CN102373270B - 一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测都柏林念珠菌的试剂盒，该试剂盒包括特异性引物，探针及其他检测所需试剂。所述特异性引物包括特异性引物F和引物R，引物F具有序列表中SEQ ID No.1的核酸序列，引物R具有序列表中SEQ ID No.2的核酸序列，所述探针具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列。本发明提供的试剂盒具有特异性强，检测灵敏性高，速度快等优点，非常适合临床上的广泛使用。
Description
技术领域
本发明涉及念珠菌的检测领域，具体而言，涉及一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒。
背景技术
都柏林念珠菌(Candida dubliniensis，又名杜氏假丝酵母菌)，属于半知菌亚门芽抱菌纲隐球酵母目隐球酵母科念珠菌属，是一种芽管和厚壁孢子阳性的机会致病酵母菌，是1995年7月才被公认的一个新菌种。都柏林念珠菌分离自免疫力极其低下的HIV感染者，感染部位以口咽部居多。随着对都柏林念珠菌研究的增多，在感染者的其他部位如阴道、肺部、血液、心脏等也都发现了都柏林念珠菌。
近年来，由于广谱抗生素的广泛应用、肿瘤化疗、器官移植的开展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由都柏林念珠菌等非白念珠菌引起的深部念珠菌感染日益增多。随着不断地研究发现，都柏林念珠菌很容易对氟康唑产生不可逆的耐药性，体外培养过程也发现其会很快产生对常用抗真菌药物的耐受，但由于都柏林念珠菌的表型特征(如菌落颜色、形态及染色形态)及生化特征均类似于白念珠菌，临床上常常将其误认为是白念珠菌，对患者采用抗菌药物治疗后将会产生严重的药物耐受性，直接危及患者的生命。因此，快速、准确地将白色念珠菌和都柏林念珠菌鉴别开来，对于念珠菌感染性疾病的确诊及制定有效的治疗方案十分重要。
当前临床上主要通过表型鉴定都柏林念珠菌和其他念珠菌，表型鉴定包括芽管试验、厚膜孢子形成试验、CHROM agar显色、微生物自动鉴定系统API 20C AUX、同化试验、45℃温度试验等，这些方法均可在一定程度上鉴定都柏林念珠菌和白念珠菌，但由于两者表型相似，上述方法在敏感性和特异性方面都不理想。下面就针对目前常用的念珠菌检测方法作以下简要阐明：
(一)传统检测方法，包括常规涂片镜检法以及培养法。
1.常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，但它只能区分念珠菌与其他球菌，无法将都柏林念珠菌和白念珠菌区分开来。
2.培养法：是目前临床上确定念珠菌诊断和治疗方案的重要依据，但临床上不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，所以要区分都柏林念珠菌和白念珠菌，还必须要做念珠菌的厚壁孢子试验和芽管试验，大量的实验证明，都柏林念珠菌与白念珠菌在48小时内均可形成厚壁抱子，白念珠菌厚壁抱子一般呈单个顶生，都柏林念珠菌厚壁抱子数量较多，一般呈双顶生或簇生，但这些特点并不稳定存在，所以还是不能准确、有效地区分都柏林念珠菌和白念珠菌。
也有人采用科玛嘉(CHROMagar)培养基，该培养基含有特殊显色物质，在37℃培养48小时后，都柏林念珠菌呈现出墨绿色的菌落，而白色念珠菌则呈现淡绿色的菌落，然而，由于都柏林念珠菌在科玛嘉(CHROMagar)培养基上多传几代后，其墨绿色的菌落逐渐会变为淡绿色，因而采用该方法也不能很好的区分出都柏林念珠菌。
(二)仪器自动化分析鉴定系统
随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定进入了基于生理生化的仪器自动化分析的鉴定系统阶段。近年来，相关的酵母菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等。这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，能鉴定的酵母菌种类较少，只适合做基础性研究，不利于中小型医院的推广使用。
(三)免疫学测定：乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差，无法成功地将都柏林念珠菌和白念珠菌区分开来。
(四)念珠菌的现代分子生物学检测：近年随着分子生物学的发展。基因分型技术因具有良好的稳定性、重复性和准确性已广泛应用于病原微生物检测，大致包括测定真菌染色体DNA中GC含量、染色体组型技术、DNA探针杂交技术、随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和DNA序列分析等。RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily primed PCR)，AP-PCR)，是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、影响因素多、重复性较差等诸多不足。
由此可见，如何设计出一种快速鉴别都柏林念珠菌的方法及途径，便于临床上快速检测出都柏林念珠菌，从而及时有针对性地对都柏林念珠菌用药，是临床上急需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种有效检测样品中都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒。本发明提供的试剂盒具有特异性强，检测灵敏性高，速度快等优点，非常适合临床上的广泛应用。
本发明提供的用于检测都柏林念珠菌的引物，其由引物F及引物R组成，其中引物F具有序列表中SEQ ID No.1的核酸序列，引物R具有序列表中SEQ ID No.2的核酸序列。
本发明提供的用于检测都柏林念珠菌的探针，其具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列。
本发明提供的用于检测都柏林念珠菌的试剂盒，包括清洗液A、清洗液B、DNA提取液、提取固形物、CD-PCR反应液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶N-糖基化酶、内参照、阴性对照以及阳性对照，其中，所述CD-PCR反应液包括超纯水、缓冲液、Mg2+、具有SEQID No.1核酸序列的引物F、具有SEQ ID No.2核酸序列的引物R、以及具有SEQ ID No.3核苷酸序列的探针、dATP、dGTP、dCTP及dUTP。DNA提取液中Triton X-100的体积百分比浓度为0.1-1％，NP-40的体积百分比浓度为0.1-1％，正辛酸的浓度为0.2mol/L。所述内参照物为含大肠杆菌基因stx2A片段的质粒，内参照物的引物F具有序列表中SEQ ID No.4的核苷酸序列，引物R具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列，探针具有序列表中SEQ ID No.6的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测都柏林念珠菌的方法，以被检测样品的总DNA为模板，利用本发明提供的试剂盒进行PCR检测，测试样品中是否含有都柏林念珠菌。可以检测的样品包括痰液、尿液、血液、支气管分泌物等拭子、穿刺液或者胸腹水等临床上常见的检测样品。进行PCR反应的优选反应条件为：37℃-2min，95℃-5min，93℃-20sec，55℃-1min，循环次数为35次。
本发明还提供了上述试剂盒在检测都柏林念珠菌中的应用。
附图说明
图1表示都柏林念珠菌18S rRNA序列；
图2示出了本发明提供的试剂盒的特异性测试结果；
图3示出了本发明提供的试剂盒的灵敏性测试结果；
图4示出了本发明提供的试剂盒的灵敏性测试结果；
图5示出了本发明提供的试剂盒的灵敏性测试结果。
具体实施方式
下面将对本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明利用荧光PCR方法设计了一种检测都柏林念珠菌的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括与都柏林念珠菌DNA靶序列特异性结合的探针，特异性扩增引物及各种试剂成分。利用本发明提供的试剂盒，可快速、便利地检测出都柏林念珠菌，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点，为临床检测都柏林念珠菌并有针对性地用药提供了一条途径。
荧光PCR(Fluorescent PCR)是一种以核酸扩增技术为基础的分子生物学诊断技术，其原理是：探针的5’末端有荧光基团，而3’末端则有荧光淬灭基团(black-hole)。在未进行延伸反应时荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，在延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。这样，一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析。该技术有耗时短、全封闭反应无污染、无需PCR后处理、特异性强、灵敏度高、实时检测、重复性好等特点，非常适合念珠菌这类生长缓慢真菌的快速诊断。本发明提供的荧光PCR技术检测都柏林念珠菌的试剂盒，即通过检测临床采集的样品中是否存在都柏林念珠菌，从而指导念珠菌感染病人的用药，帮助预后判断。下面将详细阐述本发明提供的试剂盒所采用的各个成分。
(一)设计用于检测都柏林念珠菌的靶序列、引物及探针
1.筛选用于检测都柏林念珠菌的靶序列
根据Genebank报道的都柏林念珠菌18S rRNA序列中特异的基因片段(GENEBANK:FM178301.1)，结合软件DNAMAN进行靶序列的筛选，本发明人选取得到特异性针对都柏林念珠菌的靶序列，该靶序列所处基因片段位置如图1所示(位于第315-334碱基)。都柏林念珠菌18S rRNA序列的直接来源为GeneBank，该数据库记载着来自于70000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区(CDS)特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GeneBank数据库中的数据来源有三种：1.直接来源于测序工作者提交的序列；2.与其它数据机构协作交换的数据；3.美国专利局提供的专利数据，由于存在这三种途径，GeneBank数据库也未对其数据的来源途径进行过公开发表，所以发明人无法了解到该序列的原始来源。图1中第295-310个碱基对应正义引物的核酸序列，第372-383个碱基对应反义引物的核酸序列，第315-334个碱基对应探针的核酸序列。
2.设计用于检测都柏林念珠菌的特异引物
方法如下：根据上述都柏林念珠菌18S rRNA序列中特异的基因片段以及筛选出来的靶序列，利用软件DNAMAN及Premier 5根据设计好的条件如退火温度等设计出检测都柏林念珠菌的特异引物，并委托sigma公司合成而得：
引物F：5’-AGCGTCGTTTCTCCCT-3’ (SEQ No.1)
引物R：5’-CTCCGCCTTATACCACTATCA-3’(SEQ No.2)
3.设计用于检测都柏林念珠菌的探针
针对上述引物以及靶基因，设计出与都柏林念珠菌靶基因特异性结合的探针，其序列如下：
探针序列：5’-CCCCTAGGGTTTGGTGTTGA-3’(SEQ No.3)
探针：TET-5’-CCCCTAGGGTTTGGTGTTGA-3’-black-hole
在该序列的5’端具有TET荧光基团，TET是四氯-6-羧基荧光素，其激发波长为522nm，在536nm处具有最大吸收光波。在该序列的3’末端装备有荧光淬灭基团black-hole。探针由sigma公司合成。
(二)试剂盒的组成及制备
表1 试剂盒的各组成成分
| 组成成份 | 规格和数量 |
| 10×浓缩清洗液A | 5mL×1瓶 |
| 10×浓缩清洗液B | 10mL×1瓶 |
| DNA提取液 | 5mL×1瓶 |
| 提取固形物 | 48管 |
| CD-PCR反应液 | 1.1mL×2管 |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 25μL×1管 |
| 尿嘧啶N-糖基化酶(1U/μL) | 10μL×1管 |
| 内参照 | 1mL×1管 |
| 阴性对照(CD) | 1mL×1管 |
| 阳性对照(CD) | 1mL×1管 |
1.所用材料的制备：
(1)清洗液A的配制(10×浓缩)(1L)：清洗液A的浓度可以在0.1-0.5mol/L的范围内。在本发明提供的具体实施方式中，NaOH的浓度为0.3mol/L，具体制备方式是将NaOH用精密电子天平准确称取NaOH 12.000g，完全溶解于900mL纯化水中，容量瓶定容至1L，制得。
(2)清洗液B的配制(10×浓缩)(1L)：向800mL纯化水中加入1M Tris-HCl(pH值为8.0)100mL，0.5M EDTA(pH值8.0)20mL，充分混匀，调节pH值至8.0。加水至1000mL，高压灭菌或0.22μm膜过滤处理。
(3)DNA提取液的配制(1L)：DNA提取液包括Triton X-100、NP-40以及正辛酸。Triton X-100对应的中文名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子型表面活性剂，属于市售产品。NP-40的中文名称为乙基苯基聚乙二醇，是生物领域中常用的裂解，也属于市售产品。Triton X-100在DNA提取液中所占体积百分比为0.1-1％，NP-40所占体积百分比为0.1-1％，正辛酸的浓度为0.2mol/L。表2示出本发明提供的具体实施方式中的DNA提取液的组分成分、配比及其制备方法：
表2
| 组分 | 终浓度 |
| Triton X-100 | 0.5％ |
| NP-40 | 0.3％ |
| 正辛酸 | 0.2M |
其中，用精密电子天平准确称取正辛酸28.8480g，完全溶解于900mL纯化水中，加入5mL Triton X-100及3mL NP-40后，容量瓶定容至1L。
提取固形物的配制：取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比约为：0.5mm∶1.0mm＝9∶1的比例配制出提取固形物，每管约0.15g分装。
(3)内参照物
这里所指内参照物为含有无关基因的质粒。该基因在都柏林念珠菌和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照物检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常。因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验将无效，需再重复。本发明提供的具体实施方式中的内参照物为含大肠杆菌基因stx2A片段的质粒，核酸序列为：GGGACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTGATGTC。该序列信息获自GeneBank数据库。
内参引物F：5’-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3’(SEQ No.4)
内参引物R：
5’-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3’(SEQ No.5)
内参探针序列：
5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’(SEQ No.6)
内参探针：
Texas Red-5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’-black-hole
在该序列的5’端具有Texas Red荧光基团，其激发波长为595nm，在615nm处具有最大吸收光波。
(4)阳性对照：阳性对照为含目的片段的质粒。
(5)阴性对照：浓度为10mM Tris-HCl，1mM EDTA且PH＝8.0的溶液。
2.扩增反应用材料的制备
首先依据表3的配比和配制量，计算并按序号依次加入相应的下列组分物质制得CD-PCR反应液。
表3 CD-PCR反应液的组成成分及比例
| 序号 | 组份 | 初浓度 | 数量 | 序号 | 组份 | 初浓度 | 数量 |
| 1 | 超纯水 | 18.85μL | 8 | 内参引物R | 10μM | 3μL | |
| 2 | 10×缓冲液 | 5μL | 9 | 内参探针 | 10μM | 1μL | |
| 3 | Mg2+ | 25mM | 6μL | 10 | dATP | 100mM | 0.1μL |
| 4 | CD-引物F | 10μM | 3μL | 11 | dGTP | 100mM | 0.1μL |
| 5 | CD-引物R | 10μM | 3μL | 12 | dCTP | 100mM | 0.1μL |
| 6 | CD-探针 | 10μM | 1μL | 13 | dUTP | 100mM | 0.15μL |
| 7 | 内参引物F | 10μM | 3μL |
其中的CD-引物F、CD-引物R、CD-探针是指本发明提供的引物F、引物R及探针。然后按照0.5μL/管的浓度取Taq DNA酶加入CD-PCR反应液中，混匀；按0.2μL/管的浓度将UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)加入到CD-PCR反应液中，充分混匀。Mg2+可以用MgCl2来引入。Taq DNA聚合酶购于TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，其中附带10×缓冲溶液及MgCl2；UNG购于promega普洛麦格生物技术有限公司。
(三)利用本发明提供的试剂盒检测样品中的都柏林念珠菌
1.处理生物样品
痰液：取痰液1.5mL向玻璃管中加入4倍体积的1×清洗液A，摇匀，室温放置15～30分钟待液化；取液化后的标本1mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13 000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
尿液：摇匀尿液，取1.0mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀(沉淀如不明显，可再加入尿液样本重复前步骤)加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
血液：从血培养瓶取100μL至1.5mL离心管中加入1mL清洗液A，颠倒管子混匀后室温静置5分钟，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀(如沉淀呈现红色，重复上述步骤)加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀中加入100μl DNA提取液，备用。
支气管分泌物等拭子：加入1mL清洗液B 1mL(保证清洗液能没过无菌拭子取样部位)，将标本管用震荡器高速震荡2分钟制成标本悬浮液。取出全部悬浮液放入1.5mL离心管中，13000r/min离心5分钟弃上清，加入1mL清洗液B震荡重悬，13000r/min离心5分钟弃上清。加入100μL DNA提取液将沉淀重悬。
穿刺液、胸腹水：摇匀，取1.0mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5分钟；弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
2.DNA的提取
2.1 检测样本的制备：向上述处理好的各样本管中分别加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力震荡器(如美国BioSpec Mini-Beadbeater-16或Vortex-Genie)高速涡旋震荡5min，瞬时离心，加入20μL内参照。
2.2 阴性对照样本的制备：取出阴性对照(1×TE，即浓度为10mM Tris-HCl，1mM EDTA且PH＝8.0的溶液)，8000r/min离心数秒，吸取100μL至1.5ml灭菌离心管中，加入20μL内参照。
2.3阳性对照样本的制备：取出含目的片段的质粒作为阳性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μL至1.5ml灭菌离心管中，加入20μL内参照。阳性对照为含目的片段的质粒。
内参照和阳性对照均为本公司自制，方法是分别用内参和阳性对照的引物扩增出内参stx2A及都柏林假丝酵母菌的目的基因，通过重组DNA方法将stx2A及都柏林目的基因导入质粒，将该质粒转化转化大肠杆菌，提取重组菌的质粒，定量之后即为内参及阳性对照。
3.将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴2分钟，即刻冰浴2-5分钟后13000r/min离心1分钟；上清液用于PCR扩增。
4.加样：向准备好的PCR反应管中分别加入5μL待测样本或阴性对照样本或阳性对照样本，盖紧管盖后瞬时离心，用于PCR扩增。
5.PCR扩增：将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列条件进行扩增反应：
众所周知，PCR反应中反应条件的设置对扩增效率、荧光值等反应效果的影响很大，本试剂盒PCR反应条件的最佳反应条件如上所述，循环可以进行35次，也可根据实践需求，进行不同次数的循环。
6.参考值(参考范围)的确定：利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样品的Ct值，结果如表4所示：
表4 参考范围的测定
7.检验结果的解释
7.1.结果分析条件设定
7.1.1 ABI 7500基线(baseline)设定：取2-10或3-15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct＝35或者“Undet.”为准。
7.1.2 STRATAGENE基线设定：选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct＝35或者“No Ct”为准。
7.2.检测结果的质量标准
利用本试剂盒对样品进行检测时，阴阳性对照应同时满足以下条件，否则视为检测结果无效：
阴性对照：TET Ct值＝35或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)
阳性对照：TET Ct值＜35。
8.结果判定
都柏林念珠菌阴性：TET Ct值＝35或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。
都柏林念珠菌阳性：TET Ct值＜30
样本检测灰度区：30≤Ct样本＜35，如果检测结果落入了该灰度区，则考虑到系统及人为的不确定性因素，可以重复检验确认。
(四)试剂盒的特异性测试
1.采用的材料
用于检测的菌株直接购自于中国生物制品检定所(简称中检所)，其原始来源为中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。
假丝酵母菌菌株参比品部分购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCG)或美国典型菌种保藏中心(ATCC)，每次取一管进行实验来验证本试剂盒的检测特异性，如表5.1和5.2所示；
实验所用荧光PCR仪的型号为STRATAGENE Mx3000P，震荡器的型号为Vortex Genie 2。
5.1 细菌类参比品：(购于中检所)
| 序号 | 菌种保藏编号 | 菌株名称 | 数量 |
| 1 | CMCC 26069 | 表皮葡萄球菌 | 1 |
| 2 | CMCC 28001 | 藤黄微球菌 | 1 |
| 3 | CMCC 63501 | 枯草芽孢杆菌 | 1 |
| 4 | CMCC 63301 | 蜡样芽孢杆菌 | 1 |
| 5 | CMCC 43135 | 大肠埃希氏菌 | 1 |
| 6 | CMCC 32223 | 粪链球菌 | 1 |
| 7 | CMCC 31001 | 肺炎链球菌 | 1 |
| 8 | CMCC 32067 | 酿脓链球菌 | 1 |
| 9 | CMCC 10104 | 绿脓假单胞菌 | 1 |
5.2 真菌类参比品
(购于CMCG或直接购自ATCC)
| 序号 | 菌种保藏编号 | 菌株名称 | 数量 |
| 1 | CMCG 2.1846 | 近平滑假丝酵母 | 1 |
| 2 | CMCG 2.1992 | 克鲁斯假丝酵母 | 1 |
| 3 | CMCG 2.1652 | 丘陵假丝酵母 | 1 |
| 4 | CMCG 2.1835 | 季也蒙假丝酵母 | 1 |
| 5 | CMCG 2.1780 | 清酒假丝酵母 | 1 |
| 6 | CMCG 2.68 | 乳酒假丝酵母 | 1 |
| 7 | CMCG 2.1764 | 间型假丝酵母 | 1 |
| 8 | CMCG 2.1814 | 罗伦隐球酵母 | 1 |
| 9 | CMCG 3.1317 | 烟曲霉 | 1 |
| 10 | CMCG 3.5899 | 黑曲霉 | 1 |
| 11 | CMCG 3.5435 | 黄曲霉 | 1 |
| 12 | ATCC 10231 | 白色念珠菌 | 1 |
| 13 | ATCC 2001 | 光滑假丝酵母菌 | 1 |
| 14 | ATCC 750 | 热带假丝酵母菌 | 1 |
2.试剂盒特异性的检测：
利用本发明提供的试剂盒检测表5.1和5.2所列菌种，检测该试剂盒的特异性，具体方法步骤如下：
试剂准备：将Taq DNA聚合酶和尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)进行瞬时离心后，放于-20℃冰箱中备用，按表7配制反应试剂；
样本处理：将各样本菌液分别用加样器吸取100μl加入1.5ml离心管，离心去上清；
向上述样品管中加入1ml清洗液A，颠倒管子混匀后室温静置5分钟，13000rpm离心5分钟，小心吸弃全部上清。加1ml清洗液B，震荡悬浮细菌，在13000rpm离心3分钟，小心吸弃全部上清。如沉淀呈现浑浊，需重复该步骤。
各加入100μl DNA提取液后震荡悬浮沉淀；各加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力震荡器高速旋涡震荡10分钟，瞬时离心后在95℃干浴5分钟，冰浴2分钟，瞬时离心；吸取上清液用于PCR扩增；
加样：如下表6所示，按样本量配制试剂后均匀分装于PCR反应管然后用石蜡封液，向准备好的PCR反应管中分别加入5μl待测样品或阴性对照样品或阳性对照样品或仅将反应液分装作为NTC，盖紧管盖后瞬时低速离心。
PCR扩增：将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按后附反应条件设置参数，进行扩增反应。
表6
| 序号 | 组分 | 单管用量 | ×24管 |
| 1 | CD-PCR反应液 | 44.3 | 1063.2 |
| 2 | Taq酶(5U/μl) | 0.5 | 12 |
| 3 | UNG酶(1U/μl) | 0.2 | 2.4 |
| 总计 | 45.0 | 1080 | |
| 4 | 模板 | 5.0 | -- |
反应条件如下，进行35次循环：
3.实验结果：从图2的检测结果可以看出，利用本发明提供的试剂盒检测9个细菌类参比品及14个真菌类参比品均未显示有扩增曲线，而阳性对照出现明显的扩增曲线(具有空心方块标记的曲线)；结果全部判断为阴性，说明本发明提供的试剂盒具有非常好的特异性，对上述参比品不具有。
(五)试剂盒的灵敏性测试
灵敏性测试中具体操作与特异性实验的样品处理步骤相同，灵敏性测试的标准品为含目的片段的质粒(即含有都柏林念珠菌靶序列的质粒)，其浓度标定方法是：取提纯的质粒，紫外分光光度法测定其OD值，根据所测OD值计算其含有目的片段的拷贝数，然后按照实验梯度稀释成106、105、104、103、102copies/ml。
以光学显微镜血球计数板详细定量后的质粒标准品稀释梯度，以都柏林念珠菌检测试剂盒进行提取检测，实验结果如下：
1.图3是Mx3000PPCR仪扩增曲线图：分别为106、105、104、103、102copies/ml，为确保实验的准确性，每个浓度都做了复管(即一个浓度下分别准备两个测试管)，由实验结果可以看出该试剂盒可以确保103copies/ml以上的标本被检出。
2、图4和图5是ABI 7500PCR仪扩增曲线图：分别以浓度107、106、105、104、103、102copies/ml进行检测，为确保实验的准确性，每个浓度都做了复管。图中表示曲线沿箭头方向表示浓度从107至103copies/ml。由此可见，可以确保103copies/ml以上的标本被检出，而102copies/ml浓度是无法检测出来的。
从以上实验结果中可以看出，本试剂盒的灵敏度能达到103copies/ml。探针5’端TET荧光标记，3’端blackhole标记，用核酸扩增仪检测荧光强度，提高了检测灵敏度。
(六)试剂盒的快速性检测
本发明提供的试剂盒从样本DNA提取开始到实验结果分析结束，通常仅需要2.5个小时就能完成，这也是本试剂盒的一大优势。在整个试剂盒检测过程中采用了一管式反应，从样本模板提取到最后结果只用时小于2.5小时，与其他生化、分子方法相比具有很大的优势。
以上说明仅为本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于检测都柏林念珠菌的试剂盒，包括清洗液A、清洗液B、DNA提取液、提取固形物、CD-PCR反应液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶N-糖基化酶、内参照物、阴性对照以及阳性对照，其特征在于，所述CD-PCR反应液包括引物及探针；
所述探针的核酸序列为SEQ IDNo.3，所述引物由引物F和引物R组成，所述引物F的核酸序列为SEQ ID No.1，所述引物R的核酸序列为SEQ IDNo.2；
所述清洗液A为NaOH水溶液，所述清洗液B为Tris-HCl/EDTA/水溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参照物为含大肠杆菌基因stx2A片段的质粒，所述内参照物的引物F的核苷酸序列为SEQ ID No.4，所述内参照物的引物R的核苷酸序列为SEQ ID No.5，所述内参照物的探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包括Triton X-100、NP-40以及正辛酸，所述Triton X-100所占体积百分比为0.1-1％，所述NP-40所占体积百分比为0.1-1％，所述正辛酸的浓度为0.2mol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CD-PCR反应液还包括超纯水、缓冲液、Mg2+、dATP、dGTP、dCTP以及dUTP。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒用于PCR检测时，所述PCR检测的反应条件为：37℃-2分钟，95℃-5分钟，93℃-20秒，55℃-1分钟，循环次数为35次。
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