CN112410472A - 检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,特别涉及检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合包括:如SEQ ID NO:1~2所示的肺炎支原体的特异性引物对;如SEQ ID NO:3所示的肺炎支原体的特异性探针;如SEQ ID NO:4~5所示的肺炎衣原体的特异性引物对;如SEQ ID NO:6所示的肺炎衣原体的特异性探针;如SEQ ID NO:7~8所示的腺病毒的特异性引物对;如SEQ ID NO:9所示的腺病毒的特异性探针。本发明提供的引物和探针具有良好的特异性,结合real time PCR检测方法,能够实现对MP、CP和ADV的快速、准确、灵敏的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。
背景技术
肺炎支原体(MP)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主,有时并发支气管肺炎,称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染,潜伏期2~3周,发病率以青少年最高。临床症状较轻,甚至根本无症状,若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状,但也有个别死亡报道。一年四季均可发生,但多在秋冬时节。
肺炎衣原体(CP)根据遗传性和生物学特性,可分为TWAR、考拉和马3个生物变种。人类肺炎衣原体感染呈世界性流行,不分地域、不受种族和年龄限制。
腺病毒(ADV)有6个亚型(A~F)和55个不同的血清型(按病毒基因组分型)。已知约20余种血清型可感染人类。病毒为直径70~80纳米的20面体衣壳,内核含双股DNA。对热和酸不稳定。由于不含脂质,对胆盐等脂质溶解剂抵抗力强,故能在肠道中存活。不同亚型可引起不同感染。
MP、CP和ADV的检测方法多种多样,分离培养是微生物检测的“金标准”,该法虽然可靠,但耗时、费力不能满足快速检测的需要,常用的免疫荧光法虽然具有一定特异性和敏感性,但由于抗体的种类和浓度的影响,结果不稳定,有时会出现假阳性。为克服上述问题,多重荧光定量RT-PCR技术被用来诊断MP、CP和ADV的感染,这种方法具有快速、敏感、特异性强等特点,探针具有高度保守型,大大地提高了检测效率。
但是目前,针对MP、CP和ADV鉴定的基因片段的选择和引物探针的涉及存在不合理的现象,导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合能够准确、快速、灵敏的实现对MP、CP和ADV的鉴定。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种引物探针组合,其该组合包括:
如SEQ ID NO:1~2所示的肺炎支原体的特异性引物对;
如SEQ ID NO:3所示的肺炎支原体的特异性探针;
如SEQ ID NO:4~5所示的肺炎衣原体的特异性引物对;
如SEQ ID NO:6所示的肺炎衣原体的特异性探针;
如SEQ ID NO:7~8所示的腺病毒的特异性引物对;
如SEQ ID NO:9所示的腺病毒的特异性探针。
本发明提供的引物和探针能够在一个反应体系中,同时检测多个靶标,具有良好的准确性、特异性和灵敏度,并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒,可以对未知样本中的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒核酸进行快速检测,为诊断肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒核酸提供可靠的实验依据,解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。
作为优选,SEQ ID NO:1~2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:13所示;
SEQ ID NO:4~5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示;
SEQ ID NO:7~8所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。
作为优选,该组合还包括:
如SEQ ID NO:10~11所示的内标扩增引物对;
如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
作为优选,探针的3’端连接淬灭基团,5’端连接荧光基团;其中:
如SEQ ID NO:3所示探针的5’端连接FAM荧光基团;
如SEQ ID NO:6所示探针的5’端连接CY5荧光基团;
如SEQ ID NO:9所示探针的5’端连接ROX荧光基团;
如SEQ ID NO:12所示探针的5’端连接HEX荧光基团。
本发明还提供了该引物探针组合在制备检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的检测试剂盒,包括上述引物探针组合及Real time PCR反应试剂。
作为优选,Real time PCR反应试剂包括dNTPs、UDG酶、Taq酶、MgCl2中的一种或几种。
其中,dNTPs的浓度为1~20mM、UDG酶的浓度为0.5~10U/μL、Taq酶的浓度为1~10U/μL、MgCl2的浓度为1~100mM。
优选地,dNTPs的浓度为10mM、UDG酶的浓度为1U/μL、Taq酶的浓度为5U/μL、MgCl2的浓度为50mM。
作为优选,该检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照;其中,阴性对照为无菌水,阳性对照为人工合成的浓度1×106Copies/mL的假病毒。
作为优选,Real time PCR的反应体系为:
优选地,Real time PCR的反应体系为:
作为优选,Real time PCR的反应程序为:
本发明还提供了一种非诊断或治疗目的检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的方法:采用本发明中的引物探针组合对样品进行检测Real time PCR,根据检测的Ct值判断样品是否被肺炎支原体、肺炎衣原体或者腺病毒中的一种或多种感染;
所述判断包括:
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:9所示探针通道CT值>36或者无CT值,且SEQ ID NO:12所示探针通道的CT值≤35,报告检测结果为阴性;
SEQ ID NO:3所示探针通道的CT值≤38,但SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示探针通道CT值>38,报告为肺炎支原体阳性;
SEQ ID NO:6所示探针通道的CT值≤36,但SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9所示探针通道CT值>36,报告为肺炎衣原体阳性;
SEQ ID NO:9所示探针通道的CT值≤36,但SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示探针通道CT值>36,报告为腺病毒阳性;
当SEQ ID NO:12所示探针通道CT值>35,出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时,该检测结果无效,应查找并排除原因,并重复试验。
本发明提供了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合包括:如SEQ ID NO:1~2所示的肺炎支原体的特异性引物对;如SEQ IDNO:3所示的肺炎支原体的特异性探针;如SEQ ID NO:4~5所示的肺炎衣原体的特异性引物对;如SEQ ID NO:6所示的肺炎衣原体的特异性探针;如SEQ ID NO:7~8所示的腺病毒的特异性引物对;如SEQ ID NO:9所示的腺病毒的特异性探针。本发明具有如下技术效果:
本发明提供的引物和探针具有良好的特异性,结合real time PCR检测方法,能够实现对MP、CP和ADV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明,本发明的引物探针的检测MP的最低检测限为10copies/mL,CP的最低检测限为50copies/mL,ADV的最低检测限为20copies/mL。
附图说明
图1肺炎支原体梯度稀释图;
图2腺病毒梯度稀释图;
图3肺炎衣原体梯度稀释图。
具体实施方式
本发明公开了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂盒的制备
试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示:
表1引物、探针序列
试剂盒中还包括:10mM的dNTPs,1U/μL的UDG酶,5U/μL的Taq酶,50mM的MgCl2。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×106Copies/mL的假病毒)。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
本发明的检测方法为Real time RT-PCR,Real Time RT-PCR反应过程为:
每个检测体系的组成如表2:
表2检测体系
荧光检测通道选择:
(1)选择FAM通道(ReporTer:FAM,QuenCher:none),检测肺炎支原体;(2)选择CY5通道(ReporTer:CY5,QuenCher:none),检测肺炎衣原体;(3)选择ROX通道(ReporTer:ROX,QuenCher:none),检测腺病毒;(4)选择HEX通道,检测内标;(5参比荧光(PAssiveReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。
表3:荧光定量实时PCR反应条件
反应结束后,仪器自动保存结果,利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析,然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下:
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示探针通道无荧光值,且SEQ ID NO:12所示探针通道的CT值≤35,报告检测结果为阴性;
SEQ ID NO:3所示探针通道的CT值≤38,但SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示探针通道CT值>38,报告为肺炎支原体阳性;
SEQ ID NO:6所示探针通道的CT值≤36,但SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9所示探针通道CT值>36,报告为肺炎衣原体阳性;
SEQ ID NO:9所示探针通道的CT值≤36,但SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示探针通道CT值>36,报告为腺病毒阳性;
当SEQ ID NO:12所示探针通道CT值>35,出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时,该检测结果无效,应查找并排除原因,并重复试验。
SEQ ID NO:1~2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:13所示:
ACCGACCAAAAATGGTCCTACACCGACTTACAGTCGGATCAAACCAAGCTGAACCTCCCCGCTTACGGTGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGGCGTTGGTGGAAACCTATTTTGGGAACACGCGAGCGG
SEQ ID NO:4~5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示:
AAACAAACCCAAGGGCTATAAAGGCGTTGCTTTCCCCTTGCCAACAGACGCTGGCGTAGCAACAGCTACTGGAACAAAGTCTGCGACCAT
SEQ ID NO:7~8所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。
AAGATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACA
实施例3本发明试剂盒的可行性试验
1、灵敏度评估试验
(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测。
(2)病原体样本提取
将管中5个不同浓度的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,取出100μL于一个新的离心管中,12000rpm离心5min,小心弃去上清;向沉淀中加入200μL的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司),充分混匀,100℃水浴5min,10000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μL处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂反应管中,每个浓度3个复孔,同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂各浓度梯度(图1-3)的样本进行检测,表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)肺炎支原体为10copies/mL,肺炎衣原体为50copies/mL,腺病毒为20copies/mL,具体数据表4、表5、表6。
表4:肺炎支原体检测限评估
样本浓度(copies/mL) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 检测Ct值均值 |
100000copies/mL | 3 | 3 | 23.3 |
10000copies/mL | 3 | 3 | 26.6 |
1000copies/mL | 3 | 3 | 30.1 |
100copies/mL | 3 | 3 | 33.2 |
10copies/mL | 3 | 3 | 37.8 |
表5:腺病毒检测限评估
样本浓度(copies/mL) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 检测Ct值均值 |
1000000copies/mL | 3 | 3 | 20.1 |
100000copies/mL | 3 | 3 | 23.4 |
10000copies/mL | 3 | 3 | 26.8 |
1000copies/mL | 3 | 3 | 30.1 |
100copies/mL | 3 | 3 | 33.5 |
20copies/mL | 3 | 3 | 35 |
表6:肺炎衣原体检测限评估
样本浓度(copies/mL) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 检测Ct值均值 |
50000copies/mL | 3 | 3 | 23.3 |
5000copies/mL | 3 | 3 | 26.9 |
500copies/mL | 3 | 3 | 30.5 |
50copies/mL | 3 | 3 | 35.1 |
2、与其它疾病的交叉反应情况
(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制,通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂。
(2)交叉病原体样本提取
将管中的肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌咽拭子洗脱液用移液器混匀,取出100μL于一个新的离心管中,12000rpm离心5min,小心弃去上清;向沉淀中加入200μL的病毒裂解液,充分混匀,100℃水浴5min,10000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μL处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测反应管中,同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照,提取的肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒作为阳性对照试验,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒以外的其它病原体进行检测,结果表明:本发明试剂盒对肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒阳性对照为阳性,阴性对照为阴性,金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等病原体感染样本无交叉反应,表明其具有高特异性,具体结果如表6。
表6:交叉反应实验
样本名称 | 检测结果 | 样本名称 | 检测结果 |
肺炎支原体 | 阳性 | 变性杆菌 | 阴性 |
肺炎衣原体 | 阳性 | 肺炎链球菌 | 阴性 |
腺病毒 | 阳性 | 大肠埃希菌 | 阴性 |
金黄色葡萄球菌 | 阴性 | 铜绿假单胞菌 | 阴性 |
流感嗜血杆菌 | 阴性 | 阴性对照 | 阴性 |
3、对潜在外源物质的抗干扰性
(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制。
(2)样本处理
选取肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒低值样本,浓度值均为100copies/mL。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中,采用实施例3中交叉反应方法处理样本,按照实施例2中检测方法进行检测。
(3)结果分析
干扰判断:干扰率%小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10%),即可判断为通过。
干扰率计算公式:(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100%。
试验表明,当样本中含有利巴韦林、薄荷脑、替诺福韦、拉米夫定、苯唑卡因、阿德福韦醋,地塞米松,恩替卡韦、肾上腺素、扎那米韦(200μg/mL)等常见的抗病毒药物时,本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰,具体见表7。
表7:外源物质的抗干扰性实验
药物名称 | 干扰率(%) | 药物名称 | 干扰率(%) |
利巴韦林 | 1.2 | 阿德福韦醋 | 2.3 |
薄荷脑 | 2.6 | 地塞米松 | 2.2 |
替诺福韦 | 0.8 | 恩替卡韦 | 1.9 |
拉米夫定 | 1.2 | 肾上腺素 | 3.5 |
苯唑卡因 | 3.3 | 扎那米韦 | 1.4 |
4、对潜在内源物质的抗干扰性
(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂。
(2)样本处理
选取肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒低值样本,浓度值均为100copies/mL。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中,采用实施例3中交叉反应方法处理样本,按照实施例2中检测方法进行检测。同时将200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等干扰物质浓度加入到对应病毒样本中,采用实施例3中交叉反应方法处理样本,按照实施例2中检测方法进行检测。
(3)结果分析
干扰判断:干扰率%小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10%),即可判断为通过。
干扰率计算公式:(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100%。
试验表明,当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时,本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰,具体见表8。
表8:内源物质的抗干扰性实验
干扰物质 | 干扰率(%) |
血红蛋白 | 1.9 |
甘油三酯 | 1.3 |
胆红素 | 3.5 |
实施例4
每个检测体系的组成、荧光检测通道选择与实施例2相同。
荧光定量实时反应条件如下表9所示。
表9:荧光定量实时PCR反应条件
检测方法:
(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测。
(2)病原体样本提取
将管中5个不同浓度的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,取出100μl于一个新的离心管中,12000rpm离心5min,小心弃去上清;向沉淀中加入200μl的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司),充分混匀,100℃水浴5min,10000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂反应管中,每个浓度20个复孔,同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例4的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测,表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)肺炎支原体为10copies/mL,肺炎衣原体为50copies/mL,腺病毒为20copies/mL,具体数据表9、10。
表9、肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合
表10肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的检测限评估
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒
<130> MP2019800
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtcctac accgacttam agtcg 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccaaaata ggtttccacc aacg 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccattcacct caccrtaagc ggggaggt 28
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggctataaa ggcgttgctt t 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agactttgtt ccagtagctg ttgct 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccttgccaac agacgctggc gt 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccatcgatg atgcccca 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccccatact gaagtaggtg tct 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgccggacag gatgcttcgg agtacc 26
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggctcat ggcaagaaag t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcactcagt gtggcaaagg t 21
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttgaggtt gtccaggtga gccag 25
<210> 13
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accgaccaaa aatggtccta caccgactta cagtcggatc aaaccaagct gaacctcccc 60
gcttacggtg aggtgaatgg gttgttgaat ccggcgttgg tggaaaccta ttttgggaac 120
acgcgagcgg 130
<210> 14
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacaaaccc aagggctata aaggcgttgc tttccccttg ccaacagacg ctggcgtagc 60
aacagctact ggaacaaagt ctgcgaccat 90
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagatggcca ccccatcgat gatgccccaa tgggcataca tgcacatcgc cggacaggat 60
gcttcggagt acctgagtcc gggtctggtg cagttcgccc gtgcaacaga cacctacttc 120
agtatgggga acaagtttag aaaccccaca 150
Claims (10)
1.一种引物探针组合,其其特征在于,该组合包括:
如SEQ ID NO:1~2所示的肺炎支原体的特异性引物对;
如SEQ ID NO:3所示的肺炎支原体的特异性探针;
如SEQ ID NO:4~5所示的肺炎衣原体的特异性引物对;
如SEQ ID NO:6所示的肺炎衣原体的特异性探针;
如SEQ ID NO:7~8所示的腺病毒的特异性引物对;
如SEQ ID NO:9所示的腺病毒的特异性探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,
SEQ ID NO:1~2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:13所示;
SEQ ID NO:4~5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示;
SEQ ID NO:7~8所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合,其特征在于,还包括:
如SEQ ID NO:10~11所示的内标扩增引物对;
如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的引物探针组合,其特征在于,所述探针的3’端连接淬灭基团,5’端连接荧光基团;其中:
如SEQ ID NO:3所示探针的5’端连接FAM荧光基团;
如SEQ ID NO:6所示探针的5’端连接CY5荧光基团;
如SEQ ID NO:9所示探针的5’端连接ROX荧光基团;
如SEQ ID NO:12所示探针的5’端连接HEX荧光基团。
5.权利要求1~4中任一项所述的引物探针组合在制备检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的试剂盒中的应用。
6.一种肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~4中任一项所述的引物探针组合及Real time PCR反应试剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,所述Real time PCR反应试剂包括dNTPs、UDG酶、Taq酶、MgCl2中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括阴性对照和阳性对照;其中,所述阴性对照为无菌水,阳性对照为人工合成的浓度1×106Copies/mL的假病毒。
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