CN103421892B - 鉴别空肠弯曲菌及大环内酯类耐药突变的荧光pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明属细菌耐药性分子检测领域。涉及一种鉴别空肠弯曲杆菌及其大环内酯类耐药突变的多重实时荧光PCR方法。设计了特异性的引物和MGB探针及其组合，不仅能够特异性鉴定空肠弯曲杆菌，而且可同时检测空肠弯曲杆菌23SrRNA基因第2074和2075位的核苷酸突变以及核糖体蛋白L4鞭毛基因rplD上第170和221位的核苷酸突变。首次在同一反应体系里，实现了对空肠弯曲杆菌的特异性鉴定和对多种大环内酯类耐药突变点的快速检测。本发明极大地缩短了临床空肠弯曲杆菌鉴定和耐药性检测的时间，为临床感染的治疗用药和空肠弯曲杆菌耐药性监测提供了新的手段。

Description

鉴别空肠弯曲菌及大环内酯类耐药突变的荧光PCR方法

技术领域

本发明属于动物源细菌耐药性检测技术领域。与多重荧光定量PCR方法有关。本发明具体涉及一种利用荧光定量PCR法鉴别空肠弯曲杆菌及其大环内酯类耐药相关突变，在同一反应体系中，不仅可以对空肠弯曲杆菌进行种属鉴定，而且可以同时检测空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药靶基因23S rDNA和rplD基因的变异情况。

背景技术

弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter.lari)等，均为革兰氏阴性、高度可运动、微需氧性和嗜热性细菌。其中，空肠弯曲杆菌广泛存在于各种动物体内，可以通过被污染的水源、生奶和未完全加工熟的肉类食品感染人类，引起人和动物的多种疾病，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要病原菌(Moore et al.，2006)。空肠弯曲杆菌作为一种微需氧菌，对培养条件要求较苛刻，常规的分离培养和生化鉴定耗时费力、灵敏度不高。已有的分子生物学的研究发现，空肠弯曲杆菌的16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA、flaB)、含铁细胞转运相关蛋白基因(ceuE)、细胞致死性膨胀毒素基因(cdt基因)、外膜纤维结合蛋白基因(cadF)、外膜蛋白基因(omp50)以及VS1基因等都可以用作特异性鉴别弯曲杆菌的靶基因。其中，VS1基因特异性存在于空肠弯曲杆菌中。2003年，阳成波等(Yang et al.，2004)根据空肠弯曲菌的VS1基因中的保守片段设计了一对特异性引物，建立一种快速从食品和水中检测空肠弯曲杆菌的PCR方法。检测结果显示该PCR方法只对空肠弯曲杆菌能扩增出358bp的片段，而对结肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均不能扩增出该片段，检测灵敏度达8CFU/ml，特异性与常规生化检查是一致的。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准-食品中多种致病菌快速检测-PCR方法中所用的特异性引物也是根据空肠弯曲菌特有的靶序列VS1基因设计的，长度也为358bp。

大环内酯类药物，是空肠弯曲杆菌感染的首选药物之一。随着此类药物，如红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素和替米考星等，在兽医和人医临床中的广泛应用和不合理使用，弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性问题已经引起了世界的广泛关注。23S rRNA V区和核糖体蛋白L4、L22上的位点突变是介导空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物耐药性的主要途径(Payot et al.，2006)。其中23S rRNA V区的位点突变通常导致空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的高水平耐药(红霉素MIC≥256μg/ml)，核糖体蛋白L4和L22上的位点突变往往出现在中水平耐药(红霉素MIC为8～128μg/ml)菌株中。目前用于检测空肠弯曲杆菌对大环内酯类耐药性的方法有：PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链探针反向杂交(PCR-LiPA)、焦磷酸测序、错配PCR(MAMA-PCR)和实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)等。

Niwa等(Niwa et al.，2001)在2001年建立了一种PCR-LiPA方法，他们利用10个寡核苷酸探针来检测大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的23S rDNA上2072、2073和2074位点的突变，检测结果与DNA测序结果一致，准确性较高。但是该方法需经过引物标记、PCR扩增、寡核苷酸探针胶条的制备、反向杂交和酶联免疫显色等多个步骤，工序多，耗时长，操作繁琐，不够方便快捷。

Vacher等(Vacher et al.，2003)于2003年建立了一种用于检测空肠弯曲杆菌23S rRNA上耐药相关突变的PCR-RFLP方法。他们先用PCR扩增出空肠弯曲杆菌核糖体23SrRNA V区的一段316bp的片段，然后用BsaI和BceAI两种酶进行切割，产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的长度来判断是否存在耐药相关突变。该方法需要先后经过PCR扩增、特异性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳三个步骤，操作相对比较繁琐，耗时长。

Alonso等(Alonso et al.，2005)在2005年建立了一种MAMA-PCR方法，用于检测空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌中23S rRNA上与红霉素耐药相关的突变。该方法比传统测序方法和PCR-RFLP成本低、耗时短，并且简便易行。但是由于无法摆脱普通PCR最后要用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的步骤，因此无法避免EB(DNA显色剂)对人体的伤害。

Vacher等(Vacher et al.，2005)在2005年建立了一种Real Time-PCR方法，用于检测对红霉素耐药的C.jejuni、C.coli和C.lari中23S rDNA上的A2074C和A2075G突变。该方法与其他PCR方法相比更加灵敏和快速，整个检测过程大概耗时2h左右，准确性高。但是，该方法只能够检测到23SrDNA上的高水平耐药相关突变，而对不含此类突变的中低水平耐药菌则无能为力，并且该方法的特异性不高，对于弯曲菌属内的C.coli、C.jejuni和C.lari不能够准确区分。

娜仁高娃等(Ren et al.，2011)在2011年通过焦磷酸测序技术对空肠弯曲杆菌标准菌(ATCC33560)和临床分离的58株对红霉素敏感程度不同的弯曲杆菌进行检测，取得了良好的检测效果。该方法是一种新型的DNA测序技术，准确性较高，但是也存在缺点，如操作较为复杂，且检测通量低等。

郝海红(Hao et al.，2010)等在2010年建立了一种实时荧光定量PCR TaqMan探针技术，用于检测C.jejuni、C.coli和C.lari中23SrDNA A2074C和A2075G两个基因突变。该方法基于TaqMan探针技术，可以对23S rDNA中A2074C和A2075G这两个突变进行定量分析，灵敏度较高。2008年该项技术申报国家发明专利，并于2010年获得授权(专利号：200810048093X，发明名称：一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变点的荧光定量PCR方法)。然而，该项技术尚具有一些不足，比如，①该技术不能将空肠弯曲杆菌同其他弯曲杆菌(如结肠弯曲杆菌和胎儿弯曲杆菌)中区别鉴定出来；②该技术只能检测23SrDNA中A2074C和A2075G两个位点突变，且该方法是单重的荧光定量PCR方法，检测两个位点突变的探针是分开在两个独立的反应体系里的。随着对空肠弯曲杆菌耐药性机理的研究进展，新的大环内酯类耐药突变逐渐被发现，单重的荧光定量PCR方法虽然在特异性和灵敏性方面具有优势，但是考虑到于成本和操作方面问题，我们需要建立更方便快速的多重荧光定量PCR方法，以鉴别空肠弯曲杆菌及其已知的大环内酯类耐药相关突变。

此外，随着探针技术的发展，TaqMan MGB探针成为荧光定量PCR技术里的新秀。相比常规TaqMan探针技术，TaqMan MGB探针技术有两个主要的不同：一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭基团(non-fluorescent quencher)，取代了常规可发光的TAMRA荧光淬灭基团。这使得荧光本底值大大降低，荧光光谱分辨率得到提高。二是探针3’端还连接了MGB(minor groove binder)结合物，使得探针的Tm值提高了大约10℃，大大增加了探针与模板的杂交稳定性，使结果更精确、分辨率更高。而且同样的Tm值要求下，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，又提高了探针设计的成功率。因此，TaqMan MGB探针相比常规TaqMan探针技术，具有探针设计更短、探针合成成本更低、探针设计的成功率更高、检测分辨率更高、稳定性和特异性更好以及灵敏性更高等优势。

发明内容

本发明的目的是在于克服已有检测方法的不足，提供一种多重荧光定量PCR方法，利用该方法可以快速鉴别空肠弯曲杆菌，并同时检测大环内酯类耐药靶基因23S rDNA和rplD基因的变异情况。

本发明利用实时荧光定量PCR TaqMan MGB探针技术，依据空肠弯曲杆菌的特异性诊断基因VS1基因序列，设计引物和探针组合对空肠弯曲杆菌进行特异性种属鉴别。依据空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突区23S rDNA基因序列，设计特异性引物和探针组合，以检测高水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌23SrDNA上第2074和2075位的碱基突变。依据空肠弯曲杆菌核糖体L4编码基因rplD序列，设计特异性引物和探针组合，以检测中低水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌rplD上170和221位的碱基突变。

本发明利用MGB探针的优势，在4条探针的5’端分别标记了3种不同的荧光基团(如HEX、TAMRA、FAM)，分别识别野生型VS1基因序列(HEX标记)、野生型23S rDNA序列(TAMRA标记)和突变型rplD序列(FAM)。探针3’端标记了自身不发光的淬灭基团(non-fluorescent quencher)，并连接了MGB(minor groove binder)结合物，以增加了探针与模板的杂交稳定性，使结果更精确，分辨率更高。

本发明通过对Mg²⁺浓度、引物和探针配比浓度以及反应条件的优化，实现了3对引物和4条探针的有机配合，使细菌鉴别和耐药突变检测的过程可以同时在一个多重荧光PCR反应中完成，不仅缩短了空肠弯曲杆菌鉴别和耐药突变检测的周期，而且保证了方法的特异性和灵敏性。

具体地，本发明包括以下步骤：

a、根据空肠弯曲杆菌的VS1基因序列，设计和合成了一对引物(VS1-RT-F和VS1-RT-R)和一个MGB荧光探针(VS1-MGB)组合，以特异性地对空肠弯曲杆菌进行种属鉴别(具体步骤见实施例1)；

b、根据空肠弯曲杆菌23S rRNA序列，设计和合成了一对引物(23S-RT-F和23S-RT-R)以及一个MGB荧光探针(23SrRNA-MGB)组合，以特异性识别高水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌23S rDNA基因第2074位和2075位的碱基突变(具体步骤见实施例1)；

c、根据空肠弯曲杆菌核糖体蛋白L4编码基因rplD序列，设计和合成了一对引物(rplD-RT-F和rplD-RT-R)和两个MGB荧光探针(170A-MGB和221-MGB)组合，以特异性识别中低水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌rplD基因的170位和221位的碱基突变(具体步骤见实施例1)；

d、运用分子克隆和定点诱变方法人工构建8种对照质粒(具体步骤见实施例2)。其包括1个野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)，1个野生型rplD对照质粒(W-rplD)，4个突变型23S rDNA对照质粒(M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T、M-A2075G)和2个为突变型rplD对照质粒(M-G170A、M-G221A)；

e、根据步骤a、步骤b和步骤c中所设计的3对引物、4个MGB荧光探针，设计引物探针的浓度范围，并选择反应试剂中的Taq酶和Mg2+的浓度范围。优化实时荧光定量PCR反应体系和反应条件，建立多重实时荧光定量PCR反应体系(具体步骤见实施例3)；

f、应用步骤e中确定的最优多重荧光定量PCR方法，检测空肠弯曲杆菌ATCC33560、结肠弯曲杆菌ATCC33559、金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌C84010、鼠伤寒沙门氏菌CVCC542、绿脓假单胞菌CVCC2087、粪肠球菌CVCC1297、屎肠球菌CVCC1298和产气荚膜梭菌CVCC1144共9种肠道常见细菌，来考察本发明步骤a中设计的引物和探针组合的特异性(具体步骤见实施例4)；

g、应用步骤e中确定的最优多重荧光定量PCR方法，检测步骤d中人工构建的野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)和4个突变型23S rDNA对照质粒(M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T、M-A2075G)，来考察本发明步骤b中设计的引物和探针组合的特异性(具体步骤见实施例5)；

h、应用步骤e中确定的最优多重荧光定量PCR方法，检测步骤d中人工构建的野生rplD对照质粒(W-rplD)和2个突变型rplD对照质粒(M-G170A、M-G221A)，考察本发明步骤c中设计的引物和探针组合的特异性(具体步骤见实施例6)；

i、用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取空肠弯曲杆菌RM1221、空肠弯曲杆菌SE和空肠弯曲杆菌STY(该三个菌株参见文献：Almofti，Y.A.，Dai，M.，Sun，Y.，Hao，H.，Liu，Z.，Cheng，G.，Yuan，Z.，The physiologic and phenotypic alterations due to macrolide exposure in Campylobacterjejuni.Int J Food Microbiol 2011，151，52-61)的基因组DNA，应用步骤e、步骤f、步骤g和步骤h中优化的MGB探针荧光定量PCR方法进行检测，考察该多重荧光定量PCR方法的准确性和特异性(具体步骤见实施例7)。

上述步骤a中所述的两个引物的DNA序列如下所示：

正向引物VS1-RT-F：5’CAA ACC ATA AGA CAA AGG ACG C3’，

反向引物VS1-RT-R：5’CAC TGC CAT ACC CGC ACT AT3’；

上述步骤a中所述的VS1-MGB荧光探针5’端以HEX荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团(non-fluorescent quencher，简称NFQ)和小沟结合物(minor groove binder，简称MGB)标记。其DNA序列如下：

探针VS1-MGB：(HEX)-TAGCCACGATATTC-(MGB)；

步骤a引物对VS1-RT-F和VS1-RT-R扩增的片段长度为214bp，位于空肠弯曲杆菌特异性鉴别基因VS1全序列(GI：296939)的931～1144位，本发明扩增的具体片段的核苷酸序列如下：

931-GTAATATTTTTATTTTTCAAAAGAATGAAAAATTAGAACATAGCGAGCAAAAGTTAGTTAATTTATTAATAAGTGAGTAAAAAAATGTGTGGAATCGTAGGCTATATAGGAAATAATGAAAAAAAACAAATTATACTAAATGGACTTAAAGAATTATG -1144(下划线为引物VS1-RT-F和VS1-RT-R的结合序列，波浪线为探针VS1-MGB的结合序列)。

上述步骤b中所述的两个引物的DNA序列如下：

正向引物23S-RT-F：5’GAT CCA GTG AAA TTG TAG TGG AGG T3’，

反向引物23S-RT-R：5’AAG TAG CAG TGT CAA GCT GTA GTA AAG G3’；

上述步骤b中所述的23Sr RNA-MGB荧光探针5’端以TAMRA荧光基团标记，3’端以NFQ和MGB标记，该探针可与野生型23S rRNA基因全序列(GI：3245050)的第2068～2080位序列结合，从而检测23S rRNA基因原始序列的第2074和2075位是否发生突变，本发明的探针序列如下：

23SrRNA-MGB：(TAMRA)-AGACGGAAAGACC-(MGB)；

上述步骤b中引物对23S-RT-F和23S-RT-R扩增的片段长度为96bp，位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因23S rRNA基因全序列(GI：3245050)第2020～2115位，本发明扩增的片段的核苷酸序列如下所示：

2020-GAAAATTCCTCCTACCCGCGGCA CCGTG-2115(下划线为引物23S-RT-F和23S-RT-R的结合序列，波浪线为探针23SrRNA-MGB结合序列，方框中的碱基为突变位点，其对应于23S rRNA全序列的第2074位和2075位碱基)。

上述步骤c中所述的引物对的DNA序列如下：

正向引物rplD-RT-F：5’AAG TTT AAG AGC AAA TAC AGC TCA TAC TAA AG 3’，

反向引物rplD-RT-R：5’CAC CGC CTA CCC AAA CGT TA3’，

上述步骤c中设计了两个MGB荧光探针，分别针对核糖体蛋白L4编码基因rplD全基因的第170和221位点设计，其探针5’端都以FAM荧光基团标记，3’端以NFQ和MGB标记，探针的DNA序列分别如下：

探针170A-MGB：(FAM)-ACCACCATCACTTAC-(MGB)，

探针221A-MGB：(FAM)-TTGTTGAATCCGCTCTA-(MGB)；

利用步骤c引物对rplD-RT-F和rplD-RT-R扩增得到134bp的片段，其位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因rpID全序列(GI：905980)的第120～253位，扩增的片段的核苷酸序列如下：

120- GTAGAAGTGATGGTAAAAAACCTTGGAGACAAAAAGGTCGTGGCGGTGCGAAC -253(下划线为引物rplD-RT-F和rplD-RT-R的结合序列，波浪线分别为探针170A-MGB和探针221A-MGB的结合序列，方框中的碱基为rplD全基因序列中第170和221位碱基)。

上述步骤d中的8种对照质粒其包括1个野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)，1个野生型rplD对照质粒(W-rplD)，4个突变型23S rDNA对照质粒(M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T、M-A2075G)和2个为突变型rplD对照质粒(M-G170A和M-G221A)。其中野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)是先用一对引物(23S-F和23S-R)PCR扩增空肠弯曲杆菌标准菌NCTC11168中23SrDNA(GI：3245050)上第1994～2151位的147bp的基因片段，野生型rplD对照质粒(W-rplD)是先用一对引物(rplD-F和rplD-R)PCR扩增空肠弯曲杆菌标准菌NCTC11168中rplD基因(GI：905980)上第120～389位的270bp的rplD基因片段；PCR产物分别回收后，使用宝生物工程大连有限公司生产的TA克隆试剂盒连接到pMD18-T载体(该试剂盒中自带)中构建而成的TA克隆重组质粒(见实施例2)。另外，针对空肠弯曲杆菌23S rDNA上4种常见突变类型和rplD基因上2种突变类型，设计定点诱变引物，采用温度梯度PCR进行野生型质粒进行定点诱变，产物经Dpn I酶消化后，转化到DH5α感受态细胞，通过AMP抗性平板筛选出的阳性克隆，送金斯瑞生物技术有限公司进行基因测序确证定点诱变成功。通过这些过程，最终将野生型23SrDNA对照质粒(命名为W-23SrDNA)诱变成含有A2074C、A2074G、A2074T和A2075G位点突变的重组质粒(分别命名为M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T和M-A2075G)，将野生型rplD对照质粒(命名为W-rplD)诱变成为含有G170A和G221A位点突变的重组质粒(分别命名为M-G170A和M-G221A)(具体步骤见实施例2)。

步骤e中的主要反应试剂是购自宝生物工程大连有限公司的10×PCR buffer，25mM的MgSO4，2.5mM的dNTPs和Taq DNA聚合酶。在多重荧光定量PCR反应体系中引物、探针、Mg²⁺浓度、Taq酶用量是影响荧光PCR扩增效果的关键参数。本发明因此分别设置了引物、探针、Mg²⁺浓度、Taq酶的浓度范围。通过优化多重反应体系中引物、探针、Mg²⁺浓度、Taq酶用量和反应条件，确定反应体系中的Taq酶为2.5U，MgSO₄1.5mM，dNTPs 100μM，6条引物(编号为VS1-RT-F和VS1-RT-R、23S-RT-F和23S-RT-R及rplD-RT-F和rplD-RT-R)各0.2μM，VS1-MGB探针和23SrRNA-MGB探针各为0.4μM，170A-MGB探针和221A-MGB探针各为0.2μM为最优反应体系。此外，在多重PCR反应条件中，退火温度是影响反应效果的关键参数，本发明因此设置了系列退火温度范围，最终确定的最优退火温度为56～60℃。本发明中所述的多重荧光PCR方法的优化过程见实施例3。

步骤i中所述的空肠弯曲杆菌SE和空肠弯曲杆菌STY是用红霉素和泰乐菌素体外诱导空肠弯曲杆菌RM1221所获得的耐药菌。经过测序鉴定，发现在空肠弯曲杆菌SE的23S rDNA上第2074位有一个A\C突变，在空肠弯曲杆菌STY的rplD基因上第170位有一个G\A突变(见Almofti et al.，2011)。

经过步骤f、步骤g、步骤h和步骤i的考察，本发明鉴定空肠弯曲杆菌的准确率为100％，检测大环内酯类耐药突变的准确率100％，证明本发明的方法特异性好。

与现有技术相比本发明积极效果在于：

(1)本发明设计出可以特异性鉴别空肠弯曲杆菌的引物和探针(VS1-RT-F/R和VS1-MGB)，可以将空肠弯曲杆菌与其他弯曲杆菌属和其他肠道细菌鉴别开来。由此省掉了漫长的细菌分离、纯化和培养过程，节约了细菌培养成本，缩短了细菌鉴定和检测周期。

(2)本发明首次设计了一对引物(rplD-RT-F/R)和两条探针(170A-MGB和221A-MGB)，用于检测空肠弯曲杆菌核糖体蛋白L4编码基因rplD上G170A和G221A特异性突变，相比以往的所有检测方法，本发明首次涉及检测中低水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌上rplD基因的耐药相关位点突变。

(3)本发明通过优化反应体系和反应条件，应用一种多重荧光定量PCR反应，不仅可以对空肠弯曲杆菌进行特异性鉴定，而且可以同时检测已知的大环内酯类耐药相关突变，相比以往的方法，本发明的适用范围更广。本发明中特异性探针的设计，保证了检测的准确性。本发明从细菌鉴定到耐药突变分析，整个过程大约只需1.5h，是一种快速的检测手段，对于临床空肠弯曲杆菌的鉴别诊断、耐药性分析和治疗用药的选择具有重要的意义。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是引物23S-RT-F的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是引物23S-RT-R核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是探针23SrRNA-MGB的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是引物rplD-RT-F的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是引物rplD-RT-R的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是探针170A-MGB的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：7是探针221A-MGB的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：8是引物VS1-RT-F的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：9是引物VS1-RT-R的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：10是探针VS1-MGB的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：11是用引物VS1-RT-F和VS1-RT-R扩增得到的VS1基因片段，序列长度为214bp。

序列表SEQ ID NO：12是用引物23S-RT-F和23S-RT-R扩增得到的23SrDNA基因片段，序列长度为96bp。

序列表SEQ ID NO：13是用引物rplD-RT-F和引物rplD-RT-R扩增得到的rplD基因片段，序列长度为134bp。

图1：本发明的引物和探针在VS1、23SrDNA和rplD全基因序列中的位置截屏集信息示意图。图中：

图1A：为VS1基因(登录号GI：296939)中第931～1144位碱基序列截屏图及相关信息说明，对应本发明序列表SEQ ID NO：11所示序列。在图1A中：下划线序列是引物VS1-RT-F和VS1-RT-R结合部位；波浪线表示探针VS1-MGB结合部位。

图1B：是23S rRNA(登录号GI：3245050)中第1995～2151位碱基序列截屏图及相关信息说明，图中：下划线序列是引物23S-RT-F和23S-RT-R的结合序列；阴影部分是23S rRNA全序列的第2020～2115位，即本发明的引物23S-RT-F和23S-RT-R所扩增序列，扩增序列(片段)长96bp，对应本发明扩增的如序列表SEQ ID NO：12所示的序列。在图1B中：波浪线表示探针23SrRNA-MGB结合序列；方框中是23S rRNA全序列第2074位和第2075位碱基序列(详见实施例1)；23S rRNA(登录号GI：3245050)全序列中第1995～2151位所示碱基序列即是野生型质粒W-23SrDNA的插入序列，其中下圆点代表引物23S-F和23S-R的结合序列(详见实施例2)。

图1C：是rplD基因(登录号GI：905980)全序列中第120～389位所示的碱基序列截屏图集相关信息说明，图中：下划线是引物rplD-RT-F和rplD-RT-R的结合序列；阴影部分是rplD基因全序列第120～253位，即本发明的引物rplD-RT-F和rplD-RT-R的扩增序列，该扩增序列(片段)长134bp，对应本发明扩增的如序列表SEQ ID NO：13所示序列。图1C中：波浪线是本发明设计的探针170A-MGB和探针221A-MGB的结合序列；方框中从前到后分别是rplD基因全序列的第170位和221位(详见实施例1)。rplD基因(登录号GI：905980)全序列中第120～389位碱基序列即是野生型质粒W-rplD的插入序列，其中下圆点代表引物rplD-F和rplD-R的结合序列(详见实施例2)。

图2：VS1-MGB探针的鉴别空肠弯曲杆菌的特异性考察结果。应用本发明建立的方法检测包括空肠弯曲杆菌标准菌ATCC33560、结肠弯曲杆菌ATCC33559、金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌C84010、鼠伤寒沙门氏菌CVCC542、绿脓假单胞菌CVCC2087、粪肠球菌CVCC1297、屎肠球菌CVCC1298和产气荚膜梭菌CVCC1144这9种肠道菌。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值(389.93)。图中唯一的一个荧光信号为空肠弯曲杆菌标准菌ATCC33560的基因组DNA的检测结果。其他菌的荧光强度值均为0，检测结果为阴性。结果表明，本发明中VS1-MGB探针仅与空肠弯曲杆菌的VS1基因片段特异性结合，可对空肠弯曲杆菌进行特异性鉴定。

图3：为23SrRNA-MGB探针突变识别空肠弯曲杆菌23S rDNA基因突变的特异性考察结果。应用本发明建立的方法检测1个野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)和4种突变型23S rDNA对照质粒(M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T、M-A2075G)。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度。图中唯一的一个荧光信号为野生型23S rDNA对照质粒(W-23S rDNA)的检测结果。其他四种突变型23SrDNA对照质粒的荧光强度值接近0，检测结果判定为阴性。由于23SrRNA-MGB探针是与野生型基因序列完全互补配对的，因此，当加入在2074或2075位点含有突变的质粒时，探针无法与之互补结合，也就无法检测到该探针的荧光信号，表明该条突变检测探针的突变识别能力良好。

图4：rplD引物和MGB探针识别空肠弯曲杆菌rplD基因突变的特异性考察结果。应用本发明建立的方法检测1个野生型rplD对照质粒(W-rplD)和2个为突变型rplD对照质粒(M-G170A、M-G221A)。图中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度。其中：

图4A：170A-MGB探针突变识别能力的考察结果。图中唯一的一个荧光信号为突变型rplD对照质粒(M-G170A)检测结果。而野生型rplD对照质粒(W-rplD)和突变型rplD对照质粒(M-G221A)的荧光值低于阈值(484.41)。因170A-MGB探针只对rplD基因上含有G170A位点突变的模板能够检测到相应的荧光信号，表明该探针的突变识别能力良好。

图4B：221A-MGB探针突变识别能力的考察结果。图中唯一的一个荧光信号为突变型rplD对照质粒(M-G221A)检测结果。而野生型rplD对照质粒(W-rplD)和突变型rplD对照质粒(M-G170A)的荧光值低于阈值(1165.61)。因221A-MGB探针只对rplD基因上含有G221A位点突变的模板能够检测到相应的荧光信号，表明该探针的突变识别能力良好。

图5：是应用本发明所建立的方法检测1株大环内酯类敏感型空肠弯曲杆菌RM1221和两株大环内酯类耐药菌(空肠弯曲杆菌SE和空肠弯曲杆菌STY)的结果。其中：

图5A：是应用本发明检测敏感型空肠弯曲杆菌RM1221的结果。由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；因为敏感菌中23S rRNA基因第2074和2075位无位点突变，所以能够检测到与野生型互补的23S rRNA-MGB探针信号；由于敏感菌的rplD基因上没有突变，因此检测不到170A-MGB或221A-MGB探针的荧光信号。

图5B：应用本发明的方法检测高水平大环内酯类耐药型空肠弯曲杆SE的结果。由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；因为该菌的23S rRNA上含有A2074C突变，探针23SrRNA-MGB无法与靶序列相结合，因此无法检测到23SrRNA-MGB探针荧光信号；由于该菌的rplD上没有突变，因此检测不到170A-MGB或221A-MGB探针的荧光信号。

图5C：是应用本发明方法检测低中水平大环内酯类耐药型空肠弯曲杆菌STY的检测结果。由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；由于不含23SrRNA基因突变，因此可以检测到23SrRNA-MGB探针荧光信号；因为该菌的rplD基因上含有G170A突变，因此可以检测到170A-MGB探针的荧光信号。

具体实施方式

实施例1：引物和探针的设计及性能考察

根据NCBI公布的空肠弯曲杆菌标准菌株(Campylobacter jejuni NCTC11168＝ATCC700819)全基因组(NC_002163.1)的VS1基因序列(GI：296939)、23S rRNA序列(GI：3245050)和rplD基因序列(GI：905980)，利用Primer Premier 5和Primer Express 2.0软件设计三对引物，分别用于扩增空肠弯曲杆菌特有的VS1基因214bp片段(VS1全基因第931～1144位)、23S rRNA基因96bp片段(23S rRNA全基因的第2020～2115位)以及rplD基因134bp片段(rplD全基因第120～253位)。应用Primer Premier 5和Primer Express 2.0软件对设计的引物进行评估，选择结合能力最强、二聚体形成几率最低的引物。此外，利用NCBI中的BLAST工具对设计的引物进行特异性评估，选择出对NCBI数据库中对所有空肠弯曲杆菌VS1基因、23S rDNA基因和rplD基因具有最高特异性的引物。设计好的引物委托南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成。三对引物的正向和反向序列见表1，三对引物在VS1、23S rDNA和rplD全基因中的结合碱基序列见图1A～C中下划线部分，所扩增片段见图中阴影部分。

在三对引物的基础上，运用Beacon Designer2.1设计4条Taqman-MGB探针。其中VS1-MGB探针用HEX荧光基团标记，用于特异性识别空肠弯曲杆菌的VS1基因；23S rRNA-MGB探针用TAMRA荧光基团标记，用于特异性鉴别那些在23S rRNA基因上不含突变的空肠弯曲杆菌，以区别空肠弯曲杆菌野生型23S rRNA和突变型23S rRNA(包括23S rRNA上2074和2075位的所有点突变类型)；两条rplD基因检测探针，包括170A-MGB和221A-MGB探针，用FAM荧光基团标记，用于鉴别空肠弯曲杆菌rplD基因上的G170A或G221A突变。同样，利用NCBI中的BLAST工具对设计的引物进行特异性评估，选择出对NCBI数据库中对所有空肠弯曲杆菌VS1基因、23S rDNA基因和rplD基因具有最高特异性的探针。四条引物的序列见表1。4条标记不同荧光基团的Taqman-MGB探针部由上海基康生物技术有限公司合成。四条探针的序列和标记的荧光基团见表1，四条探针在VS1、23S rDNA和rplD全基因中的结合碱基序列见图1A～C中波浪线部分。

表1用于空肠弯曲杆菌鉴定和耐药突变检测的引物和探针序列

实施例2、七种对照质粒的构建

1、构建野生型23S rDNA和rplD对照质粒

根据NCBI公布的空肠弯曲杆菌标准菌株(Campylobacter jejuni NCTC11168＝ATCC700819)全基因组(NC_002163.1)的23S rRNA序列(GI：3245050)和rplD基因序列(GI：905980)，利用Primer Premier 5和Primer Express 2.0软件设计两对引物，分别用于扩增空肠弯曲杆菌特有23S rRNA基因第1995～2141位的147bp片段以及rplD基因第120～389位的270bp片段，需要使扩增片段包含可能发生耐药突变的位点。设计好的引物委托南京金斯瑞生物技术有限公司进行合成。两对引物的正向和反向序列见表2，两对引物在23S rDNA和rplD全基因中的结合碱基序列见图1B和图1C中下圆点标记部分，所扩增片段见图中1B和图1C展示出的全长片段。

表2.用于构建野生型23S rDNA和rplD对照质粒的PCR引物序列

用表2中所列的两对引物，以煮沸法提取的空肠弯曲杆菌标准菌NCTC11168(ATCC700819)的细菌DNA为模板，分别扩增23S rRNA基因第1995～2141位的147bp片段以及rplD基因第120～389位的270bp片段。其反应体系为50μL，包括10×PCR buffer(含MgSO₄)5μL，dNTPs(2.5mM)2μL，Pfu酶(Fermentas)1μL，上下游引物(10μM)各1μL，模板DNA 1μL和超纯水39uL.反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环。PCR产物加6×loading buffer后全部加到1％的琼脂糖凝胶中，以100V电压电泳40min。使用上海捷瑞生物工程有限公司的GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，并按照试剂盒的操作流程进行胶回收。

由于pfu酶扩增出的产物为平末端，要想与pMD18-T载体(末端带有T碱基)连接，必须先在目的片段的末端加上A碱基。其操作过程是取胶回收的目的片段6.4μL，加入10×PCR buffer1μL，MgSO₄(25mM)0.6μL，dATP(10mM)1μL，Taq酶(TaKaRa)1μL，共10μL的反应体系，在PCR仪72℃反应20min即可。取所获得的加A反应液4μL，加入1μLpMD18-T载体、4μL连接液(solution I)和1μL超纯水，混匀后置4℃反应过夜。目的DNA片段与pMD 18-T载体连接后形成环状的质粒。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，从而构建野生型重组质粒。重组质粒用表2的引物进行PCR后，纯化的PCR产物送金斯瑞生物技术有限公司进行基因测序测序，确定其插入序列为野生型序列，不含有耐药相关位点突变。

野生型23S rRNA的扩增序列位于23S rRNA全基因第1995～2141位，扩增片段长147bp，具体的扩增片段序列如下，

1995-AGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCTACT

TGGAT-2141(其中下划线为引物23S-F和23S-R结合部位，方框中为23S rRNA全基因第2074和2075位碱基)

野生型rplD的PCR扩增序列位于rplD全基因第120～389位，扩增片段长270bp，具体的扩增片段序列如下：

120-GTAGAAGTGATGTAAGTGTGGTGGTAAAAAACCTTGGAGACAAAAAGGTCGTGGCGGTGCTAGAGCGGTTCAACAAGAACTAACGTTTGGGTAGGCGGTGCGGTTGCTTTTGGTCCAACAAATGAAAGAAACTACTTCCAAAAAGTAAATAAAAAACAAAAAAGATTGGCGCTTGAAAGAGCTTTAGCAGATAAAGCAGCTAAAGGTGT -389(其中下划线为引物rplD-F和rplD-R的结合部位，方框中为rplD基因全序列的第170和221位碱基)。

2、构建突变型23S rDNA和rpID对照质粒

根据空肠弯曲杆菌标准菌株(Campylobacterjejuni NCTC11168＝ATCC700819)全基因组(NC_002163.1)23S rDNA基因(GI：3245050)的序列，设计针对23S rDNA全基因上2074位A/C、2074位A/G、2074位A/T和2075位A/G这四种常见的位点突变类型的四对定点诱变引物，引物以23S rDNA第2074和2075位为中心，左右延长12个匹配碱基。根据空肠弯曲杆菌标准菌株(Campylobacter jejuniNCTC11168＝ATCC700819)全基因组(NC_002163.1)的rplD基因序列(GI：905980)，设计针对rplD基因上G170A和G221A这两种突变类型的两对定点诱变引物。G170A定点突变引物G170A-F和G170A-R是以rplD基因第170位碱基为中心，左右延长12个匹配碱基；G221A定点突变引物G221A-F和G221A-R是以rplD基因第221位碱基为中心，左右延长12个匹配碱基。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。定点诱变引物如表3：

表3.定点诱变引物

以构建好的两种野生型质粒为模板，用设计合成的6种定点诱变引物进行定点诱变PCR。诱变PCR采用温度梯度PCR。50μLPCR反应体系中包含10×PCR buffer(含MgSO₄)5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、Pfu酶(Fermentas)1μL、一对上下游引物(A2074C-F/R或A2074G-F/R或A2074T-F/R或A2075G-F/R或G170A-F/R或G221A-F/R)(10μM)各1μL、野生型模板质粒1μL和超纯水39μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58～70℃退火30s，72℃延伸5min。取诱变PCR反应液35μL，加入Dpn I酶(10U/μL)1μL和10×buffer 4μL，在37℃下用Dpn I酶消化2h。取20μL经Dpn I酶消化的PCR反应液，转化DH5α感受态细胞。通过AMP抗性平板筛选阳性克隆，送金斯瑞生物技术有限公司测序确证定点诱变成功。

通过这些过程，野生型23S rDNA对照质粒(命名为W-23SrDNA)被诱变成含有A2074C、A2074G、A2074T和A2075G位点突变的重组质粒(分别命名为M-A2074C、M-A2074G、M-A2074T和M-A2075G)，获得的突变型质粒的序列便是在野生型23S rDNA序列的2074和2075位相应的碱基突变。同时，野生型rplD对照质粒(命名为W-rplD)也被诱变成为含有G170A和G221A位点突变的重组质粒(分别命名为M-G170A和M-G221A)，获得的突变型质粒的序列便是在野生型rplD序列的170和221位相应的碱基突变。

实施例3：多重实时荧光PCR反应体系和反应条件的优化

在多重实时荧光PCR反应体系中引物、探针、Mg²⁺浓度、Taq酶等的浓度是影响荧光PCR扩增效果的关键参数。本发明将已设计合成的3对引物和4条探针放在同一反应体系中进行多重实时荧光PCR，优化反应体系中各组分的浓度：引物浓度由0.2～0.6uM以0.05μM递增，探针浓度由0.1μM～0.45μM以0.05μM递增，dNTP浓度由0.075mM～0.25mM以0.025mM递增，Mg2+浓度由0.75mM～2.5mM以0.25mM递增，Taq酶用量由1U～5U以0.5U递增。每次试验只设一个变量并采用等量模板，每次试验应用设定的多重实时荧光PCR反应体系，来扩增空肠弯曲杆菌NCTC11168，观察荧光PCR反应的Ct值、荧光信号值和平台期等指标，每个变量或每个成分的浓度的筛选部进行3次重复实验，若结果稳定，则确定为最佳浓度。最终确定的最优反应体系为Taq酶为2.5U，MgSO₄1.5mM，dNTPs100μM，6条引物各0.2μM，VS1-MGB探针和23SrRNA-MGB探针各为0.4μM，170A-MGB探针和221A-MGB探针各为0.2μM。最优反应体系见表4。

表4最优的多重实时荧光PCR反应体系

同理，在多重PCR反应条件中，退火温度是影响反应效果的关键参数，本试验因此设置了(50℃、52.1℃、56.4℃、58.3℃、60℃)5个退火温度。根据引物与探针的退火温度，以优化好的反应体系摸索PCR最佳反应条件，在“95℃ 1～10min，95℃ 10～30s，50℃～60℃ 30～60s，30～40个循环”的范围内反复进行试验，每次试验采用等量模板，每个反应条件重复试验3次，以Ct值、荧光增量、平台期和耗时等指标为考察依据，确定最佳反应条件。优化的最终反应条件为：95℃预变性3min、95℃变性10s、60℃退火40s，共30个循环。

实施例4：多重实时荧光PCR方法中VS1-MGB探针的特异性考察

选取空肠弯曲杆菌ATCC33560、结肠弯曲杆菌ATCC33559、金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌C84010、鼠伤寒沙门氏菌CVCC542、绿脓假单胞菌CVCC2087、粪肠球菌CVCC1297、屎肠球菌CVCC1298和产气荚膜梭菌CVCC1144共9种肠道常见细菌，对所建立的多重实时荧光PCR方法的特异性进行考察(来源渠道：空肠弯曲杆菌ATCC33560、结肠弯曲杆菌ATCC33559、金黄色葡萄球菌ATCC29213都购自美国典型培养物质保藏中心(American Type Culture Collection)；大肠杆菌C84010、鼠伤寒沙门氏菌CVCC542、绿脓假单胞菌CVCC2087、粪肠球菌CVCC1297、屎肠球菌CVCC1298、产气荚膜梭菌CVCC1144部是购自中国兽医药品监察所；空肠弯曲杆菌NCTC11168(等同于ATCC700819)也是购自美国典型培养物质保藏中心(American Type Culture Collection)。

具体方法：用上海捷瑞生物工程有限公司制备的细菌基因组DNA提取试剂盒提取以上9种细菌的基因组DNA(按试剂盒的说明书操作)，每种取1μLDNA作为模板，加入到多重实时荧光PCR反应体系中进行检测，以空肠弯曲杆菌ATCC33560的基因组DNA做阳性对照，以是否检测到VS1-MGB探针的荧光信号为判定标准。检测结果见图2。由图2可以看出，只有当模板为空肠弯曲杆菌时才能检测到VS1-MGB探针的荧光信号，而加入其它8种细菌作为模板时部不能检测到相应的荧光信号，表明本发明的方法中VS1-MGB探针的特异性良好，VS1-MGB探针仅与空肠弯曲杆菌的VS1基因片段特异性结合，可对空肠弯曲杆菌进行特异性鉴定。

实施例5：多重实时荧光PCR方法中23SrRNA-MGB探针的特异性考察

应用最优的多重荧光定量PCR方法，检测人工构建的野生型23S rDNA对照质粒(W-23SrDNA)和4个突变型23S rDNA对照质粒(A2074C、A2074G、A2074T、A2075G)，来考察本实施例中23Sr RNA-MGB探针的特异性。

其检测结果如图3，图中唯一的一个荧光信号为野生型23S rDNA对照质粒(W-23S rDNA)的检测结果。其他四种突变型23S rDNA对照质粒的荧光强度值接近0，检测结果判定为阴性。由于23SrRNA-MGB探针是与野生型基因序列完全互补配对的，因此当加入在2074或2075位点含有突变的质粒时，探针无法与之互补结合，也就无法检测到该探针的荧光信号，表明该条探针的突变识别能力良好。

实施例6：多重实时荧光PCR方法中两条rplD探针的特异性考察

应用最优的多重荧光定量PCR方法，检测人工构建的野生rplD对照质粒(W-rplD)和2个为突变型rplD对照质粒(M-G170A、M-G221A)，考察本方法中的两条rplD探针(170A-MGB探针和221A-MGB)的特异性。其检测结果见图4，170A-MGB探针可以特异性识别rplD基因上含有G170A位点突变的对照质粒(M-G170A)，并获得相应的荧光信号，表明该探针的突变识别能力良好；221A-MGB探针只对rplD基因上含有G221A位点突变的对照质粒(M-G221A)能够检测到相应的荧光信号，表明该探针的突变识别能力良好。

实施例7：多重实时荧光PCR方法的准确性考察

用上海捷瑞生物工程有限公司制备的细菌基因组DNA提取试剂盒，从实验室现有的空肠弯曲杆菌RM1121(Almofti et al.，2011)、空肠弯曲杆菌SE(Almofti et al.，2011)和空肠弯曲杆菌STY(Almofti et al.，2011)的细菌培养液中提取样本细菌DNA，考察本发明建立的多重荧光PCR方法的准确性和特异性。检测结果见图5。

当检测敏感型空肠弯曲杆菌RM1221时，由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；因为敏感菌中23S rRNA无位点突变，所以能够检测到与野生型互补的23S rRNA-MGB探针信号；由于敏感菌的rplD基因上没有突变，因此检测不到170A-MGB或221A-MGB探针的荧光信号(见图5A)。

当应用本发明的方法检测高水平大环内酯类耐药型空肠弯曲杆SE时，由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；因为该菌的23S rRNA上含有A2074C突变，探针23SrRNA-MGB无法与靶序列相结合，因此无法检测到23SrRNA-MGB探针荧光信号；由于该菌的rplD上没有突变，因此检测不到170A-MGB或221A-MGB探针的荧光信号(见图5B)。

当应用本发明方法检测低中水平大环内酯类耐药型空肠弯曲杆菌STY时，由于其是空肠弯曲杆菌，因此能够检测到VS1-MGB探针的荧光信号；由于不含23SrRNA基因突变，因此可以检测到23SrRNA-MGB探针荧光信号；因为该菌的rplD基因上含有G170A突变，因此可以检测到170A-MGB探针的荧光信号(见图5C)。

附录本发明涉及相关基因的原始信息

VS1基因：C.jejuni VS1 DNA，登录号GI296939，1189bp

链接地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/296939？report＝genbank

序列信息：

   1 aagcttgtga tacttttaag tgctatagaa agtgaaaatg aaatttcttt agcaggcata

  61 tatagagcgt attgttccaa atttgattta aagaatgaaa ttttagaatg gggtcttaaa

 121 atatttaaaa acaataatgc cttaaaagat cttgtagaaa aagaagatat atacaatcct

 181 attgttgtaa gtagtttggt ttctaagcta gaaaatttag aaaatttaga gcttttatat

 241 actttaactt ggctaaaggc taaggcttta aattataatg ctttttattt tagagttctt

 301 gataaacttt tagaaaatgc aaaacaaggt tttgaagatg aaaatctact tgaagaaagt

 361 gcaagaaggg taaaaaaaga attaacactt aaaagaagta agattttttt agagcaagat

 421 gaaattttgc aggataaaat catacatatc aaatcaaatc tttttattat aaaaaatact

 481 tttgaagata ttgttatgat ttctaaatta gccaaagaaa atgattttaa attttggttt

 541 agtaatgaaa caaatcttag tttgcaaatt gttgcaccac ttcattttaa tattgccatt

 601 attttaagtt ctttaacaaa tttaaatctt atttttatga atttttttga actttttgat

 661 gataaaattt atttaaggtt tgaatatgat aatattatca gtgatgagca aaaactaaaa

 721 ctttgtgagc ttttaaattc aaatctttct ggttttaatt tgaaaaaaat taaaaagcca

 781 atcattaaaa aagaggagtt aaaattagac ttaaactatt ctaaaatgta tgccaaatta

 841 ggtcttaata ctaaagatca gcaaggttta atggcgtatt tgatgaatgt ttttaatgaa

 901 cttgaacttg ttttatgtgc agcaaaaatt

 961 

1021 

1081 aattatacta aatggactta aagaattatg

1141 atgcaa gaaggcgaac ttagtttttt taaagctgta ggaaagctt

粗下划线表示：

正向引物VS1-RT-F：5’CAA ACC ATA AGA CAA AGG ACG C3’

反向引物VS1-RT-R：5’CAC TGC CAT ACC CGC ACT AT 3’；

阴影部分为VS1扩增序列，共214bp；

方框加波浪线中的序列为VS1-MGB探针杂交序列：

探针VS1-MGB：(HEX)-TAGCCACGATATTC-(MGB)。

23SrDNA基因：C.jejuni 23S ribosomal RNA基因登录号GI：3245050，共2881bp

链接地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_002163.1？report＝genbank&from＝41568&to＝44457

序列信息：

   1 agctactaag agcgaatggt ggatgccttg actggtaaag gcgatgaagg acgtactaga

  61 ctgcgataag ctacggggag ctgtcaagaa gctttgatcc gtagatttcc gaatggggca

 121 acccaatgta tagagatata cattacctat ataggagcga acgaggggaa ttgaaacatc

 181 ttagtaccct caggaaaaga aatcaataga gattgcgtca gtagcggcga gcgaaagcgc

 241 aagagggcaa acccagtgct tgcactgggg gttgtaggac tgcaatgtgc aagagctgag

 301 tttagcagaa cattctggaa agtatagcca tagagggtga tagtcccgta tgcgaaaaac

 361 aaagcttagc tagcagtatc ctgagtaggg cgggacacga ggaatcctgt ctgaatccgg

 421 gtcgaccacg atccaaccct aaatactaat accagatcga tagtgcacaa gtaccgtgag

 481 ggaaaggtga aaagaactga ggtgatcaga gtgaaataga acctgaaacc atttgcttac

 541 aatcattcag agcactatgt agcaatacag tgtgatggac tgccttttgc ataatgagcc

 601 tgcgagttgt ggtgtctggc aaggttaagc aaacgcgaag ccgtagcgaa agcgagtctg

 661 aatagggcgc ttagtcagat gctgcagacc cgaaacgaag tgatctatcc atgagcaagt

 721 tgaagctagt gtaagaacta gtggaggact gaacccatag gcgttgaaaa gccccgggat

 781 gacttgtgga taggggtgaa aggccaatca aacttcgtga tagctggttc tctccgaaat

 841 atatttaggt atagcgttgt gtcgtaatat aagggggtag agcactgaat gggctagggc

 901 atacaccaat gtaccaaacc ctatcaaact ccgaatacct tatatgtaat cacagcagtc

 961 aggcggcgag tgataaaatc cgtcgtcaag agggaaacaa cccagactac cagctaaggt

1021 ccctaaatct tacttaagtg gaaaacgatg tgaagttact taaacaacca ggaggttggc

1081 ttagaagcag ccatccttta aagaaagcgt aatagctcac tggtctagtg attttgcgcg

1141 gaaaatataa cggggctaaa gtaagtaccg aagctgtaga cttagtttac taagtggtag

1201 gagagcgttc tatttgcgtc gaaggtatac cggtaaggag tgctggagcg aatagaagtg

1261 agcatgcagg catgagtagc gataattaat gtgagaatca ttaacgccgt aaacccaagg

1321 tttcctacgc gatgctcgtc atcgtagggt tagtcgggtc ctaagtcgag tccgaaaggg

1381 gtagacgatg gcaaattggt taatattcca ataccaacat tagtgtgcga tggaaggacg

1441 cttagggcta agggggctag cggatggaag tgctagtcta aggtcgtagg aggttataca

1501 ggcaaatccg tataacaata ctccgagaac tgaaaggctt tttgaagtct tcggatggat

1561 agaagaaccc ctgatgccgt cgagccaaga aaagtttcta agtttagcta atgttgcccg

1621 taccgtaaac cgacacaggt gggtgggatg agtattctaa ggcgcgtgga agaactctct

1681 ttaaggaact ctgcaaaata gcaccgtatc ttcggtataa ggtgtggtta gctttgtatt

1741 aggatttact ctgaaagcaa ggaaacttac aacaaagagt ccctcccgac tgtttaccaa

1801 aaacacagca ctctgctaac tcgtaagagg atgtataggg tgtgacgcct gcccggtgct

1861 cgaaggttaa ttgatggggt tagcattagc gaagctcttg atcgaagccc gagtaaacgg

1921 cggccgtaac tataacggtc ctaaggtagc gaaattcctt gtcggttaaa taccgacctg

1981 catgaatggc gtaa【agg

2041 tgaaaat tcctcctacc cgcggcaccgtgg

2101 ggat】aggctttga gtatatgacg

2161 ccagttgtat atgagccatt gttgagatac cactctttct tatttgggta gctaaccagc

2221 ttgagttatc ctcaagtggg acaatgtctg gtgggtagtt tgactggggc ggtcgcctcc

2281 caaataataa cggaggctta caaaggttgg ctcagaacgg ttggaaatcg ttcgtagagt

2341 ataaaggtat aagccagctt aactgcaaga catacaagtc aagcagagac gaaagtcggt

2401 cttagtgatc cggtggttct gtgtggaagg gccatcgctc aaaggataaa aggtaccccg

2461 gggataacag gctgatctcc cccaagagct cacatcgacg gggaggtttg gcacctcgat

2521 gtcggctcat cgcatcctgg ggctggagca ggtcccaagg gtatggctgt tcgccattta

2581 aagcggtacg cgagctgggt tcagaacgtc gtgagacagt tcggtcccta tctgccgtgg

2641 gcgtaagaag attgaagaga tttgacccta gtacgagagg accgggttga acaaaccact

2701 ggtgtagctg ttgttctgcc aagagcatcg cagcgtagct aagtttggaa aggataaacg

2761 ctgaaagcat ctaagcgtga agccaactct aagatgaatc ttctctaagc tctctagaag

2821 actactagtt tgataggctg ggtgtgtaat ggatgaaagt cctttagctg accagtacta

2881 atagagcgtt

粗下划线表示：

正向引物23S-RT-F：5’GAT CCA GTG AAA TTG TAG TGG AGG T3’

反向引物23S-RT-R：5’AAG TAG CAG TGT CAA GCT GTA GTA AAG G3’；

阴影部分为23S rRNA扩增序列，共96bp；

方框加波浪线的序列为23Sr RNA-MGB探针序列：

探针23Sr RNA-MGB：(TAMRA)-AGACGGAAAGACC-(MGB)；

方框+波浪线+加粗的位置为23S rRNA的2074和2075位突变位点；

在构建野生型和突变型rplD质粒过程中，【】大括号内为构建野生型23S rDNA质粒的序列(147bp)：CGAGATGGGAGCTCTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG    147bp

其中双下划线为23S-F和23S-R的引物序列：

正向引物23S-F：CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAG

反向引物23S-R：CCCACCTATCCTGCACATTCTT。

rplD基因：登录号：905980

链接地址：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_002163.1？report＝genbank&from＝1619193&to＝1619807&strand＝true

序列信息：

  1 atgagtaaag tagttgtttt aaatgataaa ttagaaaaag caggtgaact tgatttacct

 61 tcaaaatatg cggaagtaaa tccacacaat ctttacttgt atgtaaaatc ttaccttgc【

121 gtagaagtg atggtaaa

181 aaaccttgga gacaaaaagg tcgtggcggt gcgaac

241 cggttgc ttttggtcca acaaatgaaa gaaactactt ccaaaaagta

301 aataaaaaac aaaaaagatt ggcgcttgaa agagctttag cagataaagc agctaaaggt

361 gtt gaaagtggta aaacaaaaga tgcaaacgct

421 gtgattaaaa aacttggcgt caaagatgct ttaatcgtta aagatttact agatgaaaaa

481 acacttttag cttacagaaa tttagcaaat tgctatgtag ttgatgtaac tgaagtaaat

541 gcttatttagtatctgtatt taatgctgtt attatggaaa aatcagtgtt agaatctatt

601 acaaaagagg gataa

在多重荧光定量PCR反应中，阴影部分为扩增的134bp的rplD片段：

aagtttaag agcaaataca gctcatacta aaggtagaag tgatgtaagt gtggtggta aaaaaccttg gagacaaaaaggtcgtggcg gtgctagagc ggttcaaca agaactaacg tttgggtagg cggtg    134bp

其中下划线表示rplD-RT-F和rplD-RT-R引物序列：

正向引物rplD-RT-F：5’AAG TTT AAG AGC AAA TAC AGC TCA TAC TAA AG 3’

反向引物rplD-RT-R：5’-CAC CGC CTA CCC AAA CGT TA-3’；

方框加波浪线表示170A-MGB和221A-MGB探针序列：

探针170A-MGB：(FAM)-ACCACCATCACTTAC-(MGB)，

探针221A-MGB：(FAM)-TTGTTGAATCCGCTCTA-(MGB)；

方框中黑体部分为170位和221位碱基。

在构建野生型和突变型rplD质粒过程中，大括号内【】为构建野生型rplD质粒的序列(270bp)：

aagttTAAGAGCAAATACAGCTCATACTAAAGGTAGAAGTGATGTAAGTGTGGTGGTAAAAAACCTTGGAGACAAAAAGGTCGTGGCGGTGCTAGAGCGGTTCAACAAGAACTAACGTTTGGGTAGGCGGTGCGGTTGCTTTGGTCCAACAAATGAAAGAAACTACTTCCAAAAAGTAAATAAAAAACAAAAAAGATTGGCGCTTGAAAGAGCTTTAGCAGATAAAGCAGCTAAAGGTGTGTTATTTACTGCTGATTCTTTGGCTAT    270bp

其中双下划线为rplD-F和rplD-R引物序列：

正向引物rplD-F：5’AAG TTT AAG AGC AAA TAC AGC TCA TAC TAA AG 3’

反向引物rplD-R：5’ATAGCCAAAGAATCAGCAGTAAATAAC 3’。

主要参考文献

1.Almofti，Y.A.，Dai，M.，Sun，Y.，Hao，H.，Liu，Z.，Cheng，G.，Yuan，Z.，2011，The physiologic and phenotypicalterations due to macrolide exposure in Campylobacter jejuni.Int J Food Microbiol 151，52-61.

2.Alonso，R.，Mateo，E.，Churruca，E.，Martinez，I.，Girbau，C.，Fernandez-Astorga，A.，2005，MAMA-PCR assayfor the detection of point mutations associated with high-level erythromycin resistance in Campylobacter jejuniand Campylobacter coli strains.J Microbiol Methods 63，99-103.

3.Hao，H.，Dai，M.，Wang，Y.，Chen，D.，Yuan，Z.，2010，Quantification of mutated alleles of 23S rRNA inmacrolide-resistant Campylobacter by TaqMan real-time polymerase chain reaction.Foodborne Pathog Dis 7，43-49.

4.Moore，J.E.，Barton，M.D.，Blair，I.S.，Corcoran，D.，Dooley，J.S.，Fanning，S.，Kempf，I.，Lastovica，A.J.，Lowery，C.J.，Matsuda，M.，McDowell，D.A.，McMahon，A.，Millar，B.C.，Rao，J.R.，Roone y，P.J.，Seal，B.S.，Snelling，W.J.，Tolba，O.，2006，The epidemiology of antibiotic resistance in Campylobacter.Microbes Infect 8，1955-1966.

4.Niwa，H.，Chuma，T.，Okamoto，K.，Itoh，K.，2001，Rapid detection of mutations associated with resistance toerythromycin in Campylobacter jejuni/coli by PCR and line probe assay.Int J Antimicrob Agents 18，359-364.Payot，S.，Bolla，J.M.，Corcoran，D.，Fanning，S.，Megraud，F.，Zhang，Q.，2006，Mechanisms of fluoroquinoloneand macrolide resistance in Campylobacter spp.Microbes Infect8，1967-1971.

5.Ren，G.W.，Wang，Y.，Shen，Z.，Chen，X.，Shen，J.，Wu，C.，2011，Rapid detection of point mutations in domain Vof the 23S rRNA gene in erythromycin-resistant Campylobacter isolates by pyrosequencing.Foodborne PathogDis 8，375-379.

6.Vacher，S.，Menard，A.，Bernard，E.，Megraud，F.，2003，PCR-restriction fragment length polymorphism analysisfor detection of point mutations associated with macrolide resistance in Campylobacter spp.Antimicrob AgentsChemother 47，1125-1128.

7.Vacher，S.，Menard，A.，Bernard，E.，Santos，A.，Megraud，F.，2005，Detection of mutations associated withmacrolide resistanee in thermophilic Campylobacter spp.by real-time PCR.Microb Drug Resist 11，40-47.Yang，C.，Jiang，Y.，Huang，K.，Zhu，C.，Yin，Y.，Gong，J.H.，Yu，H.，2004，A real-time PCR assay for the detectionand quantitation of Campylobacter jejuni using SYBR Green I and the LightCycler.Yale J Biol Med 77，125-132.

Claims (1)

1.一种用于检测空肠弯曲杆菌及其大环内酯类耐药位点突变的多重荧光定量PCR的引物和探针组合，其特征在于，其包含：

① VS1引物对和荧光探针组合

正向引物VS1-RT-F，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：8所示；

反向引物VS1-RT-R，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：9所示；

VS1-MGB荧光探针，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：10所示；

利用引物对VS1-RT-F和VS1-RT-R扩增得到214bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，该片段位于空肠弯曲杆菌特异性鉴别基因VS1全序列的931～1144位；VS1-MGB荧光探针的5’端以HEX荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团标记，并连接小型凹槽结合物MGB基团，以提高探针的退火温度；利用引物对VS1-RT-F和VS1-RT-R及探针VS1-MGB组合对空肠弯曲杆菌进行特异性种属鉴别；

② 23S rRNA引物对和荧光探针组合

正向引物23S-RT-F，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物23S-RT-R，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示；

23Sr RNA-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；

利用引物对23S-RT-F和23S-RT-R扩增得到96bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；该片段位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因23S rRNA基因全序列的第2020～2115位；23Sr RNA-MGB荧光探针的5’端以TAMRA荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团和MGB基团标记，该探针与野生型23S rRNA基因全序列的第2068～2080位序列结合，从而检测23S rRNA基因全序列第2074和2075位是否发生突变；

③ rplD的引物对和荧光探针组合

正向引物rplD-RT-F，其DNA序列如SEQ ID NO：4所示；

反向引物rplD-RT-R，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示；

170A-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：6所示；

221A-MGB荧光探针，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示；

利用引物对rplD-RT-F和rplD-RT-R扩增得到134bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，该片段位于空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药靶基因rplD全序列的第120～253位；170A-MGB和221A-MGB探针5’端以FAM荧光基团标记，3’端以非荧光淬灭基团和MGB基团标记，利用这两条探针分别对rplD基因全序列第170位和221位的基因突变进行检测。