CN105177157B - 用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因的特异性保守靶序列设计的，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12‑F3和VanB12‑B3、内引物VanB12‑FIP和VanB12‑BIP。利用本发明可在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地定性检出纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，无需复杂仪器，为VanB基因的检测提供了新的技术平台。

Description

用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物
技术领域
本发明属于生物技术领域中基因的分子生物学检测，特别是涉及一种VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测VanB基因中的应用。
背景技术
VanB基因是耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistant Enterococci，VRE)的耐药基因型中的一种，主要存在于粪肠球菌及屎肠球菌中。VanB表型耐药基因多位于宿主染色体上，也可存在于质粒上，可通过共轭机制，由质粒介导将耐药基因在种内或种间水平或垂直传播，从而传递给其它肠球菌属或其它细菌。
20世纪50年代发现的糖肽类抗生素万古霉素被用作治疗多重耐药G+菌株感染的首选药物，曾被誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。自1988年英国首次分离并报道耐万古霉素肠球菌(VRE)以来，使这一最后防线面临崩溃，给临床治疗造成极大的困难，引起了广泛的重视，目前它已逐渐成为医院感染的重要病原菌之一。据报道由VRE引起的院内尿路感染所占比例为16％，仅次于大肠杆菌。VRE被美国疾病预防控制中心列为第二大医院感染病原体，在ICU院内感染患者中VRE的分离率也呈上升趋势。据我国医院感染监控网的统计分析VRE引起的院内感染在G+中排在第4位。VRE不但对万古霉素高度耐药，而且其耐药因子能转移给其它G+菌株，如致病性很强的金黄色葡萄球菌。因此，对人类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括由于其耐药因子的转移可能产生的一些难以治疗的新耐药菌株。
肠球菌通常为条件致病菌。当发生异位寄生时，肠球菌可引起多种感染，如泌尿系感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症、伤口感染、呼吸道感染等，严重的可危及生命。与其它革兰氏阳性菌相比，肠球菌属具有更强的天然耐药性，且易被抗生素诱导产生新的耐药性。近年来，由于免疫抑制剂在临床治疗中广泛应用，以及广谱抗生素的过度使用及不合理应用等因素导致肠球菌属感染和耐药性日益增多，已成为院内感染的主要致病菌。随着耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现，临床治疗耐药菌感染面临着更大的困难。
根据VRE的耐药表型及能否发生耐药因子转移等特点，VRE基因型被分为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE和VanG等6种，其中只有VanA和VanB型有重要的临床意义。VanA和VanB型VRE可呈现高水平万古霉素耐药，且其耐药因子容易发生转移，是引起感染和流行的主要病原体类型。VanB基因检测可用于判断样品是否对万古霉素耐药，以指导用药。
LAMP技术介绍：
环介导恒温核酸扩增技术(1oop-mediated isothermal ampl ification，LAMP)是由Notomi(Notomi T,et al.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA.Nucleic Acids Res 2000；28(12):63.)发明的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对靶基因(DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下进行基因扩增反应，结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。具有快速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特点。
自2000年发明以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、食品安全等领域的分子生物检测领域。2011年Nakauchi M等建立的基于LAMP技术的H1N1实验室快速诊断方法(Nakauchi M，et al.Evaluation of reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic influenza A/H1N12009virus.J Med Virol.2011Jan；83(1):10-5.)目前，LAMP已被广泛用于肺炎支原体(Gotoh K,et al.Assessment of the loop-mediated isothermal amplification assayfor rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in pediatric community-acquiredpneumonia.Jpn J Infect Dis.2013；66(6):539-42.)、结核杆菌(Kumar P,et al.Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive diagnosis oftuberculosis.Pandya D,Singh N,J Infect.2014Sep 9.[Epub ahead of print])、SARS(Poon LL,et al.Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome(SARS)coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assay.ClinChem.2004Jun；50(6):1050-2.)、HIV(Curtis KA,et al.Real-Time Detection of HIV-2by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.J ClinMicrobiol.2014Jul；52(7):2674-6.)等疾病的检测中等病原体的诊断。近期爆发于西非的埃博拉病毒的LAMP检测试剂盒已研究成功。目前，国内未见有用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。
发明内容
本发明提供了用于对VanB基因进行LAMP检测的引物，以实现VanB基因的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
本发明所提供的用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因P1基因(GenBank号：CP002077.1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和VanB12-B3、以及内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合；所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。
具体来讲，所述用于对VanB基因进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2(VanB12-F3)、SEQ ID NO：3(VanB12-B3)、SEQ ID NO：4(VanB12-FIP)和SEQID NO：5(VanB12-BIP)所示。
所述的LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP按摩尔比5:40的组合物。
本发明的第二个目的是提供一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对VanB基因进行LAMP检测的引物。
具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系(不含模板)的试剂：Mixture(主要成分包括：2mM Tris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO43.8μL，0.1％Tween200.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNA polymerase 1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F30.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物VanB12-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物VanB12-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物VanB12-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol。
为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带VanB基因的粪肠球菌V583，所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。
上述LAMP引物或试剂盒在VanB基因LAMP检测中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供一种VanB基因的LAMP检测方法。
本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤：
1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP反应体系为：待测样品基因组DNA 2μL，Mixture(主要成分包括：2mM Tris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween200.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNA polymerase1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F3 0.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物VanB12-B30.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物VanB12-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物VanB12-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；LAMP扩增条件为：置58-65℃恒温40-50min；
2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在VanB基因(结果阳性)，橙色表示待测样品中不存在VanB基因(结果阴性)；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度(比浊度≥0.1)上升表示待测样品中存在VanB基因(结果阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基因(结果阴性)。
在上述检测方法中，所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为VanB基因，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水；所述LAMP扩增条件优选为：置65℃恒温45min。
所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量可为1μL(终反应体系为26μL)，含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。
本发明提供了一种VanB基因的LAMP检测方法及其专用引物。本发明检测VanB基因的原理是采用LAMP技术对VanB基因的特异性保守靶序列进行检测。
本发明具有以下优点：
1、操作简单，设备要求低。本发明只需将检测样品和检测反应液放入58-65℃恒温(水浴锅，恒温金属浴或浊度仪等)装置中孵育40-50分钟后即可判断结果。检测结果可通过肉眼观察(钙黄绿素显色)或浊度仪判断，无需复杂仪器。
2、特异性好，灵敏度高。本发明设计的四条引物对VanB基因靶序列特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；灵敏度可比普通PCR高10-100倍；
3、检测时间短、扩增效率高。整个LAMP扩增反应可在一小时内完成，目的基因产率可达到0.7mg/mL。
综上所述，本发明可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检出VanB基因，无需复杂仪器，为VanB基因的检测提供了新的技术平台。本发明可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测VanB基因，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为四套引物组合的LAMP反应曲线；
图2为用于确定VanB基因最佳反应条件的LAMP反应曲线；
图3为VanB基因LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果；
图4为VanB基因LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂检测结果；
图5为VanB基因LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果；
图6为VanB基因LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂检测结果；
图7为VanB基因普通PCR检测方法灵敏度的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物由生工生物工程股份有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、设计用于对VanB基因进行LAMP检测的引物
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得VanB基因序列(GenBank号：KC489784.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得VanB基因的特异性保守靶序列(序列表中SEQ ID NO：1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对VanB基因进行LAMP检测的引物，设计出四套引物(代号分别为VanB-1、VanB-6、VanB-9、VanB-12)，经过实验对比，最终选取了引物组合VanB12，引物序列如下。
表1用于对VanB进行LAMP检测的引物组合VanB-12
实施例2、VanB基因的LAMP检测
一、确定用于VanB基因LAMP检测的最佳引物组合
用实施例1设计的四套引物组合(代号为VanB-1、VanB-6、VanB-9、VanB-12)对VanB基因进行LAMP检测，以获得最佳引物组合，具体方法如下：
1)提取肠球菌V583的基因组DNA
用PromegaGenomic DNA Purification Kit A1125提取粪肠球菌V583的基因组DNA，具体提取方法包括以下步骤：
1.吸取560μL准备好的buffer AVL(含有carrier RNA)到1.5mL离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)
2.将140μL血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。
3.室温放置10min。
4.瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
5.样品中加入560μL无水乙醇(96％-100％)，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。
6.吸取630μL上步中的溶液小心的加入column(已装入到2mL离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g(8000rpm)离心1min。将column放入新的2mL离心管中，弃去旧的收集管。
7.小心的打开column的盖子，重复第6步。
8.小心的打开column盖子，加入500μL buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将column放入新的2mL收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管。
9.小心的打开column盖子，加入500μL buffer AW2。盖上盖子，全速离心(14000rpm)，3min。
10.将column放在1.5mL离心管(kit中未提供)中。弃去旧的收集管。小心的打开column，加入60μL室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min。8000rpm离心1min。
2)分别在上述四套引物组合的引导下进行LAMP扩增，25μL LAMP反应体系包括：含VanB基因的粪肠球菌基因组V583DNA 2μL(终浓度>1ng/μL)，Mixture(主要成分包括：2mMTris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNApolymerase 1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物F30.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；反应条件为65℃恒温50min。
3)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1μL(终反应体系为26μL)含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果(原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化)，绿色表示待测样品中存在VanB基因(阳性)，橙色表示待测样品中不存在VanB基因(阴性)；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升表示待测样品中存在VanB基因(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基因(阴性)。
在荣研化学株式会社公司的LA230型号的环介导等温核酸扩增仪器上进行等温扩增反应并记录结果，四套引物组合的LAMP反应曲线如图1(横坐标为反应时间，纵坐标为反应产物在650nm的浊度值)所示，从图中可以看出引物组合VanB-12的反应效果最好。
因此，本发明的最佳引物组合为VanB-12，包括：引物VanB12-F3(SEQ ID NO：2)和VanB12-B3(SEQ ID NO：3)，引物VanB12-FIP(SEQ ID NO：4)和VanB12-BIP(SEQ ID NO：5)。具体内容见实施例1。
二、确定用于VanB基因LAMP检测的最佳反应条件
用实施例1获得的用于对VanB基因进行LAMP检测的引物组合VanB-12对携带VanB基因的粪肠球菌V583(标准株购于北京生物制品药品检定所)进行LAMP检测，以获得最佳反应条件，具体方法如下：
在不同反应温度下对含VanB基因的粪肠球菌V583基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，具体方法如下：
1、以含VanB基因的粪肠球菌V583基因组DNA(PromegaGenomic DNAPurification Kit A1125提取待测样品中的核酸)为模板，在实施例1获得的引物组合VanB12的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系包括：含VanB基因的粪肠球菌基因组V583DNA 2μL(终浓度>1ng/μL)，Mixture(主要成分包括：2mM Tris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO43μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNA polymerase 1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，LAMP扩增条件为：置58-65℃恒温60min；
2、反应结束后进行结果判定：与步骤一相同。
结果如图2所示，在58-65℃恒温60min的LAMP扩增条件下，引物组合VanB-12均取得了较好的反应效果，65℃与59℃的扩增效率基本一致，但基于温度就高不就低的原则，65℃定为最佳温度。
最佳的VanB基因的LAMP扩增条件为：置58-65℃恒温40-60min，优选为置65℃恒温45min。
实施例3、本发明VanB基因的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测
一、本发明VanB基因的LAMP检测方法的特异性检测
分别以鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌O139群、炭疽芽孢杆菌、大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠伤寒沙门菌、阿伯丁沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、鲁氏不动杆菌、肠致病性大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺菌(来源于军事医学科学院疾病预防控制所传染病控制中心)、携带VanA基因的粪肠球菌V309、粪肠球菌-1、粪肠球菌-2、粪肠球菌-3、粪肠球菌-4、屎肠球菌-1、屎肠球菌-2、屎肠球菌-3、屎肠球菌-4(来源于来源于解放军309医院检验科)、嗜麦芽寡养假单胞菌(来源于解放军307医院)、百日咳杆菌(CMCC 58003)、铜绿假单胞菌(CMCC10104)、白喉杆菌(CMCC 38001)、粪肠球菌V583(来源于北京生物制品药品检定所)的基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照、以粪肠球菌V583为阳性对照检测实施例2获得的最佳的VanB基因的LAMP检测方法的特异性。
浊度仪检测结果如图3所示，其中1、携带NDM1基因的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)；3、携带Van A基因的肠球菌V309(Enterococcusfaecalis V309)；4、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；5、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；6、霍乱弧菌O139群(Vibrio cholerae O139)；7、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)；8、大肠埃希菌(Escherichia coli)；9、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)；10、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)；11、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；12、阿伯丁沙门菌(Aberdeen Salmonella)；13、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)；14、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)；15、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)；16、肠致病性大肠埃希菌(Pathogenic Escherichia coli)；17、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；18、粪肠球菌-1(E.faecalis)；19、粪肠球菌-2(E.faecalis)；20、粪肠球菌-3(E.faecalis)；21、粪肠球菌-4(E.faecalis)；22、屎肠球菌-1(E.faecium)；23、屎肠球菌-2(E.faecium)；24、屎肠球菌-3(E.faecium)；25、屎肠球菌-4(E.faecium)；26、福氏志贺菌(Shigella flexneri)；27、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)；28、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；29、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；30、阴性对照(ddH2O)；31、阳性对照(E.faecium V583)，从图中可以看出在50min反应时间内，只有阳性对照(V583，图3中标号31)发生了LAMP反应，其余菌株均未发生，表明本发明的VanB基因的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到VanB基因。
钙黄绿素指示剂检测结果如图4所示，其中1、携带NDM1基因的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)；3、携带Van A基因的肠球菌V309(Enterococcusfaecalis V309)；4、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；5、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；6、霍乱弧菌O139群(Vibrio cholerae O139)；7、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)；8、大肠埃希菌(Escherichia coli)；9、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)；10、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)；11、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；12、阿伯丁沙门菌(Aberdeen Salmonella)；13、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)；14、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)；15、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)；16、肠致病性大肠埃希菌(Pathogenic Escherichia coli)；17、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；18、粪肠球菌-1(E.faecalis)；19、粪肠球菌-2(E.faecalis)；20、粪肠球菌-3(E.faecalis)；21、粪肠球菌-4(E.faecalis)；22、屎肠球菌-1(E.faecium)；23、屎肠球菌-2(E.faecium)；24、屎肠球菌-3(E.faecium)；25、屎肠球菌-4(E.faecium)；26、福氏志贺菌(Shigella flexneri)；27、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)；28、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；29、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；30、阴性对照(ddH2O)；31、阳性对照(E.faecium V583)，从图中可以看出在50min反应时间内，只有阳性对照(V583)显示为绿色(阳性，标号31，标记“+”)，其余菌株均显示橙色(阴性)，进一步表明本发明的VanB基因的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到VanB基因。
二、本发明VanB基因的LAMP检测方法的灵敏度检测
比较本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测VanB基因的灵敏度，方法为：提取携带VanB基因的肠球菌总DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍)进行稀释，使总DNA的浓度分别为700ng/μL、70ng/μL、7ng/μL、700pg/μL、70pg/μL、7pg/μL、0.7pg/μL、0.07pg/μL，再以经梯度稀释的总DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物为VanB12-F3和VanB12-B3)进行灵敏度检测。
检测结果如图5-7所示，图5显示本发明VanB基因的LAMP检测方法可检测到70pg/μL；图6和图7中标号1-8代表模板中总DNA的浓度分别为700ng/μL、70ng/μL、7ng/μL、700pg/μL、70pg/μL、7pg/μL、0.7pg/μL、0.07pg/μL，图6钙黄绿素指示剂染色方法检测结果(“+”表示结果阳性(绿色)，“-”表示结果阴性(橙色))和浊度仪检测方法的结果一致，最低可检测到70pg/μL(标号5)；而图7普通PCR方法最低只能检测到7ng/μL(标号3)，表明本发明VanB基因的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。
实施例4、VanB基因LAMP检测试剂盒
本发明提供的试剂盒包括：用于对VanB基因进行LAMP检测的VanB12引物：引物VanB12-F3(SEQ ID NO：2)和VanB12-B3(SEQ ID NO：3)，引物VanB12-FIP(SEQ ID NO：4)和VanB12-BIP(SEQ ID NO：5)。
具体的，所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系(不含模板)的试剂：Mixture(主要成分包括：2mM Tris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8UBst DNA polymerase 1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F3 0.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物VanB12-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物VanB12-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物VanB12-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol。
试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带VanB基因粪肠球菌V583，所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。
该VanB基因的LAMP检测试剂盒可参考实施例2的方法使用。具体可包括以下步骤：
1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP反应体系为：待测样品基因组DNA 2μL，Mixture(主要成分包括：2mM Tris·HCl(pH 8.8)0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNA polymerase1μL，ddH2O 7.7μL)21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F3 0.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物VanB12-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物VanB12-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物VanB12-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；LAMP扩增条件为：置58-65℃恒温40-50min；
2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在VanB基因(结果阳性)，橙色表示待测样品中不存在VanB基因(结果阴性)；钙黄绿素指示剂的添加量可为1μL(终反应体系为26μL)，含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。
或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度(比浊度≥0.1)上升表示待测样品中存在VanB基因(结果阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基因(结果阴性)。

Claims (5)

1.用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据GenBank号为CP002077.1的VanB基因P1的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便或血液样品中的VanB基因，所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述LAMP引物由四条引物组成，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的外引物VanB12-F3和VanB12-B3、以及核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合。
2.根据权利要求1所述的用于检测VanB基因的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP按摩尔比5:40的组合物。
3.一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对VanB基因进行LAMP检测的引物。
4.根据权利要求3所述的用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系的试剂，反应体系不含模板：主要成分包括pH 8.8的2mMTris·HCl 0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH4)2SO4 3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱0.3μL，8mM MgSO4 3μL，1.4mM dNTP 0.5μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，ddH2O 7.7μL的Mixture 21.2μL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F3 0.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物VanB12-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物VanB12-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物VanB12-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol。
5.根据权利要求3或4所述的用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带VanB基因粪肠球菌V583，所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。
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