CN103409509A

CN103409509A - 一种b族链球菌荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN103409509A
Application number: CN2013102756555A
Authority: CN
Inventors: 李荣宇; 刘中华; 王国强; 白杨; 张旭
Original assignee: Jiangsu Perfectus Biotechnologies Co ltd
Current assignee: Jiangsu World Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103409509B

Abstract

本发明公开了一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：包括PCR反应液、酶混合液、B族链球菌反应液、内参质粒、阳性对照和阴性对照。本发明克服了金标准的细菌培养法比较费时、血清学诊断方法滞后性、基因序列测定方法较为复杂和繁琐的缺陷，本发明具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在B族链球菌体外诊断领域具有极大的应用前景。

Description

一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种荧光PCR检测试剂盒，具体涉及一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

B族链球菌(group B streptococcus,GBS)是一种寄生于人类泌尿生殖道及下消化道的条件致病菌，健康人群带菌率可达35%。早在20世纪70年代GBS就已经被证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。定植于产妇生殖道的B族链球菌，可在分娩时垂直传播给新生儿，而新生儿GBS感染所引起的新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等症致死率极高，并可导致神经系统后遗症。2010年美国疾病预防中心制定了《围产期GBS预防指南》，建议孕妇于妊娠35-37周进行GBS筛查。

目前国内对GBS的筛查以培养法为主，检测GBS的金标准为：孕35-37周取阴道及直肠标本，于肉汤培养基培养呈阳性。传统培养法耗时长，且阳性率受到多种因素影响，弊端明显。相比细菌培养法，荧光PCR法检测不仅耗时短，在灵敏度和特异性上也优于培养法，因此研制出一种使用简单、结果准确的B族链球菌PCR检测试剂具有重要的临床意义。

B族链球菌的检测方法主要有细菌培养法，免疫学诊断和分子生物学诊断。细菌培养法是B族链球菌的实验室诊断常规方法，分子生物学诊断中出现了许多快速特异的方法，三种方法具有以下特点：

1）细菌培养法是当前B族链球菌检测的金标准。该方法成本低廉，受人为因素影响较大，并且培养所需耗时较长，不适合当前的临床诊断。

2）血清学方法不能高通量处理样本。由于窗口期的存在，血清学的诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染。该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。

3）细菌核酸检测：由于以上两种方法费时、费力，为了提高检测速度，可直接从临床标本（阴道拭子、肛拭子）中检测细菌的核酸。该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对细菌感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的细菌检测方法。

由此可见，作为金标准的细菌培养法比较费时，血清学诊断方法存在滞后性。此外，基因序列测定方法也较为复杂和繁琐的。

发明内容

为了克服以上不足，本发明提供了一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒。

一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：包括PCR反应液、酶混合液、B族链球菌反应液、内参质粒、阳性对照和阴性对照。

其中，所述的B族链球菌反应液包括以下组分：

组分（1）：由一对检测B族链球菌的引物和一条检测B组链球菌的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

组分（2）：由一对检测人TOP3A基因片段的引物和一条检测人TOP3A基因片段的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

其中，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red和LC RED640中任意两种荧光报告基团，且组分（1）和组分（2）中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra等任意两种荧光淬灭基团。

本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：

检测B族链球菌的引物及探针的配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ IDNo.3为5:5:2；优选的，引物SEQ ID No.1为500nM，SEQ ID No.2为500nM，探针SEQ ID No.3为200nM。

检测人TOP3A基因片段的引物及探针的配比为：SEQ ID No.4:SEQ ID No.5:SEQ ID No.6为5:5:2；优选的，引物SEQ ID No.1为500nM，SEQ ID No.2为500nM，探针SEQ ID No.3为200nM。

B族链球菌/人TOP3A引物探针核苷酸序列见表1：

表1 B族链球菌/人TOP3A引物探针核苷酸序列

名称	序列(5′→3′)
		GBS-FP	TCGACAATGGCAGCTTCGCT（SEQ ID No.1）
GBS-RP	TTAATTTTTGCTAAGACATT（SEQ ID No.2）
		GBS-P	X1-TCATCATATACTGTGAAATA-Y1（SEQ ID No.3）
top3A-FP	TGAGGTGCTGGCAGAGCAGCTCATC（SEQ ID No.4）
		top3A-RP	AACCGCTCCACCACAAAGCCC（SEQ ID No.5）
top3A-P	X2-ACGGCAGCTGCCAGTTCCCCAC-Y2（SEQ ID No.6）

注：X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。

本发明快速检测B族链球菌的核酸检测试剂盒中，所述的酶混合液包括包括Taq酶和UNG酶，所说的Taq酶为热启动Taq酶，所说的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶；

所述的PCR反应液包括5×缓冲液、25mM MgCl₂和10mM dNTPs；

所述的内参质粒为依照人TOP3A基因片段的序列合成的质粒；

所述的阳性对照为灭活的B族链球菌培养液；所述的阴性对照为无菌水。

目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶（5′→3′外切核酸酶活性）切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。

双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记HEX。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记HEX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因（如图1所示）。

本发明的试剂盒采用荧光PCR技术，设计B族链球菌特异性探针，实现对B族链球菌的分子检测。引物和探针的设计采用primer5.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值（A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格）

本发明的B族链球菌荧光PCR检测试剂盒具有如下技术效果：

1）本发明试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间（从标本处理开始）仅为2-3小时。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。

2）本发明具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在B族链球菌体外诊断领域具有极大的应用前景。

附图说明

图1是双重荧光PCR技术原理图；

图2是本发明试剂盒检测样本的曲线图；

图3是本发明试剂盒检测B族链球菌的灵敏度试验结果图；

图4是本发明试剂盒检测B族链球菌的特异性试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒

本实施例的B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、B族链球菌反应液、内参质粒、阳性对照和阴性对照；

其中，PCR反应液包括5×缓冲液、25mM MgCl₂和10mM dNTPs；

B族链球菌反应液包括以下组分：

组分（1）：由一对检测B族链球菌的引物和一条检测B组链球菌的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；检测B族链球菌的引物SEQ ID No.1为500nM，SEQ ID No.2为500nM，探针SEQ ID No.3为200nM；

组分（2）：由一对检测人TOP3A基因片段的引物和一条检测人TOP3A基因片段的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；检测人TOP3A基因片段的引物SEQ ID No.4为500nM，SEQ ID No.5为500nM，探针SEQ ID No.6为200nM。

荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red和LC RED640中任意两种荧光报告基团，且组分（1）和组分（2）中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra等任意两种荧光淬灭基团。

酶混合液：包括Taq酶和UNG酶，Taq酶为热启动Taq酶，UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。

阳性对照为灭活的B族链球菌培养液；阴性对照为无菌水。

所说的内参质粒为依照人TOP3A基因片段的序列合成的质粒。

试验例1本发明试剂盒的的使用方法包括下列步骤：

1、提取样本DNA

1.1取B族链球菌临床拭子样品，加入1ml提取缓冲液，充分混匀后转入1.5ml EP管，13000rmp离心5min，弃去管中的废液。视悬液浑浊情况可重复本步骤。

1.2离心后的沉淀加入50ul提取缓冲液及2ul内参质粒重悬，加入细菌破碎物1管，高速涡旋震荡3min。

1.3将EP管瞬时离心后，99℃干浴10min，立即冰浴2min后13000rpm离心1min，上清即为样本提取液。

2在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的B族链球菌检测试剂和DNA提取样本，其中B族链球菌反应液按照表3配制：

表2

反应液组分	加量（ul）/1人份
		PCR反应液	5
酶混合液	1
		B族链球菌反应液	4
无菌水（阴性参考品）	10
		DNA样本	5
总体积	25

表3

试剂名称	加入体积（μl）/40人份
		GBS FP	6.25
GBS RP	6.25
		GBS P	2.5
top3A FP	6.25
		top3A RP	6.25
top3A P	2.5
		TE缓冲液	170
总计	200

3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：

4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染B族链球菌。扩增曲线如图2所示。

5、质量标准：本试剂盒阴阳性对照应同时符合以下条件，否则判定实验无效。

5.1阴性质控FAM通道内应无典型扩增；阴性质控VIC通道曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0。

5.2阳性质控FAM通道内荧光曲线应呈“S”型曲线且CT≤35.0。

6、结果判定

6.1GBS阴性(低于检测限)：FAM通道无典型“S”型扩增或CT>38.0，VIC通道荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0。

6.2GBS阳性：FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0。

6.3样本检测灰区：FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且35.0≤CT≤38.0，建议复检。如复检曲线呈“S”型曲线且35.0≤CT≤38.0，判定为GBS阳性。

6.4反应无效，需重新测定：FAM通道内荧光曲线CT=40.0或显示“Undet”，同时VIC通道内荧光曲线CT=40.0或显示“Undet”。

5个临床样本具体结果见表4：

表4

试验例2本发明试剂盒的灵敏性试验

阳性参考品为灭活的B族链球菌培养液，来源于江苏省疾病预防控制中心。

阴性参考品为无菌水。

采用本发明试剂盒进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，见图3。试验结果表明，本发明试剂盒对于B族链球菌的诊断具有高度的灵敏性。

试验例3本发明试剂盒的特异性试验

为了检测本发明B族链球菌检测试剂盒的特异性，用本发明B族链球菌检测试剂盒检测大肠杆菌、A族链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪链球菌、肠球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、乳酸杆菌。

检测结果表明：FAM通道仅对B族链球菌进行扩增，表明本发明检测试剂盒能特异性扩增B族链球菌，而不与其它核酸发生交叉反应，见图4。

Claims

1.一种B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：包括PCR反应液、酶混合液、B族链球菌反应液、内参质粒、阳性对照和阴性对照。

2.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的B族链球菌反应液包括以下组分：

3.根据权利要求2所述的荧光PCR检测试剂盒，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red和LC RED640中任意两种荧光报告基团，且组分（1）和组分（2）中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra等任意两种荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测B族链球菌的引物及探针的配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ ID No.3为5:5:2；优选的，引物SEQ ID No.1为500nM，SEQ ID No.2为500nM，探针SEQ ID No.3为200nM。

5.根据权利要求2所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测人TOP3A基因片段的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.4:SEQ ID No.5:SEQ IDNo.6为5:5:2；优选的，引物SEQ ID No.1为500nM，SEQ ID No.2为500nM，探针SEQ ID No.3为200nM。

6.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液包括5×缓冲液、25mM MgCl₂和10mM dNTPs。

7.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括包括Taq酶和UNG酶，所说的Taq酶为热启动Taq酶，所说的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。

8.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的内参质粒为依照人TOP3A基因片段的序列合成的质粒。

9.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的B族链球菌培养液；所述的阴性对照为无菌水。

10.权利要求1-9所述的荧光PCR检测试剂盒在检测B族链球菌中的应用。