14
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<212> DNA
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<400> 15
acaacatcgg tgctt 15
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtctgcctca atttgcgatt g 21
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<212> DNA
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caattggaaa gaggagtggc ggacg 25
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gggtttgctt gaaagacggt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgaagatat acgtggtgga cgtta 25
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acctaagcca ttgtcaaagc gatcccg 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctgaccatc cgtcgccaca ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgcagcagga tgccgacgcc 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccgtggtggt agacctgttc ccagacc 27
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 28
aaggacaagg cgatgaccat c 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccccaccacg ayttcatca 19
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cagaacgaca tctggttggc g 21
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atcgtgacca ccttgatt 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
taccagaaga tcgacatc 18
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cattatgttt gccggtatcc gttt 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
taccctaacg ctactgcacg 20
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<212> DNA
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cgtgctaact ctgttaaatc agctcttg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtaaacacga tggccgaagc 20
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<212> DNA
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<400> 38
tcagctccgt tgagcacatt 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcttgtcttt cgcacgacga aca 23
Claims (9)
1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两种以上：
组合X：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.(3X-2)所示的核苷酸序列；和/或
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.(3X-1)所示的核苷酸序列；和/或
(3)、探针具有如SEQ ID No.(3X)所示的核苷酸序列；和/或
(4)、如(1)～(3)任意所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)～(3)的相同或相似；和/或
(5)、与(1)～(4)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
其中，X选自1～13中的任意整数；
所述多个为2个至5个。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体和/或巴尔通体的试剂、试剂盒和/或装置中的应用。
3.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测感染性心内膜炎的试剂、试剂盒和/或装置中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述检测包括提取核酸、微液滴生成、PCR扩增和/或芯片扫描。
5.如权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，所述检测的反应体系为15μL，包括3μL的5×mix、0.15μL的100μM的上游引物、0.15μL的100μM的下游引物、0.0375μL的100μM的探针和/或模板。
6.如权利要求2至5任一项所述的应用，其特征在于，所述检测的反应程序为：
7.试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合以及可接受的辅料和/或助剂。
8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合以及可接受的辅料和/或助剂。
9.检测装置，其特征在于，包括包被有如权利要求1所述的引物探针组合，以及可接受的部件。
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