CN103993089B - 一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、VanA基因标准品序列、VanB基因标准品序列。本发明的有益效果为：由于采用了PCR检测方法，能够做到准确、快速、定量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR试剂盒及其检测方法。
背景技术
耐万古霉素肠球菌(VancomycinResistantEnterococcus)是在1986年法国首次分离获得。从此之后，其他欧洲国家和美国相继检测并分离株耐万古霉素肠球菌菌株，目前已经成为重要的医院内感染病原菌。由于用药选择的严重受限，耐万古霉素肠球菌经常伴有较高的致病率和死亡率。因此耐万古霉素肠球菌目前已经成为临床院内感染的重要监控对象，一旦耐万古霉素肠球菌暴发传播，将会给抗感染治疗带来巨大的困难。
在过去二十年中耐万古霉素肠球菌出现了发病率、严重程度和复发率上升的趋势，所有这些都与预后不佳有关，并已成为欧美排名第1的“超级臭虫”。现在美国已将耐万古霉素肠球菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、艰难梭菌并列于美国三大医院获得性感染之列。根据国外经验，为控制耐万古霉素肠球菌的广泛传播，最重要的是发展更为敏感和快速的检测方法，以及时发现，及早诊治。因此，实验室开发一种快速、特异、灵敏的耐万古霉素肠球菌基因检测方法意义重大。
随着分子生物学技术的飞速发展。人们已经将实时荧光技术(real-timefluorescencepolymerasechainreaction)PCR，广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-timefluorescencepolymerasechainreaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量，是近几年发展起来的新型检测技术，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域。
发明内容
针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种快速、准确、可定量的检验方法，能够及早发现耐万古霉素肠球菌，并且及时治疗。
为实现上述目的，本发明提供一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、VanA基因、VanB基因、VanA基因标准品序列、VanB基因标准品序列。研究表明耐万古霉素肠球菌主要是由位于肠球菌基因组或质粒上的抗性基因引起，根据抗性基因差异分为VanA型、VanB型、VanC型、VanD型四种，其中只有VanA型、VanB型具有临床检测的意义，故耐万古霉素肠球菌基因选取VanA和VanB。
所述VanA特异性引物如下：VanA上游引物：5′-ttgacttcgttcagtac-3′
VanA下游引物：5′-ggagcgaggacggatacagga-3′
所述VanA荧光探针如下：5′-FAM-ctagacctctacagccga-BHQ1-3′
所述VanB特异性引物如下：VanB上游引物：5′-ggatcaaatccggttgagc-3′
VanB下游引物：5′-tgtctgctggaacgataatca-3′
所述VanB荧光探针如下：5′-VIC-ccgcatccatcaggaa-BHQ1-3′。
所述VanA基因标准品序列如下：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccacacgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgtttcctgtatccgtcctcgctcc；
所述VanB基因扩标准品序列如下：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaaacgagccggaaaaaggctcagagaatgcgatgattatcgttccagcagaca。
所述脱氧三磷酸核苷混合物为ATP、TTP、CTP、GTP等比例混合。
进一步的，所述VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针由上海辉睿生物科技有限公司进行合成与纯化，以耐万古霉素肠球菌VanA(GenBank注册号为JN207930.1)、VanB(GenBank注册号为U00456.1)基因为模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。
进一步的，10×PCR缓冲液购自美国Promega公司。
进一步的，所述DNA聚合酶购自美国Promega公司的TaqDNA聚合酶。
使用如上所述的试剂盒定量PCR检测耐万古霉素肠球菌的方法，所述检测方法包括如下步骤：
1)VanA基因标准品和VanB基因标准品的制备：
1101：以耐万古霉素肠球菌标准株(ATCC29212)做为模板，用DNA提取试剂提取耐万古霉素肠球菌基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μL(50ng/μL)的耐万古霉素肠球菌基因组DNA做PCR反应模板，VanA和VanB的上下游引物在Bio-RadicyclerPCR仪上进行PCR扩增反应，所用的PCR反应液组成如下：
水补足至20μL；
PCR扩增反应条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃；
1102：将PCR产物经质量百分数1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；
1103：用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并经测序仪进行测序验证，耐万古霉素肠球菌VanA和VanB基因对应的片段长度分别为119bp和98bp片段，即为所需要的VanA基因标准品和VanB基因标准品，测定浓度并换算成质量/体积；
检测结果如下，完全与预期相符：
VanA基因标准品序列：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccacacgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgtttcctgtatccgtcctcgctcc；
VanB基因标准品序列：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaaacgagccggaaaaaggctcagagaatgcgatgattatcgttccagcagaca。
2)VanA基因标准品和VanB基因标准品的PCR扩增反应，取1.0μL(50ng/μL)做模板，用上下游引物在ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)上进行PCR扩增：
其中，PCR反应液组成如下：
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)
基因标准品DNA(VanA和VanB各50ng/μL)4μL
水补足至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时进行；
3)绘制标准曲线
按照步骤2)将不同浓度5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL的VanA基因标准品和VanB基因标准品依次进行检测，并绘制标准曲线；
4)用基因组DNA提取试剂提取待检测细菌基因组DNA，将基因标准品DNA替换成待检测细菌基因组DNA，按照步骤2)进行测试，所述待检测细菌可以为以非靶细菌如：大肠杆菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、产气荚膜梭菌、沙门菌等；非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测模板荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
5)将步骤4)测定结果与标准扩增曲线对比，得出检测结果。
进一步的，步骤1103所述测序仪为ABI公司生产的377型测序仪。
进一步的，步骤1103所述克隆系统和pGEM-T-Easy克隆载体购自美国Promega公司。
本发明的有益效果为：由于采用了PCR检测方法，能够做到准确、快速、定量的检测。
附图说明
图1-A为VanA基因标准品检测结果；
图1-B为VanB基因标准品检测结果；
图2-A为VanA基因标准品的标准扩增曲线；
图2-B为VanB基因标准品的标准扩增曲线；
图3为耐万古霉素肠球菌基因的检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步解释。
实施例1：
本发明实施例所述的一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、VanA基因、VanB基因、VanA基因标准品、VanB基因标准品。
所述VanA特异性引物如下：VanA上游引物：5′-ttgacttcgttcagtac-3′
VanA下游引物：5′-ggagcgaggacggatacagga-3′
所述VanA荧光探针如下：5′-FAM-ctagacctctacagccga-BHQ1-3′
所述VanB特异性引物如下：VanB上游引物：5′-ggatcaaatccggttgagc-3′
VanB下游引物：5′-tgtctgctggaacgataatca-3′
所述VanB荧光探针如下：5′-VIC-ccgcatccatcaggaa-BHQ1-3′。
所述VanA基因标准品序列如下：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccacacgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgtttcctgtatccgtcctcgctcc；
所述VanB基因标准品序列如下：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaaacgagccggaaaaaggctcagagaatgcgatgattatcgttccagcagaca。
实施例2：VanA和VanB基因标准品的获得
1)、材料：
pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司，377型测序仪(ABI公司)、Bio-RadicyclerPCR仪(Bio-Rad公司)、ABI7500fast定量PCR仪(ABI公司)。
2)、特异性引物及探针设计与合成：
以耐万古霉素肠球菌VanA(GenBank注册号为JN207930.1)、VanB(GenBank注册号为U00456.1)基因为模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美国ABI公司)软件分析TaqManTaqMan特异性引物和探针位点，从中选择最佳组合。由上海辉睿生物科技有限公司进行引物和探针的合成与纯化。
3)、VanA和VanB基因标准品的制备：
以肠球菌标准株(ATCC29212)做为模板，用DNA提取试剂提取耐万古霉素肠球菌基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μL(50ng/μL)做PCR反应模板，分别用上述的上下游引物在Bio-RadicyclerPCR仪上进行PCR扩增：
PCR反应液组成如下：
水补足至20μL。
PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并经测序验证。耐万古霉素肠球菌VanA和VanB基因对应的片段长度分别为119bp和98bp片段，即为VanA和VanB基因标准品，测定浓度并换算成质量/体积。
4)、结果：
经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下：
VanA基因标准品序列：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccacacgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgtttcctgtatccgtcctcgctcc。所述VanB基因标准品序列：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaaacgagccggaaaaaggctcagagaagcgatgattatcgttccagcagaca。
实施例3：使用试剂盒多重荧光定量PCR法检测耐万古霉素肠球菌基因的方法
所述检测方法包括如下步骤：
1)VanA基因标准品和VanB基因标准品的PCR扩增反应：
其中，PCR反应液组成如下：
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)
基因标准品DNA(VanA和VanB各50ng/μL)4μL
水补足至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时进行；
2)绘制标准曲线
按照步骤1)将不同浓度5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL的VanA基因标准品和VanB基因标准品依次进行检测，标准品检测结果参见图1-A、图1-B，标准品浓度分别为1∶50ng/μL、2∶5ng/μL、3∶0.5ng/μL、4∶50pg/μL、5∶5pg/μL标准品，并绘制标准曲线，标准曲线参见图2，图2为两种基因对应的标准方程，其中图中标注与四种基因荧光探针标记类型对应，其中VanA基因标准方程(FAM)(图2-A)：Y＝-3.383×1gX+39.789，R2＝0.9998；VanB基因标准方程(VIC)(图2-B)：Y＝-3.327×1gX+41.023，R2＝0.9976；Y：对应的Ct值；X：基因的质量数。
3)用基因组DNA提取试剂提取待检测细菌基因组DNA，将基因标准品DNA替换成待检测细菌基因组DNA，按照步骤2)进行测试；
4)将步骤3)测定结果与标准曲线对比，得出检测结果。
进一步的，所述测序仪为ABI公司生产的377型测序仪。
进一步的，所述克隆系统和pGEM-T-Easy克隆载体购自美国Promega公司。
耐万古霉素肠球菌基因的检测结果见图3，1为VanA基因，Ct值为23.86，基因浓度为64.10ng/μL；2为VanA基因，Ct值为24.43，基因浓度为2.873ng/μL；3为VanB基因，Ct值为25.34，基因浓度为26.43ng/μL；4为VanB基因，Ct值为29.01，基因浓度为1.993ng/μL。
本发明的原理：根据目前引起耐万古霉素肠球菌的主要因素VanA、VanB两种抗性基因特异的核苷酸序列设计两对特异性引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增的方法，利用探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达到设定的阈值线时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，Ct值0或大于37：阴性，Ct值小于36：阳性。
惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例而已，举凡熟悉此项技艺的专业人士。在了解本发明的技术手段之后，自然能依据实际的需要，在本发明的教导下加以变化。因此凡依本发明申请专利范围所作的同等变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。
耐万古霉素肠球菌扩增用基因序列、引物、探针
本发明扩增的VanA基因标准品序列、引物、探针如下所示：
VanA基因标准品序列：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccac
acgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgttt
cctgtatccgtcctcgctcc
VanA特异性引物：VanA上游引物：5′-ttgacttcgttcagtac-3′
VanA下游引物：5′-ggagcgaggacggatacagga-3′
VanA荧光探针：5′-FAM-ctagacctctacagccga-BHQ1-3′
本发明扩增的VanB基因标准品序列、引物、探针如下所示：
VanB基因标准品序列：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaa
acgagccggaaaaaggctcagagaatgcgatgattatcgt
tccagcagaca
VanB特异性引物：VanB上游引物：5′-ggatcaaatccggttgagc-3′
VanB下游引物：5′-tgtctgctggaacgataatca-3′
VanB荧光探针：5′-VIC-ccgcatccatcaggaa-BHQ1-3′。
Claims (2)
1.一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、VanA基因标准品序列、VanB基因标准品序列；
其中所述VanA基因标准品序列如下：ttgacttcgttcagtacaatgcggccgttatcttgtaaaaacatatccacacgggctagacctctacagccgagcgctttatatattttttttgccgtttcctgtatccgtcctcgctcc；
所述VanB基因标准品序列如下：ggatcaaatccggttgagccacggtatcttccgcatccatcaggaaaacgagccggaaaaaggctcagagaatgcgatgattatcgttccagcagaca；
所述VanA特异性引物序列为：
VanA上游引物:5′-ttgacttcgttcagtac-3′
VanA下游引物:5′-ggagcgaggacggatacagga-3′；
所述VanB特异性引物序列为：
VanB上游引物:5′-ggatcaaatccggttgagc-3′
VanB下游引物:5′-tgtctgctggaacgataatca-3′；
所述VanA荧光探针:5′-FAM-ctagacctctacagccga-BHQ1-3′；
所述VanB荧光探针:5′-VIC-ccgcatccatcaggaa-BHQ1-3′；
所述脱氧三磷酸核苷混合物为ATP、TTP、CTP、GTP等比例混合。
2.如权利要求1所述试剂盒的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
1)VanA基因标准品和VanB基因标准品的制备：
1101：以耐万古霉素肠球菌标准株做为模板，用DNA提取试剂提取耐万古霉素肠球菌基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μL、50ng/μL的耐万古霉素肠球菌基因组DNA做PCR反应模板，VanA和VanB的上下游引物在Bio-RadicyclerPCR仪上进行PCR扩增反应，所用的PCR反应液组成如下：
其中，所述dNTPs为dATP、dTTP、dCTP、dGTP，四者浓度均为250mM，四者物质的量比为1：1：1：1，
耐万古霉素肠球菌基因组DNA50ng/μL、1μL
水补足至20μL；
PCR扩增反应条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃；
1102：将PCR产物经质量百分数1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；
1103：用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并经测序仪进行测序验证，耐万古霉素肠球菌VanA和VanB基因对应的片段长度分别为119bp和98bp片段，即为所需要的VanA基因标准品和VanB基因标准品，测定浓度并换算成质量/体积；
2)VanA基因标准品和VanB基因标准品的PCR扩增反应：
其中，PCR反应液组成如下：
其中，所述dNTPs为dATP、dTTP、dCTP、dGTP，四者浓度均为250mM，四者物质的量比为1：1：1：1，
标准品DNA4μL
其中，所述标准品DNA为VanA和VanB，并且VanA和VanB浓度均50ng/μL，
水补足至50μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时进行；
3)绘制标准曲线
按照步骤2)将不同浓度5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL的VanA基因标准品和VanB基因标准品依次进行检测，并绘制标准曲线；
4)用基因组DNA提取试剂提取待检测细菌基因组DNA，将基因标准品DNA替换成待检测细菌基因组DNA，按照步骤2)进行测试；
5)将步骤4)测定结果与标准曲线对比，得出检测结果；
所述测序仪为ABI公司生产的377型测序仪；
所述克隆系统和pGEM-T-Easy克隆载体购自美国Promega公司。
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