CN106048051B - 一种克柔念珠菌荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，包括CD‑PCR反应液，所述CD‑PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为引物F和引物R，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明还涉及一种检测克柔念珠菌的方法。本发明的试剂盒具有抗干扰能力强、灵敏度高、特异性强且检测速度快、操作方便等优点。

Description

一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及念珠菌的检测领域，具体涉及一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
克柔念珠菌(Candida krusei)，属于酵母亚门芽抱菌纲，酵母目，酵母科念珠菌属。念珠菌属(Candida species)是一种典型的条件致病真菌,是侵袭性真菌病(invasivefungal disease，IFD)的首位致病菌。念珠菌病可累及人体皮肤、黏膜及各内脏器官。侵袭性念珠菌病更可危及生命,其中念珠菌血流感染(BSI)占医院获得BSI中的第4位,其粗病死率可高达39.2％(ICU 47.1％)。念珠菌病,尤其是侵袭性念珠菌病的早期诊断常很困难,很容易导致延误抗真菌治疗,并影响患者预后。
此外，念珠菌菌属还可导致念珠菌性阴道炎，又称外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是在育龄妇女中普遍存在的一种由念珠菌感染引起的外阴阴道感染。目前，念珠菌性阴道炎患病率达40％，在各种阴道炎中位居第2位，并且约75％的健康妇女一生中也会出现念珠菌感染症状。对致病菌未做出明确鉴定前，若盲目使用外用药物，包括抗真菌制剂的滥用，会增加念珠菌的耐药性，使生殖道内菌群紊乱，致使一些对药物不敏感的菌群乘机大量繁殖，易诱发二重感染，提高治愈难度。因此，致病念珠菌菌谱的准确鉴定与分型是制定高效治愈念珠菌性阴道炎方案的必要前提。
侵袭性真菌感染主要是由念珠菌引起，白念珠菌仍占优势，但由于预防性使用唑类抗真菌药物，使得住院患者念珠菌感染的流行病学发生变化，白念珠菌感染呈下降趋势，而对氟康唑敏感性差的非白念珠菌，尤其是对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌的感染则出现升高趋势。克柔念珠菌的毒力虽比白念珠菌弱，但它凭借对非生命物质强大的黏附力，在其表面附着并繁殖，引起口腔、阴道及全身多系统感染，从而对患者生命构成严重的威胁。
目前，针对克柔念珠菌感染治疗的主要药物有两性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑。克柔念珠菌对氟康唑先天耐药，两性霉素B不良反应较大，伊曲康唑可能属剂量依赖性敏感。上述原因的存在使克柔念珠菌感染药物治疗的选择窗狭小。因此，对于克柔念珠菌感染的高危患者，必须积极治疗基础疾病，纠正贫血、低白蛋白血症及电解质紊乱；疑诊患者应早期行侵袭性下呼吸道分泌物检测或其他体液的培养，以提高早期诊断率；同时，通过临床药敏监测，指导临床早期合理、规范用药，切实降低克柔念珠菌感染的发病率及病死率。
念珠菌的检测和鉴定方法主要以形态学为依据，即通过培养或直接镜检阳性为指标。直接镜检的方法简单、快速，但无法鉴定到菌种且阳性率低。目前，临床上主要通过表型鉴定克柔念珠菌和其他念珠菌，表型鉴定包括芽管试验、厚膜孢子形成试验、CHROM agar显色、微生物自动鉴定系统API 20C AUX、同化试验、45℃温度试验等，这些方法均可在一定程度上鉴定克柔念珠菌和白念珠菌，但上述方法在敏感性和特异性方面都不理想。下面就针对目前常用的念珠菌检测方法作以下简要阐明：
(一)传统检测方法，包括常规涂片镜检法和培养法
1.常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，但它只能区分白色念珠菌与其他球菌，无法将都克柔念珠菌和白色念珠菌区分开来。
2.培养法：是目前临床上确定念珠菌诊断和治疗方案的重要依据，但临床上不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，所以要区分克柔念珠菌和白念珠菌一般采用科玛嘉(CHROMagar)培养基培养，该培养基含有特殊显色物质，当致病菌种比较多时，菌落颜色不好区分，容易导致漏诊。
(二)仪器自动化分析鉴定系统
随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定进入了基于生理生化的仪器自动化分析的鉴定系统阶段。近年来，相关的酵母菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK TOC和API Candid系统等。这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，能鉴定的酵母菌种类较少，只适合做基础性研究，不利于中小型医院的推广使用。
(三)免疫学测定
乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差，无法准确鉴定克柔念珠菌。
(四)念珠菌的现代分子生物学检测
近年随着分子生物学的发展。基因分型技术因具有良好的稳定性、重复性和准确性已广泛应用于病原微生物检测，大致包括测定真菌染色体DNA中GC含量、染色体组型技术、DNA探针杂交技术、多重PCR技术、随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphicDNA，RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR反向线点杂交技术(PCR-RLB)和DNA序列分析等。RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily primed PCR)，AP_PCR)，是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、影响因素多、重复性较差等诸多不足。
因此，有必要发明一种快速、准确鉴别克柔念珠菌的方法，便于临床上快速的检测出克柔念珠菌，从而及时有针对性地针对克柔念珠菌用药。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高、特异性强且检测速度快的克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，进一步提供其检测方法，
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，包括CD-PCR反应液、人工构建的内参照物、Taq DNA聚合酶及UNG酶，所述CD-PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为引物F和引物R：
所述引物F的核苷酸序列为：
5’-GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3’(SEQ ID NO.1)；
所述引物R的核苷酸序列为：
5’-ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3’(SEQ ID NO.2)；
所述荧光探针A为：
FAM-5’-AGTACTACACTGCGTGAGC-3’-black-hole(SEQ ID NO.3)；
所述内参照物用于避免检测结果假阴性，所述内参照物为含大肠杆菌基因stx2A片段的质粒，所述内参照物的引物分为内参引物F和内参引物R，所述内参照物的探针为内参探针B：
内参引物F的核苷酸序列为：
5’-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3’(SEQ ID NO.4)；
内参引物R的核苷酸序列为：
5’-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3’(SEQ ID NO.5)；
内参探针B为：
Texas Red-5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’-black-hole(SEQ ID NO.6)。
进一步的，所述CD-PCR反应液还包括超纯水、缓冲液、Mg2+、dATP、dGTP、dCTP及dUTP。
进一步的，还包括DNA提取液、阴性对照以及阳性对照。
进一步的，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇以及正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为0.1-1％，所述乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1-1％，所述正辛酸的浓度为0.2M；所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μL；所述UNG酶的浓度为1U/μL。
进一步的，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，所述荧光探针A的3’端标记black-hole荧光淬灭基团。
本发明还提供一种检测克柔念珠菌的方法，以被检测样品的总DNA为模板，利用本发明提供的克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒进行PCR检测。
进一步的，所述PCR检测的反应条件为：37℃-2min，94℃-2min，94℃-15sec，55℃-45sec，循环次数为40次。
进一步的，所述被检测样品可以是阴道分泌物、痰液、尿液、支气管分泌物等拭子、穿刺液或者胸腹水等临床上常见的检测样品。
本发明的有益效果在于：(1)利用含有与克柔念珠菌DNA靶序列结合特异性的荧光探针及特异性扩增的引物的试剂盒对克柔念珠菌进行荧光PCR检测，从而判断克柔念珠菌的存在；(2)试剂盒通过采用一管式反应，具有操作简单、使用便利的优点；(3)本试剂盒使用了人工构建的重组质粒作为内参照物，该重组质粒插入的DNA片段不含克柔念珠菌和人类基因组同源DNA序列，因此可作为内参照物检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，加之，1U/μL的UNG酶能有效防止扩增产物的污染，避免假阳性实验结果，从而确保PCR结果的可信性；(4)浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶及1U/μL的UNG酶同时用于试剂盒，一方面可以有效防止扩增产物的污染，避免假阳性实验结果，确保PCR快速扩增，同时使得试剂盒的干扰能力增强，不易受其他细菌、真菌的影响，提高了试剂盒的灵敏，同时，该试剂盒还具有特异性强及检测速度快的优点，为临床检测克柔念珠菌并有针对性的用药提供的新的途径。
附图说明
图1为本发明提供的试剂盒的特异性测试结果；
图2为本发明提供的试剂盒的灵敏性测试结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：采用浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶及1U/μL的UNG酶作为反应试剂，对克柔念珠菌基因中特异性核苷酸序列进行PCR扩增检测，以提高检测的抗干扰性及灵敏度，并人工构建特定的内参照物，准确反应检测是否成功，从而判断临床采集的样本中是否存在克柔念珠菌。进而方便临床医生指导克柔念珠菌感染患者用药及预后治疗。
上述克柔念珠菌基因中特异性核苷酸序列为18S rRNA序列。
本发明设计了一种利用荧光PCR方法检测克柔念珠菌的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括与克柔念珠菌DNA靶序列结合特异性的荧光探针，特异性扩增的引物及各种试剂成分。
荧光PCR(Fluorescent PCR)是一种以核酸扩增技术为基础的分子生物学诊断技术，其原理是：探针的5’末端有荧光基团，而3’末端则有荧光淬灭基团(black-hole)。在未进行延伸反应时荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，在延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以起到实时检测的目的。这样，一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化，最后通过标准曲线对模板进行定量分析。该技术有耗时短、全封闭反应、无污染、无需PCR后处理、特异性强、灵敏度高、实时检测、重复性好等特点，采用该技术检测样本无需进行真菌培养可直接进行临床检测，非常适合念珠菌这类生长缓慢真菌的快速检测诊断。
UNG酶防污染技术原理：在扩增过程中以脱氧尿苷(d-UTP)代替脱氧胸苷(d-TTP)，从而得到含有d-UTP的扩增产物。由于扩增产物的量大且非常容易以气溶胶的形式扩散，所以实验室即使严格分区，也难免会受到污染。尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有d-UTP的核酸，使之不能作为扩增模版，在扩增反应前加入UNG酶，破坏反应液中含有d-UTP的核酸。随后将UNG酶灭活，再进行扩增，从而有效地防止实验室内扩增产物的污染，避免假阳性的出现。
浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶及1U/μL的UNG酶同时用于试剂盒，一方面可以有效防止扩增产物的污染，避免假阳性实验结果，确保PCR快速扩增，同时使得试剂盒的干扰能力增强，不易受其他细菌真菌的影响，提高了试剂盒的灵敏度。
内参照原理：试剂盒设置了内参照物，所述内参照物为人工构建的重组质粒，该重组质粒插入的DNA片段不含克柔念珠菌和人类基因组同源DNA序列，因此可作为内参照物检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常。因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验将无效，需再重复。
实施例1
本发明提供的荧光PCR技术检测克柔念珠菌的试剂盒，可用来检测临床采集的样本中是否存在克柔念珠菌，从而指导念珠菌感染病人的用药及预后治疗。下面将详细阐述本发明提供的试剂盒所采用的各个成分。
(一)设计用于检测克柔念珠菌的靶序列、引物及探针
1.筛选用于检测克柔念珠菌的靶序列
本发明人选取得到特异性针对克柔念珠菌的靶序列，该靶序列所处基因片段位置如SEQ ID NO.7所示(位于第54-74碱基)。克柔念珠菌18S rRNA序列的直接来源为GeneBank，该数据库记载着来自于70000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区(CDS)特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GeneBank数据库中的数据来源有三种：1.直接来源于测序工作者提交的序列；2.与其它数据机构协作交换的数据；3.美国专利局提供的专利数据，由于存在这三种途径，GeneBank数据库也未对其数据的来源途径进行过公开发表，所以发明人无法了解到该序列的原始来源。SEQ ID NO.7中第27-49个碱基对应正义引物的核酸序列，第77-101个碱基对应反义引物的核酸序列，第54-74个碱基对应探针的核酸序列。
2.设计用于检测克柔念珠菌的特异引物
方法如下：根据上述克柔念珠菌18S rRNA序列中特异的基因片段以及筛选出来的靶序列，利用DNAMAN软件及Premier 5根据设计好的条件如退火温度等设计出检测克柔念珠菌的特异性引物，并委托sigma公司合成而得：
引物F：5’-GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3’(SEQ No.1)
引物R：5’-ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3’(SEQ No.2)
3.设计用于检测克柔念珠菌的探针
针对上述引物以及靶基因，设计出与克柔念珠菌靶基因特异性结合的探针，其序列如下：
探针序列：5’-AGTACTACACTGCGTGAGC-3’(SEQ No.3)
探针：FAM-5’-AGTACTACACTGCGTGAGC-3’-black-hole
在该序列的5’端具有FAM荧光基团，FAM是-6-羧基荧光素，其激发波长为492nm，在518nm处具有最大吸收光波。在该序列的3’末端装备有荧光淬灭基团black-hole。
(二)试剂盒的组成及制备
表1试剂盒的各组成成分
组成成份 规格和数量
10×浓缩清洗液A 5mL×1瓶
10×浓缩清洗液B 10mL×1瓶
DNA提取液 5mL×1瓶
提取固形物 48管
CK-PCR反应液 1.1mL×2管
Taq DNA聚合酶(5U/uL) 25uL×1管
尿嘧啶N-糖基化酶(UNG酶)(1U/uL) 10uL×1管
内参照 1mL×1管
阴性对照(CK) 1mL×1管
阳性对照(CK) 1mL×1管
1.所用材料的制备：
(1)清洗液A的配制(10×浓缩)(1L)：清洗液A的浓度可以在0.1-0.5mol/L的范围内。在本发明提供的具体实施方式中，NaOH的浓度为0.3mol/L，具体制备方式是用精密电子天平准确称取12.000g NaOH完全溶解于900mL纯化水中，容量瓶定容至1L，制得。
(2)清洗液B的配制(10×浓缩)(1L)：向800mL纯化水中加入1M Tris-HCl(pH值为8.0)100mL，0.5M EDTA(pH值为8.0)20mL，充分混匀，调节pH值至8.0。加水至1000mL，高压灭菌或0.22μm膜过滤处理。
(3)DNA提取液的配制(1L)：DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)以及正辛酸。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)是一种非离子型表面活性剂，属于市售产品。乙基苯基聚乙二醇(NP-40)是生物领域中常用的裂解液，也属于市售产品。Triton X-100在DNA提取液中所占体积百分比为0.1-1％，NP-40所占体积百分比为0.1-1％，正辛酸的浓度为0.2mol/L。表2示出本发明提供的具体实施方式中的DNA提取液的组成成份、配比及其制备方法：
表2
组成成份 终浓度
聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 0.5％
乙基苯基聚乙二醇(NP-40) 0.3％
正辛酸 0.2M
其中，正辛酸的配制：用精密电子天平准确称取正辛酸28.8480g，完全溶解于900mL纯化水中，加入5mL Triton X-100及3mL NP-40后，容量瓶定容至1L。
提取固形物的配制：取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比约为：0.5mm：1.0mm＝9：1的比例配制出提取固形物，每管约0.15g分装。
(4)内参照物
这里所指内参照物为人工构建的重组质粒，该重组质粒插入的DNA片段不含克柔念珠菌和人类基因组同源DNA序列，因此可作为内参照物检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常。因此，当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。
但是目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验将无效，需再重复。
本发明提供的具体实施方式中的内参照物质粒插入DNA序列为含大肠杆菌基因stx2A片段，核酸序列为：GGGACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTGATGTC。该序列信息来自GeneBank数据库。
内参引物F：
5’-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3’(SEQ No.4)
内参引物R：
5’，-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3’(SEQ No.5)
内参探针序列：
5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’(SEQ No.6)
内参探针：
Texas Red-5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’-black-hole
在该序列的5’端具有Texas Red荧光基团，其激发波长为595nm，在615nm处具有最大吸收光波。
(5)阳性对照：阳性对照为含目的片段的质粒。
(6)阴性对照：浓度为10mM Tris-HCl，1mM EDTA且pH＝8.0的溶液。
2.扩增反应用材料的制备
首先依据表3的配比和配制量，计算并按序号依次加入相应的下列组份物质制得CD-PCR反应液。
表3(4)-PCR反应液的组成成份及比例
序号 组份 初浓度 数量 序号 组份 初浓度 数量
1 超纯水 18.85uL 8 内参引物R 10uM 3uL
2 10×缓冲液 5uL 9 内参探针 10uM 1uL
3 Mg<sup>2+</sup> 25mM 6uL 10 dATP 100mM 0.1uL
4 CK-引物F 10uM 3uL 11 dGTP 100mM 0.1uL
5 CK-引物R 10uM 3uL 12 dCTP 100mM 0.1uL
6 CK-探针 10uM 1uL 13 dUTP 100mM 0.15uL
7 内参引物F 10uM 3uL
其中的(4)-引物F、(4)-引物R、(4)-探针是指本发明提供的引物F、引物R及探针。然后按照0.5μL/管的浓度取Taq DNA酶加入(4)-PCR反应液中，混匀；按0.2μL/管的浓度将尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)加入到(4)-PCR反应液中，充分混匀。Mg2+可以用MgCl2来引入。Taq DNA聚合酶购于Takara宝生物工程(大连)有限公司，其中附带10×缓冲溶液及MgCl2；UNG酶购于promega普洛麦格生物技术有限公司。
(三)利用本发明提供的试剂盒检测样品中的克柔念珠菌
1.处理生物样品
痰液：取痰液1.5mL向玻璃管中加入4倍体积的1×清洗液A，摇匀，室温放置15～30min待液化；取液化后的标本1mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13 000r/min离心5min；弃上清液，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
尿液：摇匀尿液，取1.0mL于1.5mL离心管，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀(沉淀如不明显，可再加入尿液样本重复前步骤)加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
血液：从血培养瓶取100μL于1.5mL离心管中加入1mL清洗液A，颠倒管子混匀后室温静置5min，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀加清洗液B1mL混匀，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀(如沉淀呈现红色，重复上述步骤)加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
阴道分泌物等拭子：加入1mL清洗液B 1mL(保证清洗液能没过无菌拭子取样部位)，将标本管用振荡器高速振荡2min制成标本悬浮液。取出全部悬浮液放入1.5mL离心管中，13000r/min离心5min弃上清液，加入1mL清洗液B振荡重悬，13000r/min离心5min；弃上清液，加入100μL DNA提取液将沉淀重悬。
穿刺液、胸腹水：摇匀，取1.0mL至1.5mL离心管，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀加清洗液B 1mL混匀，13000r/min离心5min；弃上清液，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。
2. DNA的提取
2.1检测样本的制备：向上述处理好的各样本管中分别加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力振荡器(如美国BioSpec Mini-Beadbeater-16或Vortex-Genie)高速涡旋振荡5min，瞬时离心，加入20μL内参照。
2.2阴性对照样本的制备：取出阴性对照(1×ΤΕ，即浓度为10mM Tris-HCl,1mMEDTA且PH＝8.0的溶液)，8000r/min离心数秒，吸取100μL至1.5mL灭菌离心管中，加入20μL内参照。
2.3阳性对照样本的制备：取出含目的片段的质粒作为阳性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μL至1.5mL灭菌离心管中，加入20μL内参照。阳性对照为含目的片段的质粒。
内参照和阳性对照均为本公司自制，方法是分别用内参和阳性对照的引物扩增出内参stx2A及克柔念珠菌的目的基因，通过重组DNA方法将stx2A及克柔目的基因导入质粒，将该质粒经转化导入大肠杆菌，提取重组菌的质粒，经测序鉴定导入序列无误后，标定并定量后即为内参及阳性对照。
3.将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴2min，立即放置冰浴中2-5min，然后13000r/min离心1min；取上清液用于PCR扩增。
4.加样：向准备好的PCR反应管中分别加入5μL待测样本或阴性对照样本或阳性对照样本，盖紧管盖后瞬时离心，用于PCR扩增。
5. PCR扩增：将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列条件进行扩增反应：
众所周知，PCR反应中反应条件的设置对扩增效率、荧光值等对检测结果的判读的影响很大，本试剂盒PCR反应条件的最佳反应条件如上所述，循环可以进行40次，也可根据实践需求，设置不同的循环次数。
6.参考值(参考范围)的确定：利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样品的Ct值，结果如表4所示：
表4参考范围的测定
7.检验结果的解释
7.1结果分析条件设定
STRATAGENE基线设定：选择“适合基线(Adaptive baseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct阴性质控品＝40或者“No Ct”为准。
7.2.检测结果的质量标准
利用本试剂盒对样品进行检测时，阴性对照(阴性质控品)、阳性对照(阳性质控品)应同时满足以下条件，否则视为检测结果无效：
阴性对照(阴性质控品)：克柔念珠菌(FAM)Ct值＝40或者“No Ct”(Mx3000P)且内参照(Texas Red)Ct值＜40，且具有较好的对数增长曲线。
阳性对照(阳性质控品)：克柔念珠菌(FAM)Ct值≤30，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值≤40。
8.结果判定
克柔念珠菌阴性：克柔念珠菌(FAM)Ct值＝40或“No Ct”()Mx3000P)且内参照(Texas Red)Ct值<40，且有较好的对数增长曲线，则克柔念珠菌的DNA含量小于检测下限。
克柔念珠菌阳性：克柔念珠菌(FAM)Ct值<40，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值<40。
反应无效：克柔念珠菌(FAM)Ct值＝40或者“No Ct”(Mx3000P)；且内参照(TexasRed)Ct值＝40或者“No Ct”(Mx3000P)。
(四)试剂盒的特异性测试
1.采用的材料
用于检测的菌株直接购自于中国生物制品检定所(简称中检所)，其原始来源为中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。
假丝酵母菌菌株参比品部分购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCG)或美国典型菌种保藏中心(ATCC)，每次取一管进行实验来验证本试剂盒的检测特异性，如表5.1和5.2所示；
实验所用荧光PCR仪的型号为STRATAGENE Mx3000P，振荡器的型号为VortexGenie 2。
表5.1细菌类参比品：(购于中检所)
序号 菌种保藏编号 菌株名称 数量
1 CMCC 26069 表皮葡萄球菌 1
2 CMCC 28001 藤黄微球菌 1
3 CMCC 63501 枯草芽孢杆菌 1
4 CMCC 63301 蜡样芽孢杆菌 1
5 CMCC 43135 大肠埃希氏菌 1
6 CMCC 32223 粪链球菌 1
7 CMCC 31001 肺炎链球菌 1
8 CMCC 32067 酿脓链球菌 1
9 CMCC 10104 绿脓假单胞菌 1
表5.2真菌类参比品
(购于CMCG或直接购自ATCC)
序号 菌种保藏编号 菌株名称 数量
1 CMCG 2.1846 近平滑假丝酵母 1
2 CMCG 2.1992 克鲁斯假丝酵母 1
3 CMCG 2.1652 丘陵假丝酵母 1
4 CMCG 2.1835 季也蒙假丝酵母 1
5 CMCG 2.1780 清酒假丝酵母 1
6 CMCG 2.68 乳酒假丝酵母 1
7 CMCG 2.1764 间型假丝酵母 1
8 CMCG 2.1814 罗伦隐球酵母 1
9 CMCG 3.1317 烟曲霉 1
10 CMCG 3.5899 黑曲霉 1
11 CMCG 3.5435 黄曲霉 1
12 ATCC 10231 白色念珠菌 1
13 ATCC 2001 光滑假丝酵母菌 1
14 ATCC 750 热带假丝酵母菌 1
2.试剂盒特异性的检测：
利用本发明提供的试剂盒检测表5.1和5.2所列菌种，检测该试剂盒的特异性，具体方法步骤如下：
试剂准备：将Taq DNA聚合酶和尿嘧啶N-糖基化酶(UNG酶)进行瞬时离心后，放于-20℃冰箱中备用，按表6配制反应试剂；
表6
序号 组份 单管用量(μL)
1 CD-PCR反应液 44.3
2 Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5
3 UNG酶(1U/μL) 0.2
4 模板 5
总计 50
样本处理：将各样本菌液分别用加样器吸取100μL加入1.5mL离心管，离心去上清；
向上述样品管中加入1mL清洗液A，颠倒管子混匀后室温静置5min，13000r/min离心5min，小心吸弃全部上清。加1mL清洗液B，振荡悬浮细菌，在13000r/min离心3min，小心吸弃全部上清。如沉淀呈现浑浊，需重复该步骤。
各加入100μL DNA提取液后振荡悬浮沉淀；各加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力振荡器高速旋涡振荡10min，瞬时离心后在95℃干浴5min，冰浴2min，瞬时离心；吸取上清液用于PCR扩增；
加样：如下表7所示，按样本量配制试剂后均匀分装于PCR反应管然后用石蜡封液，向准备好的PCR反应管中分别加入5μL待测样品或阴性对照样品或阳性对照样品或仅将反应液分装作为NTC，盖紧管盖后瞬时低速离心。
PCR扩增：将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按后附反应条件设置参数，进行扩增反应。
表7
反应条件如下，进行40次循环：
3.实验结果：从图1的检测结果可以看出，利用本发明提供的试剂盒检测9个细菌类参比品及14个真菌类参比品均未显示有扩增曲线，而阳性对照出现明显的扩增曲线，说明本发明提供的试剂盒具有非常好的特异性。
(五)试剂盒的灵敏性测试
灵敏性测试中具体操作与特异性实验的样品处理步骤相同，灵敏性测试的标准品为含目的片段的质粒(即含有克柔念珠菌靶序列的质粒)，其浓度标定方法是：取提纯的质粒，紫外分光光度法测定其OD值，根据所测OD值计算其含有目的片段的拷贝数，然后按照实验梯度稀释成106、105、104、103、102copies/mL。
以光学显微镜血球计数板详细定量后的质粒标准品稀释梯度，以克柔念珠菌检测试剂盒进行提取检测，实验结果如下：
图2是Mx3000PPCR仪扩增曲线图：分别为106、105、104、103、102copies/mL，为确保实验的准确性，每个浓度都做了复管(即一个浓度下分别准备三个测试管)，由实验结果可以看出该试剂盒可以确保5x102copies/mL以上的标本被检出。
从以上实验结果中可以看出，本试剂盒的灵敏度能达到5x102copies/mL。探针5’端FAM荧光标记，3’端black-hole标记，用核酸扩增仪检测荧光强度，提高了检测灵敏度。
(六)试剂盒的快速性检测
采用本发明提供的试剂盒进行检测，从样本DNA提取到荧光PCR实验结果分析仅需要2.5个小时就能完成，这是本试剂盒的一大优势。而且整个试剂盒检测过程中采用了一管式反应，与其他生化、分子检测方法相比具有很大的技术优势。
本试剂盒具有的特点：
1、DNA提取效果好；
2、抗干扰能力强，不易受其他细菌、真菌的干扰，具有很高的灵敏度与特异性；
3、操作简单方便、快速检测(耗时2.5h)；
4、结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，包括CD-PCR反应液、人工构建的内参照物、TaqDNA聚合酶及UNG酶，其特征在于，所述CD-PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为引物F和引物R：
所述引物F的核苷酸序列为：5’-GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3’；
所述引物R的核苷酸序列为：5’-ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3’；
所述荧光探针A为：FAM-5’-AGTACTACACTGCGTGAGC-3’-black-hole；
所述内参照物用于避免检测结果假阴性，所述内参照物为含大肠杆菌基因stx2A片段的质粒，所述内参照物的引物分为内参引物F和内参引物R，所述内参照物的探针为内参探针B：
内参引物F的核苷酸序列为：5’-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3’；
内参引物R的核苷酸序列为：5’-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3’；
内参探针B为：Texas Red-5’-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3’-black-hole；
所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μL；所述UNG酶的浓度为1U/μL。
2.根据权利要求1所述的一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述CD-PCR反应液还包括超纯水、缓冲液、Mg2+、dATP、dGTP、dCTP及dUTP。
3.根据权利要求1所述的一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取液、阴性对照以及阳性对照。
4.根据权利要求1所述的一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇以及正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为0.1-1％，所述乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1-1％，所述正辛酸的浓度为0.2M。
5.根据权利要求1所述的一种克柔念珠菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，所述荧光探针A的3’端标记black-hole荧光淬灭基团。
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Denomination of invention: A fluorescent PCR detection kit for Candida Klebsiella

Effective date of registration: 20220112

Granted publication date: 20191129

Pledgee: Yao Qingfeng

Pledgor: TRIPLEX INTERNATIONAL BIOSCIENCES (CHINA) Co.,Ltd.

Registration number: Y2022350000005