(三)发明内容
本发明目的是提供一种艰难梭菌四种相关毒素基因的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案是:
一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒,主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂,所述特异性引物和探针由艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)的特异性引物和探针组成,所述特异性引物和探针序列如下:
tcdA上游引物:5′-TCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAA-3′;
tcdA下游引物:5′-CAGAGTGAATACCTGGAAGCATATCA-3′;
tcdA荧光探针:5′-FAM-CTGCAGCATCTGACATAG-BHQ1-3′;
tcdB上游引物:5′-GATAATATTTACGGACAAGCAGTTGACT-3′;
tcdB下游引物:5′-AGTCTCAATTGTATAGGTTTCTCCAAAA-3′;
tcdB荧光探针:5′-VIC-AGCGGTTTAGTTAGAGTTG-BHQ1-3′;
cdtA上游引物:5′-TGGGAAGCACTATATTAAAGCAGA-3′;
cdtA下游引物:5′-ACATCAGCAAGTTCATTAGGTGTT-3′;
cdtA荧光探针:
5′-ROX-TTTGCTTTACCCCAAGARTCCCCCT-BHQ2-3′;
cdtB上游引物:5′-ATTTCTTTGACCCAAAGTTGATG-3′;
cdtB下游引物:5′-CCCACTTAACTGCAATTAAGTCC-3′;
cdtB荧光探针:
5′-CY5-TGATTGGGAAGACGAAGATTTGGAT-BHQ2-3′;
其中FAM、VIC、ROX和CY5为不同波长的荧光报告基团,BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。
本发明的关键在于扩增引物的设计,试剂盒中其他组成,可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等,其中PCR缓冲液可采用市购商品,也可自行配制,例如将Tris-HCl、KCl、MgCl2等按比例混合进行配制,进行检测时,将PCR反应试剂和扩增引物和探针混合,再加入待测样品或对照品,即可进行PCR扩增反应。
为达到定量检测的要求,所述试剂盒中还可包括艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)的标准品,所述标准品序列如下:
tcdA标准品:
tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttg
gcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg;
tcdB标准品:
gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaa
acctatacaattgagact;
cdtA标准品:
tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaagggg
gattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt;
cdtB标准品:
atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagat
tcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。
可将上述序列构建到质粒载体中,以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测,根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线,测得样品DNA的Ct值后,对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。
本发明还涉及利用所述试剂盒检测艰难梭菌毒素基因的方法,所述方法包括:
(1)提取待测样品DNA;
(2)以待测样品DNA为模板,加入艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)的特异性引物和探针,PCR缓冲液,脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液,进行PCR扩增,以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增;
(3)PCR扩增产物进行荧光检测,以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线,若待测样品荧光增长曲线超过阈值线,并呈良好的对数增长,则判断为阳性。
定量检测时,所述方法同时以艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测,分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线,测得样品DNA的Ct值后,对照相应标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度;所述标准品序列如下:
tcdA标准品:
tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttg
gcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg;
tcdB标准品:
gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaa
acctatacaattgagact;
cdtA标准品:
tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaagggg
gattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt;
cdtB标准品:
atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagat
tcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。
优选的,所述PCR反应条件为:95℃预变性5分钟,95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增,最后置4℃,荧光采集在每个循环的退火温度时进行。
本发明的有益效果主要体现在:本发明针对艰难梭菌毒素基因提供了一种快速、敏感、特异的多重荧光PCR检测试剂盒和检测方法,为区分艰难梭菌产毒株与无毒株、及其艰难梭菌感染的早期诊断提供了基础。
实施例1:标准品的获得
1、材料:
pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司,377型测序仪(ABI公司)、Bio-Rad icycler PCR仪(Bio-Rad公司)、ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)。
2、引物及探针设计与合成:
以艰难梭菌tcdA(GenBank注册号为JQ809336.1)、tcdB(GenBank注册号为JQ809336.1)、cdtA(GenBank注册号为HQ639678.1)和cdtB(GenBank注册号为HQ639678.1)基因为模板,使用Primer Express TM(V3.0,美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点,从中选择最佳组合。由上海辉睿生物科技有限公司进行引物和探针的合成与纯化。
3、阳性参考品的制备:
以艰难梭菌标准株(ATCC43598)以及二元毒素A(cdtA)(GenBank注册号为HQ639678.1)、二元毒素B(cdtB)(GenBank注册号为HQ639678.1)合成寡核苷酸序列做为模板,用DNA提取试剂提取基因组DNA,用分光光度计测定浓度,取1.0μL(50ng/μL)做PCR反应模板,分别上述的上下游引物在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增:
PCR反应液组成如下:
PCR条件为:94℃5分钟变性,94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增,最后于72℃延伸5分钟后置4℃。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体,并将阳性克隆经测序验证。艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)基因对应的片段长度分别为1119bp、92bp、141bp和126bp片段,即为标准品,测定浓度并换算成质量/体积。
4、结果:
经测序,上述设计标准品完全与预期相符,回收的标准品片段序列如下:
tcdA基因标准品序列:
tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttggcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg。
tcdB基因标准品序列:
gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaaacctatacaattgagact。
cdtA基因标准品序列:
tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaagggggattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt。
cdtB基因标准品序列:
atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagattcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。
实施例2:多重荧光定量PCR法检测艰难梭菌四种相关毒素基因方法的建立
1、质粒DNA及其他细菌DNA提取:
采用基因组DNA提取试剂提取细菌基因组DNA,采用质粒DNA提取试剂盒提取阳性质粒DNA,分别取1.0μL(50ng/μL)做模板,用检测用上下游引物在ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)上进行PCR扩增。
PCR反应液组成如下:
PCR反应条件为:95℃预变性5分钟,95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增,最后置4℃,荧光采集在每个循环的退火温度时进行。
以非靶细菌志贺菌(ATCC04121)为阴性对照于相同条件下进行PCR检测,以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线;若待测模板荧光增长曲线超过阈值线,并呈良好的对数增长,则判断为阳性。
同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测,并绘制标准曲线。
待测DNA的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测艰难梭菌毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)、二元毒素A(cdtA)和二元毒素B(cdtB)基因的数量。
以肠出沙门氏菌(CICC21490)、血性大肠杆菌(ATCC43889),致病性大肠杆菌(ATCC43887),肠产毒性大肠杆菌(ATCC35401),肠侵袭性大肠杆菌(ATCC43893),创伤弧菌(CICC10383)按照上述方法进行检测,结果均为阴性,说明本发明方法特异性好。
2、检测结果
标准品检测结果参见图1(A、B、C、D),标准品浓度分别为1:30ng/μL、2:3ng/μL、3:0.3ng/μL、4:30pg/μL、5:3pg/μL标准品,标准曲线参见图2。
图2为四种毒素基因对应的标准方程,其中图中标注与四种基因荧光探针标记类型对应,其中tcdA基因标准方程(FAM)(图2-A):Y=-3.3094×lgX+39.879,R2=0.9998;tcdB基因标准方程(VIC)(图2-B):Y=-3.3624×lgX+37.2423,R2=0.9991;cdtA基因标准方程(ROX)(图2-C):Y=-3.2434×lgX+40.6222,R2=0.9976;cdtB基因标准方程(CY5))(图2-D):Y=-3.1730×lgX+39.4229,R2=0.9971。Y:对应的Ct值;X:基因的质量数。
阳性菌株与合成模版的检测结果见图3。其中1为tcdA基因,Ct值为23.98,基因浓度为63.10ng/μL;2为tcdB基因,Ct值为25.56,基因浓度为2.978ng/μL;3为cdtA基因,Ct值为26.35,基因浓度为25.12ng/μL;4为cdtB基因,Ct值为28.92,基因浓度为2.041ng/μL。