CN112575099A - 一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒 - Google Patents

一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒。该引物探针组合包括KPn引物对和KPn探针，序列如SEQ ID NO：1～3所示。本发明提供的引物探针组合具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对KPn的快速、准确、灵敏的鉴定，且检测限低。

Description

一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPn)属于肠杆菌科、克雷伯菌属，是一种需氧的革兰阴性杆菌，最早由Edwin Klebs于19世纪末发现。肺炎克雷伯菌是常见的机会性致病菌，占所有革兰阴性感染的1/3，其可致肠外感染，包括尿路感染、膀胱炎、肺炎、肝脓肿、内源性眼内炎、手术切口感染和危及生命的感染，如感染性心内膜炎和败血症。
肺炎克雷伯菌的检测方法多种多样。细菌分离培养是微生物检测的“金标准”，该法虽然可靠，但耗时、费力不能满足快速检测的需要；常用的免疫荧光法虽然具有一定特异性和敏感性，但由于抗体的种类和浓度的影响，结果不稳定，有时会出现假阳性。为克服上述问题，多重荧光定量RT-PCR技术被用来诊断KPn的感染，这种方法具有快速、敏感、特异性强等特点，探针具有高度保守性，大大地提高了检测效率。
但是目前，针对KPn鉴定的基因片段的选择和引物探针的设计存在不合理的现象，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒。该引物探针组合能够准确、快速、灵敏的实现对KPn进行鉴定。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合，包括KPn引物对和KPn探针，序列如下：
KPn上游引物：序列如SEQ ID NO：1所示；
KPn下游引物：序列如SEQ ID NO：2所示；
KPn探针：序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明提供的引物和探针能够在一个反应体系中，具有良好的准确性、特异性和灵敏度，并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒，可以对未知样本中的肺炎克雷伯菌核酸进行快速检测，为诊断肺炎克雷伯菌核酸提供可靠的实验依据，解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。
本发明中肺炎克雷伯菌的引物和探针用于对肺炎克雷伯菌的定性检测。
本发明中，SEQ ID NO：1～2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:7所示。
作为优选，还包括内标引物对和内标探针，序列如下：
内标上游引物：序列如SEQ ID NO：4所示；
内标下游引物：序列如SEQ ID NO：5所示；
内标探针：序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明中，内标的序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明中，KPn探针或内标探针的3’端连接有淬灭基团，5’端连接有荧光基团。
在本发明具体实施例中，KPn探针5’端的荧光基团为FAM荧光基团；内标探针5’端的荧光基团为HEX荧光基团。但荧光基团并非仅限于此，本领域技术人员认可的荧光基团均在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了该引物探针组合在制备检测肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述引物探针组合及Real time PCR反应试剂。
作为优选，Real time PCR反应试剂包括：dNTPs、mLV酶、Taq酶、MgCl2。
作为优选，dNTPs的浓度为1～100mM、mLV酶的浓度为10～500U/μL、Taq酶的浓度为1～10U/μL、MgCl2的浓度为1～100mM。
在本发明提供的具体实施例中，dNTPs的浓度为10mM、mLV酶的浓度为200U/μL、Taq酶的浓度为5U/μL、MgCl2的浓度为50mM。
作为优选，检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；阴性对照为无菌水，阳性对照为人工假病毒。
作为优选，人工假病毒的浓度1×105～1×1010Copies/mL。
在本发明提供的具体实施例中，人工假病毒的浓度1×108Copies/mL。
本发明还提供了一种非诊断目的检测肺炎克雷伯菌的方法，采用上述引物探针组合或者检测试剂盒对样品进行Real time PCR，根据检测的Ct值判断样品是否携带肺炎克雷伯菌；判断包括：
KPn探针通道无荧光值，且内标探针通道的CT值≤40，检测结果为阴性；
KPn探针通道的CT值≤38，且内标探针通道CT值≤40，检测结果为肺炎克雷伯菌阳性；
KPn探针通道CT值>38，但内标探针通道CT值≤40，肺炎克雷伯菌样本浓度低于检测下限；
当内标探针通道CT值>40，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效。
作为优选，Real time PCR的反应体系包括：
Figure BDA0002861043060000031
优选地，Real time PCR的反应体系包括：
Figure BDA0002861043060000032
Figure BDA0002861043060000041
在本发明提供的具体实施例中，Real time PCR的反应体系包括：
Figure BDA0002861043060000042
作为优选，Real time PCR的反应程序包括：
Figure BDA0002861043060000043
优选地，Real time PCR的反应程序包括：
Figure BDA0002861043060000051
本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒。该引物探针组合包括KPn引物对和KPn探针，序列如SEQ ID NO：1～3所示。本发明具有的技术效果如下：
本发明提供的引物探针组合中，包括针对肺炎克雷伯菌引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对KPn的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测肺炎克雷伯菌的最低检测限为0.5CFU/mL。
具体实施方式
本发明公开了一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒的制备
试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：
表1引物、探针序列
序列名称 名称 核苷酸序列
KPn上游引物 SEQ ID NO：1 CCATGCACTACTTCAGCGATTATG
KPn下游引物 SEQ ID NO：2 GTTAATCTGCGTTTCGCCTTTAATAC
KPn探针 SEQ ID NO：3 TGGCGATCAGACTTACGTGCGTTTCG
内标上游引物 SEQ ID NO：4 GTGCGAACGATGGCCTTG
内标下游引物 SEQ ID NO：5 CCGTTTCTCAGGCTGCCTC
内标探针 SEQ ID NO：6 CGGGGAATCAGTGTTCGATTCCGG
试剂盒中还包括：10mM的dNTPs，200U/μL的mLV酶，5U/μL的Taq酶、50mM的MgCl2。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×108Copies/mL的假病毒)。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
本发明的检测方法为Real time RT-PCR，Real Time RT-PCR反应过程为：
每个检测体系的组成如表2：
表2检测体系
10mM的dNTPs 2.5μL；
200U/μL的mLV酶 0.15μL；
5U/μL的Taq酶 1.0μL；
50mM的MgCl<sub>2</sub> 1.6μL；
20mM的SEQ ID NO：1 1.2μL；
20mM的SEQ ID NO：2 1.2μL；
20mM的SEQ ID NO：3 0.5μL；
20mM的SEQ ID NO：4 1μL；
20mM的SEQ ID NO：5 1μL；
20mM的SEQ ID NO：6 0.6μL；
灭菌纯化水 补足至25μL；
荧光检测通道选择：(1)选择FAM通道(ReporTer：FAM，QuenCher：none)，检测人金黄色葡萄球菌；(2)选择HEX通道，检测内标；(3)参比荧光(PAssive ReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。
表3：荧光定量实时PCR反应条件
Figure BDA0002861043060000071
反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：
SEQ ID NO.3所示探针通道无荧光值，且SEQ ID NO.6所示探针通道的CT值≤40，报告KPn检测结果为阴性；
SEQ ID NO.3所示探针通道CT值≤38，且SEQ ID NO.6所示探针通道CT值≤40，报告为KPn阳性；
SEQ ID NO.3所示探针通道CT值>38，但SEQ ID NO.6所示探针通道CT值≤40，报告KPn样本浓度低于检测下限，结果仅供参考；
当SEQ ID NO.6所示探针通道CT值>40，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
实施例3本发明试剂盒的可行性试验
1、最低检测限(LOD)试验
(1)肺炎克雷伯菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎克雷伯菌核酸检测。
(2)细菌样本提取
将管中5个不同浓度的肺炎克雷伯菌人鼻咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出200μL于一个新的离心管中，12000rpm离心3min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μL的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司)，充分混匀，100℃水浴10min，12000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μL处理好的标本上清加入到肺炎克雷伯菌核酸检测试剂反应管中，每个浓度21个复孔，同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎克雷伯菌核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)肺炎克雷伯菌为0.5CFU/mL，具体数据表4。
表4：肺炎克雷伯菌检测限确认
样本浓度(CFU/mL) 检测重复数 阳性检测数 阳性检出率
0 21 0 0.00％
0.2 21 13 61.90％
0.5 21 21 100.00％
1 21 21 100.00％
2 21 21 100.00％
2、与其它疾病的交叉反应情况
(1)肺炎克雷伯菌核酸检测试剂配制，通过采用实施例1的方法制备肺炎克雷伯菌核酸检测试剂。
(2)交叉病原体样本提取
将管中的肺炎克雷伯菌、百日咳杆菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、新隐球菌、巨细胞病毒咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出200μL于一个新的离心管中，12000rpm离心3min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μL的病毒裂解液，充分混匀，100℃水浴5min，12000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μL处理好的标本上清加入到肺炎克雷伯菌核酸检测反应管中，同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的肺炎克雷伯菌作为阳性对照试验，按照实例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎克雷伯菌以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对百日咳杆菌、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、新隐球菌、巨细胞病毒等病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表5。
表5：交叉反应实验
样本名称 检测结果 样本名称 检测结果
肺炎克雷伯菌 阳性 白色念珠菌 阴性
百日咳杆菌 阴性 肺炎支原体 阴性
白喉杆菌 阴性 肺炎衣原体 阴性
流感嗜血杆菌 阴性 金黄色葡萄球菌 阴性
肺炎链球菌 阴性 新隐球菌 阴性
大肠埃希菌 阴性 巨细胞病毒 阴性
铜绿假单胞菌 阴性 阴性对照 阴性
3、对潜在干扰物质的抗干扰性
(1)肺炎克雷伯菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎克雷伯菌核酸检测试剂配制。
(2)样本处理
选取肺炎克雷伯菌高值和低值两个浓度值。肺炎克雷伯菌两个浓度值分别为1×107CFU/mL和1CFU/mL。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。
(3)结果分析
干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。
干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。
试验表明，当样本中含有粘蛋白、头孢他啶、环丙沙星、泰能、左氧氟沙星、头孢吡肟、克林霉素、美满霉素、克拉维酸、舒巴坦等常见的干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表6。
表6：外源物质的抗干扰性实验
药物名称 干扰率(％) 药物名称 干扰率(％)
粘蛋白 0.9 头孢吡肟 1.9
头孢他啶 1.1 克林霉素 0.5
环丙沙星 0.8 美满霉素 1.1
泰能 1.5 克拉维酸 1.7
左氧氟沙星 2.3 舒巴坦 2.1
4、食物残渣中肺炎克雷伯菌的检测。
(1)肺炎克雷伯菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎克雷伯菌核酸检测试剂。
(2)食物残渣中样本提取
将用无菌玻璃管收集5个不同食堂的食物残渣，编号分别为P1-P5，取出米粒大小的食物残渣于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μL的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司)，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。
(3)样本检测
将25μL处理好的标本上清加入到食物残渣核酸检测试剂反应管中，同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对食物残渣核酸检测试剂5个不同湖泊的水样进行检测，表明P1和P4为阳性，P2、P3、P5为阴性，具体数据表7。
表7：食物残渣中病原体的检测实验
水样标本编码 肺炎克雷伯菌
P1 阳性
P2 阴性
P3 阳性
P4 阴性
P5 阴性
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合和检测试剂盒
<130> MP2019799
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatgcacta cttcagcgat tatg 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttaatctgc gtttcgcctt taatac 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcgatcag acttacgtgc gtttcg 26
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcgaacga tggccttg 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgtttctca ggctgcctc 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggggaatca gtgttcgatt ccgg 24
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatgcacta cttcagcgat tatgacagca aagatggcga tcagacttac gtgcgtttcg 60
gttaatctgc gtttcgcctt taatac 86
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgcgaacga tggccttgac gggtaacggg gaatcagtgt tcgattccgg agaggcagcc 60
tgagaaacgg 70

Claims (10)

1.一种肺炎克雷伯菌的引物探针组合，其特征在于，包括KPn引物对和KPn探针，序列如下：
KPn上游引物：序列如SEQ ID NO：1所示；
KPn下游引物：序列如SEQ ID NO：2所示；
KPn探针：序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括内标引物对和内标探针，序列如下：
内标上游引物：序列如SEQ ID NO：4所示；
内标下游引物：序列如SEQ ID NO：5所示；
内标探针：序列如SEQ ID NO：6所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述KPn探针或内标探针的3’端连接有淬灭基团，5’端连接有荧光基团。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述KPn探针5’端的荧光基团为FAM荧光基团；所述内标探针5’端的荧光基团为HEX荧光基团。
5.权利要求1至4中任一项所述的引物探针组合在制备检测肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用。
6.一种肺炎克雷伯菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的引物探针组合及Real time PCR反应试剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Real time PCR反应试剂包括：dNTPs、mLV酶、Taq酶、MgCl2。
8.根据权利要求6或7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为无菌水，阳性对照为人工假病毒。
9.一种非诊断目的检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述的引物探针组合或者权利要求6至8中任一项所述的检测试剂盒对样品进行Realtime PCR，根据检测的Ct值判断样品是否携带肺炎克雷伯菌；所述判断包括：
KPn探针通道无荧光值，且内标探针通道的CT值≤40，检测结果为阴性；
KPn探针通道的CT值≤38，且内标探针通道CT值≤40，检测结果为肺炎克雷伯菌阳性；
KPn探针通道CT值>38，但内标探针通道CT值≤40，肺炎克雷伯菌样本浓度低于检测下限；
当内标探针通道CT值>40，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Real time PCR的反应体系包括：
Figure FDA0002861043050000021
所述Real time PCR的反应程序包括：
Figure FDA0002861043050000022
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892300A (zh) * 2010-02-10 2010-11-24 广州华峰生物科技有限公司 肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法
CN110714090A (zh) * 2019-12-03 2020-01-21 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892300A (zh) * 2010-02-10 2010-11-24 广州华峰生物科技有限公司 肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法
CN110714090A (zh) * 2019-12-03 2020-01-21 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何礼洋;雷连成;贾艳;杨洋;韩文瑜;: "肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛PCR检测方法的建立" *
张燕等: "实时荧光PCＲ 检测血小板制品中常见细菌方法的建立" *

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