CN102007222A

CN102007222A - 用于检测耐药微生物的方法

Info

Publication number: CN102007222A
Application number: CN2008801038846A
Authority: CN
Inventors: 耶西·D·米勒; 熙-周·C·刘; 拉尼亚宁·V·帕塔萨拉蒂
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2011-04-06
Also published as: US20110189665A1; BRPI0814480A2; CA2696433A1; EP2188387A1; JP2010536343A; WO2009032486A1

Abstract

本发明提供了用于在样品中检测耐药微生物(例如耐万古霉素肠球菌属)的方法和寡核苷酸。

Description

用于检测耐药微生物的方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2007年8月13日的美国临时专利申请No.60/964,499的优先权，该专利申请以引用的方式并入本文。

背景技术

肠球菌属细菌是存在于自然界、动物和人类体内的革兰氏阳性球菌。肠球菌是人类正常胃肠道和生殖道细菌群落的一部分。在已知的菌种中，人体内最主要的是粪肠球菌(80-90％)和屎肠球菌(5％至10％)。肠球菌通常不是人体内的病原体；但它们显示出增加的多种药物抗性水平(Kaufhold and Klein，1995，Zentralblatt.Fuer.Bakterilogie.，282(4)：507-518；Svec et al.，1996，Epidemiologie MikrobiologieImunologie，45：153-157)(Kaufhold和Klein，《细菌学文摘》1995年第282(4)期第507-518页；Svec等人，《流行病学、微生物学、免疫学》1996年第45期第153-157页)，并且已经被越来越多地看作导致医院感染的重要原因。粪肠球菌感染包括尿路感染(UTI)、菌血症、心内膜炎、以及伤口和腹盆部感染，占所有尿路感染的16％和所有菌血症的8％。

耐万古霉素肠球菌(VRE)已经被看作导致医院感染的第二大常见原因，仅次于大肠杆菌。耐药性可通过染色体介导(内在)或质粒或转座子介导(获得)。VRE的特征在于对几乎全部现有的抗生素具有耐药性，其中包括万古霉素，而万古霉素被看作是有效抵抗革兰氏阳性菌的“终极”抗生素。内科医生可以选择的治疗方案是有限的，其中包括抗菌剂的组合使用或使用新的未经证实疗效的化合物。患者可能在没有症状的情况下移植和携带VRE，主要移植部位为肛门、腋窝、粪便、会阴、肚脐、伤口、导尿管、以及结肠造口术部位。

粪肠球菌质粒介导的vanA是赋予高水平万古霉素耐药性的基因，它可以体外转移至若干革兰氏阳性微生物，例如金黄色葡萄球菌(Leclercq et al.，1989，Antimicrob.Agents Chemother.33：10-15；Noble etal.，1992，FEMS Microbiology Letters，72：195-198)(Leclercq等人，《抗微生物制剂和化学治疗》1989年第33期第10-15页；Noble等人，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》1992年第72期第195-198页)。据报道，万古霉素在临床分离金黄色酿脓葡萄球菌、链球菌属、迟缓埃格特菌和无害梭菌时表现出耐药性，并且万古霉素耐药性最有可能从耐万古霉素肠球菌获得(Centers for Disease Control andPrevention.2002.Morb.Mortal.Wkly.Rep.，51：565-567；Centers forDisease Control and Prevention.2002，Morb.Mortal.Wkly.Rep.51：902；Weigel et al.，2003，Science，302：1569-1571；Weigel et al.，2007，Antimicrob.Agents Chemother.，51：231-238；Mevius et al.，1998，J.Antimicrob.Chemother.，42：275-276；Poyart et al.，1997，Antimicrob.Agents Chemother.，41：24-29；Stinear et al.，2001，Lancet，357：855-856)(疾病预防控制中心，《发病率与死亡率周报》2002年第51期第565-567页；疾病预防控制中心，《发病率与死亡率周报》2002年第51期第902页；Weigel等人，《科学》2003年第302期第1569-1571页；Weigel等人，《抗微生物制剂和化学治疗》2007年第51期第231-238页；Mevius等人，《抗微生物和化学疗法杂志》1998年第42期第275-276页；Poyart等人，《抗微生物制剂和化学治疗》1997年第41期第24-29页；Stinear等人，《柳叶刀》2001年第357期第855-856页)。

发明内容

人们对于涉及耐药微生物早期鉴别和治疗性介入的诊断工具有着持续的需求。

本发明包括用于检测生物样品中的耐药微生物的方法。例如，该方法可以包括扩增生物样品中存在的靶多核苷酸以生成扩增产物，其中靶多核苷酸与微生物对万古霉素的耐药性相关。扩增可以包括至少一个循环步骤，其中循环步骤包括在合适条件下使第一引物和第二引物接触生物样品以生成扩增产物，并且在合适条件下使探针接触扩增产物以使得探针与扩增产物杂交。探针的T_M可以比第一引物和第二引物的T_M高至少8℃。检测扩增产物，其中扩增产物的存在表明生物样品中存在耐药微生物。

靶多核苷酸可以为vanA多核苷酸，例如，包含SEQ ID NO：7或其一部分的多核苷酸。可用来扩增此类多核苷酸的引物的例子包括(例如)具有与SEQ ID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列的第一引物和具有与SEQ ID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列的第二引物，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：7的一部分，优选地扩增SEQ IDNO：7的核苷酸648-751。该方法可用的探针包括核苷酸序列与SEQ IDNO：3的同一性至少为约80％和/或核苷酸序列基本上与SEQ ID NO：7互补的探针。

靶多核苷酸可以为vanB多核苷酸，例如，包含SEQ ID NO：8或其一部分的多核苷酸。可用来扩增此类多核苷酸的引物的例子包括(例如)具有与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列的第一引物和具有与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列的第二引物，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：8的一部分，优选地扩增SEQ IDNO：8的核苷酸492-630。该方法可用的探针包括核苷酸序列与SEQ IDNO：6的同一性至少为约80％和/或核苷酸序列基本上与SEQ ID NO：8互补的探针。

该方法可以包括用探针、第一引物和第二引物接触生物样品以形成混合物，其中引物能够扩增与微生物中万古霉素的耐药性相关的靶多核苷酸，并且其中探针将与靶多核苷酸杂交。探针的T_M可以比第一引物和第二引物的T_M高至少8℃。如果生物样品中存在与耐药性相关的多核苷酸，则将混合物暴露在适合形成扩增产物的条件下。检测扩增产物，其中扩增产物的存在表明生物样品中存在耐药微生物。

该方法可以包括扩增生物样品中存在的靶多核苷酸以生成扩增产物，其中生物样品在合适的条件下接触第一vanA引物和第二vanA引物、第一vanB引物和第二vanB引物、或它们的组合，以生成扩增产物。第一vanA引物可以包含与SEQ ID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二vanA引物可以包含与SEQ ID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751。第一vanB引物可以包含与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二vanB引物可以包含与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630。检测扩增产物，其中扩增产物的存在表明生物样品中存在耐药微生物。

该方法可以包括使生物样品接触第一vanA引物和第二vanA引物以形成混合物，接触第一vanB引物和第二vanB引物以形成混合物，或它们的组合。第一vanA引物可以包含与SEQ ID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二vanA引物可以包含与SEQ ID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751。第一vanB引物可以包含与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二vanB引物可以包含与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630。如果生物样品中存在vanA多核苷酸或vanB多核苷酸，则将混合物暴露在适合形成扩增产物的条件下，并且检测到不存在扩增产物，其中不存在扩增产物表明生物样品中不存在耐药微生物。

在一些方面，该方法还可以包括使探针接触生物样品，其中探针的T_M比第一引物和第二引物的T_M高至少8℃。探针可以包含荧光团和淬灭物。该方法还可以包括使用第二探针，其中第二探针的T_M比该方法中使用的引物的T_M高至少8℃。当使用两个探针时，一个探针可以包含供体荧光团，第二探针可以包含受体荧光团。

耐药微生物可以为革兰氏阳性微生物，例如葡萄球菌属(例如金黄色酿脓葡萄球菌)或肠球菌属(例如粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、鸡肠球菌、或坚忍肠球菌)的细菌。本发明的方法还可以包括获得生物样品。生物样品可来自疑似感染耐药微生物的个体，并且生物样品可得自粪便物。可以在每个循环步骤后检测扩增产物是否存在。

本发明还提供用于分离多核苷酸的方法。该方法可以包括提供单链多核苷酸的混合物，在适合使寡核苷酸与单链多核苷酸特异性杂交的条件下，将该混合物暴露于寡核苷酸中以生成杂交体。寡核苷酸包括选自下列的核苷酸序列：与SEQ ID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列、与SEQ ID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列、与SEQID NO：3的同一性至少约80％的核苷酸序列、与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列、与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列、或与SEQ ID NO：6的同一性至少约80％的核苷酸序列。接着可以洗涤杂交体以移除污染物。寡核苷酸可以包括亲和标记，并且可以在暴露前后将寡核苷酸连接至固相材料。混合物可以得自生物样品，并且该方法还可以包括使生物样品中存在的多核苷酸变性，以生成单链多核苷酸。

本发明还包括试剂盒。试剂盒可以包括包装材料、第一vanA引物、第二vanA引物和探针，并且其中探针的T_M比第一和第二vanA引物的T_M高至少8℃。探针可以包含与SEQ ID NO：3的同一性至少约80％的核苷酸序列，并且可以与SEQ ID NO：7杂交。第一引物可以包含与SEQID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二引物可以包含与SEQID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQID NO：7的核苷酸648-751。

试剂盒可以包括包装材料、第一vanB引物、第二vanB引物和探针，并且其中探针的T_M比第一和第二vanB引物的T_M高至少8℃。探针可以包含与SEQ ID NO：6的同一性至少约80％的核苷酸序列，并且可以与SEQ ID NO：8杂交。第一引物可以包含与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列，第二引物可以包含与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中该引物对可扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630。

探针可以包含荧光团和淬灭物。

本发明还包括分离的多核苷酸，包括(例如)：与SEQ ID NO：1的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中多核苷酸在与SEQ ID NO：2一起使用时可以扩增包含SEQ ID NO：7的核苷酸648-751的多核苷酸；与SEQ ID NO：2的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中多核苷酸在与SEQ ID NO：1一起使用时可以扩增包含SEQ ID NO：7的核苷酸648-751的多核苷酸；与SEQ ID NO：4的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中多核苷酸在与SEQ ID NO：5一起使用时可以扩增包含SEQID NO：8的核苷酸492-630的多核苷酸，以生成约139个核苷酸的扩增产物；以及与SEQ ID NO：5的同一性至少约80％的核苷酸序列，其中多核苷酸在与SEQ ID NO：4一起使用时可以扩增包含SEQ ID NO：8的核苷酸492-630的多核苷酸。

定义

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式(核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或肽核酸(PNA))，并且包括双链和单链RNA、DNA和PNA。多核苷酸可以包含具有不同功能的核苷酸序列，这些功能包括(例如)编码区和非编码区(例如调控区)。多核苷酸可以直接从天然来源获得，或者可以利用重组、酶或化学技术制备。多核苷酸可以具有直链或环状拓扑结构。多核苷酸可以为(例如)载体的一部分(例如表达或克隆载体)或片段。“寡核苷酸”是指本发明的多核苷酸，通常为引物和/或探针。

如本文所用，“靶多核苷酸”包含需要扩增的所关注的多核苷酸序列。就其实际序列而言，靶序列可以为已知或未知。

“编码区”是指这样的核苷酸序列：该核苷酸序列对多肽进行编码，并且在合适的调控序列控制下表达所编码的多肽。编码区的边界通常取决于其5′端的翻译起始密码子和3′端的翻译终止密码子。“调控序列”是指用于调控编码序列(与调控序列可操作地连接)的表达的核苷酸序列。调控序列的非限制性例子包括启动子、增强子、转录起始点、翻译起始点、翻译终止点、以及转录终止子。术语“可操作地连接”是指成分的并列，使得各成分处于使其按预期方式发挥作用的关系。当调控序列与编码区的连接方式使得编码区在与调控序列相容的条件下实现表达，此时则称调控序列“可操作地连接”到编码区。

如本文所用，“引物”是与靶多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸，其在与靶多核苷酸杂交之后，可以作为扩增反应和扩增产物合成的起点。“引物对”是指可以共同用于扩增反应的两种引物。“vanA引物”和“vanB引物”是指分别与vanA或vanB多核苷酸杂交，并且可以在适当条件下引发扩增的引物对。如本文所用，“探针”是与使用两种引物形成的扩增产物的至少一部分互补的寡核苷酸。“vanA探针”和“vanB探针”分别是指与使用vanA引物或vanB引物形成的扩增产物杂交的探针。

如本文所用，术语“互补”和“互补的”是指两种单链多核苷酸(例如，引物和靶多核苷酸)相互形成碱基对的能力，其中多核苷酸一个链上的腺嘌呤与第二多核苷酸链上的胸腺嘧啶或尿嘧啶形成碱基对，并且多核苷酸一个链上的胞核嘧啶与第二多核苷酸链上的鸟嘌呤形成碱基对。当一种多核苷酸内的核苷酸序列与第二多核苷酸内的核苷酸序列可以形成碱基对时，这两种多核苷酸彼此互补。例如，5′-ATGC与5′-GCAT互补。如本文所用，术语“基本上互补”、“基本互补的”和“基本互补性”是指在严格杂交条件下能够选择性地杂交至指定多核苷酸的多核苷酸。严格杂交可以在多种pH值、盐和温度条件下进行。pH值可以为6至9，优选地为6.8至8.5。盐浓度可以为0.15M钠至0.9M钠，并且只要离子强度与钠的指定离子强度相当，就可以使用其他阳离子。杂交反应温度可以为30℃至80℃，优选地为45℃至70℃。另外，可以在杂交反应中添加其他化合物，以便在较低温度(例如室温或接近室温)下促进特异性杂交。可用于达到降低温度要求的化合物包括甲酰胺。因此，如果在多核苷酸和第二多核苷酸之间发生杂交，则多核苷酸通常与第二多核苷酸是“基本上互补的”。如本文所用，“特异性杂交”是指两种多核苷酸在严格杂交条件下的杂交。

“同一性”是指寡核苷酸(例如引物或探针)与靶多核苷酸或扩增产物的至少一部分之间的序列相似性。相似性通过比对两种多核苷酸的残基(即，引物或探针的核苷酸序列和参考核苷酸序列)，从而优化沿其序列长度的相同核苷酸的数量来确定；进行比对时允许两个序列或其中一个序列内有空位，以优化共用核苷酸的数目，但每个序列内的核苷酸必须仍然保持其正确顺序。序列相似性通常为至少约80％的同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的同一性、或至少约95％的同一性。序列相似性可以(例如)使用序列技术(例如GCG FastA(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)、MacVector 4.5(Kodak/IBI软件包))或本领域已知的其他合适的序列分析程序或方法进行测定。优选地，引物和靶多核苷酸之间或探针和扩增产物之间的序列相似性使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序确定，如Tatusova等人(1999，FEMS Microbiol Lett.，174：247-250)(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》1999年第174期第247-250页)所述，并且序列相似性可以从万维网上获取，例如从美国国家卫生研究院国家生物技术信息中心的互联网站上获取。优选的是，使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括匹配得分(reward for match)＝1、失配罚分(penalty formismatch)＝-2、空位开放罚分(open gap penalty)＝5、空位延伸罚分(extension gap penalty)＝2、空位x_下降(gap x_dropoff)＝50、期望值(expect)＝10、字长(wordsize)＝11，并且可选地过滤器(filter)开启。在使用BLAST搜索算法比较两个核苷酸序列过程中，序列相似性称为“同一性”。

“标记”是指(共价地或非共价地)连接或能够被连接到寡核苷酸的部分，其提供或能够提供有关该寡核苷酸的信息(如有关该寡核苷酸的描述或识别信息)或有关与被标记寡核苷酸相互作用(如杂交)的另一个多核苷酸的信息。标记可用来提供可检测(并且可任选地可定量)的信号。标记还可以用来将寡核苷酸连接到表面。

“荧光团”是指在吸收较短波长的光之后能够发出特定波长的光的部分。特定荧光团发出的光的波长是该荧光团特有的。因此，用较短波长的光激发荧光团，然后检测适当波长的光，就可以检测出特定荧光团。

如本文所用，术语“淬灭物”是指吸收荧光团发出的能量或以其他方式影响荧光染料发光能力的部分。淬灭物可以在该淬灭物的信号特性中重新发出从荧光团中吸收的能量，因此淬灭物也可以充当荧光团(荧光淬灭物)。该现象通常被称为荧光共振能量转移(FRET)。作为另外一种选择，淬灭物能够将从荧光团吸收的能量以热量形式耗散(非荧光淬灭物)。

“生物样品”是指可以从真核或原核源获得的样品。真核源的例子包括哺乳动物，例如人类或鼠科生物(诸如大鼠或小鼠之类的鼠科动物)。原核源的例子包括肠球菌。生物样品可以为(例如)单细胞形式、组织形式或流体形式。细胞或组织可以通过体外培养获得。

“允许”事件发生的条件或“适合”事件(例如杂交、链延伸等)发生的条件或“适当的”条件是指不会妨碍这类事件发生的条件。因此，这些条件允许、促进、推动和/或有利于事件。本领域已知和本文所述的这些条件可以取决于(例如)核苷酸序列的性质、温度和缓冲条件。这些条件也可以取决于所需事件的类型，例如杂交、裂解或链延伸。

“分离的”多核苷酸是指已经从其自然环境中移除的多核苷酸。“纯化的”多核苷酸是指至少约60％不含有、优选地至少约75％不含有、并且最优选地至少约90％不含有自然相关联的其他组分的多核苷酸。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些有益效果的本发明的实施例。然而，在相同情况下或在其他情况下，其他实施例也可能是优选的。此外，一个或多个优选实施例的表述并不意味着其他实施例不可用，并且并非意图将其他实施例排除在本发明的范围外。

术语“包含”及其变型形式当出现在说明书和权利要求中时不具有限制性含义。

除非另作说明，否则“一种”、“一个”、“该”和“至少一个”可交替使用并且意思是一个或更多个。

另外在本文中，通过端点表述的数值范围包括包括在该范围内的所有数值(如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

术语“和/或”表示所列元素中的一者或全部或任意两个或多个所列元素的组合。

本发明的以上概述并非意图描述本发明每个公开的实施例或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了示例性实施例。在贯穿本专利申请的若干处，通过实例列表来提供指导，这些实例可以不同的组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅作为代表性的组，而不应该被解释为排他性的列表。

附图说明

图1A.vanA编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。

图1B.vanB编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。

具体实施方式

本发明包括用于检测耐药原核微生物特有的多核苷酸的方法。该微生物具有vanA或vanB编码区，因而具有耐药性。优选地，原核微生物为肠球菌属的微生物(本文中称为肠球菌属或肠球菌)，例如，粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、鸡肠球菌或坚韧肠球菌，更优选的是粪肠球菌或屎肠球菌，最优选的是粪肠球菌。耐药微生物的其他例子包括(但不限于)葡萄球菌属(例如，金黄色酿脓葡萄球菌)和链球菌属。例如，本发明包括这样的方法：该方法涉及使用扩增技术和寡核苷酸(例如引物和探针)检测耐万古霉素肠球菌中存在的vanA和/或vanB编码区的一部分。采用本发明的方法，可以确定生物样品中耐药微生物的存在。在一些方面，扩增技术包括使用实时分析。本发明还包括本文所述的寡核苷酸。

寡核苷酸

本发明的寡核苷酸包括可用于扩增vanA编码区的一部分的引物。vanA编码区的例子在SEQ ID NO：7(基因库登录号AB247327，参见图1A)有所公开。可用于扩增vanA编码区的一部分的引物可以扩增SEQID NO：7的区域，优选的是包括SEQ ID NO：7的从约648至约751的核苷酸的区域。因此，引物的核苷酸序列可以对应于从约648至约670的核苷酸，优选的是核苷酸648至670(本文中称为SEQ ID NO：1)。同样，引物的核苷酸序列可以对应于从约726至约751的核苷酸互补序列，优选的是726至751的核苷酸互补序列(本文中称为SEQ IDNO：2)。可用于扩增vanA编码区的一部分的引物对的例子包括(但不限于)下列几种：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2具有序列相似性的引物；SEQ ID NO：1和与SEQ ID NO：2具有序列相似性的引物；以及与SEQ ID NO：1具有序列相似性的引物和与SEQ ID NO：2具有序列相似性的引物。

本发明的寡核苷酸包括可用于扩增vanB编码区的一部分的引物。vanB编码区的例子在SEQ ID NO：8(基因库登录号AY665551，参见图1B)有所公开。可用于扩增vanB编码区的一部分的引物可以扩增SEQID NO：8的区域，优选的是包括SEQ ID NO：8的从约492至约630的核苷酸的区域。因此，引物的核苷酸序列可以对应于从约492至约516的核苷酸，优选的是核苷酸492至516(本文中称为SEQ ID NO：4)。同样，引物的核苷酸序列可以对应于从约608至约630的核苷酸互补序列，优选的是608至630的核苷酸互补序列(本文中称为SEQ IDNO：5)。可用于扩增vanA编码区的一部分的引物对的例子包括(但不限于)下列几种：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；与SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5具有序列相似性的引物；SEQ ID NO：4和与SEQ ID NO：5具有序列相似性的引物；以及与SEQ ID NO：4具有序列相似性的引物和与SEQ ID NO：5具有序列相似性的引物。

扩增vanA或vanB编码区的引物可以使用易得的计算机程序进行设计，例如，Primer Express

(Applied Biosystems，Foser City，CA)和IDT

OligoAnalyzer 3.0(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)。设计引物时可以考虑的因素包括(但不限于)熔融温度、引物长度、扩增产物的尺寸、以及特异性。本文所述扩增方法中可用的引物通常具有大于至少56℃、至少57℃、至少58℃或至少59℃的熔融温度(T_M)。引物的T_M可通过华莱士定律(Wallace Rule)(Wallace et al.，1979，Nucleic Acids Res.，6：3543-3557(Wallace等人，《核酸研究》1979年第6期第3543-3557页))或易得的计算机程序(例如IDT Oligo Analyzer3.0)进行测定。通常，引物对的各引物将具有变化不大于4℃、不大于3℃、不大于2℃、或不大于1℃的T_M。通常两种引物都足够长，可以与靶多核苷酸杂交，而不与微生物(优选的是肠球菌)内存在的其他非靶多核苷酸以及扩增反应中存在的其他多核苷酸杂交。引物长度通常在约15和约30个核苷酸之间(例如，15、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸)。

本发明中可用的引物可以与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、或SEQ ID NO：5具有序列相似性。该具有序列相似性的引物内的非互补核苷酸可以位于整个引物上的几乎任何位置。在一些方面，优选的是保留胞核嘧啶或鸟嘌呤残基。例如，在与SEQ ID NO：1具有序列相似性的引物中，更优选的是改变SEQ ID NO：1中的一个或多个腺嘌呤或胸腺嘧啶残基，并且保留胞核嘧啶和鸟嘌呤残基。优选地，具有序列相似性的引物的3′端上的第一核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5中对应的第一核苷酸相同。

与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5具有序列相似性的引物在适当条件下具有扩增靶多核苷酸的活性。具有序列相似性的该候选引物(即，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、或SEQ ID NO：5相对比的引物)是否具有扩增靶多核苷酸的活性，可以使用具有下列参数设置的Lightcycler实时PCR系统(Real-Time PCR System)(Roche，Indianapolis，IN)进行测试：95℃下持续30秒，然后95℃下持续0秒的45次循环(20℃/s的斜率)，60℃下持续30秒(20℃/s的斜率)。扩增可以在包含5微升(μL)样品和5μL下列混合物的10μL总体积内进行：两种引物(均为10微摩尔/升(μM)、0.5μL)、MgCl₂(25mM、2μL)和LightCycler

DNA Master杂交探针(LightCycler

DNA Master Hybridization Probe)(1μL 10x，Roche)。用于评价与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有序列相似性的候选引物的靶多核苷酸是包括SEQ ID NO：7的648至751核苷酸的靶多核苷酸。该核苷酸序列存在于可得自商品名为ATCC 700221^TM的屎肠球菌的全细胞DNA。用于评价与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有序列相似性的候选引物的靶多核苷酸是包括SEQ ID NO：8的492至630核苷酸的靶多核苷酸。该核苷酸序列存在于可得自商品名为ATCC 700802^TM的粪肠球菌的全细胞DNA。当测定与SEQ ID NO：1具有序列相似性的候选引物时，所用第二引物为SEQ ID NO：2。当测定与SEQ ID NO：2具有序列相似性的候选引物时，所用第二引物为SEQ ID NO：1。当测定与SEQ ID NO：4具有序列相似性的候选引物时，所用第二引物为SEQ IDNO：5。当测定与SEQ ID NO：5具有序列相似性的候选引物时，所用第二引物为SEQ ID NO：4。

本发明的引物还可以包含其他核苷酸。通常，此类其他核苷酸存在于引物的5′端并且包括(例如)含有限制性内切酶切点的核苷酸、形成发夹环的核苷酸、以及可以使引物用作(例如)蝎形引物(参见(例如)Whitcombe等人的美国专利6,326,145和Whitcombe et al.，1999，Nat.Biotechnol.，17：804-817(Whitcombe等人，《自然生物技术》1999年第17期第804-817页))或amplifluor引物(参见(例如)Nazarenko etal.，1997，Nucl.Acids Res.，25：2516-2521(Nazarenko等人，《核酸研究》1997年第25期第2516-2521页))的其他核苷酸。如果引物包含此类其他核苷酸，在确定引物是否与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、或SEQ ID NO：5具有序列相似性时，不包括其他核苷酸。同样，在确定引物长度(通常在约10至约50个核苷酸之间)时，也不包括其他核苷酸。

本发明的寡核苷酸包括可用于与使用vanA引物或vanB引物所产生的扩增产物的至少一部分进行杂交的探针。本文可用的此类vanA探针可以与包含SEQ ID NO：7的从约671至约725(优选地为SEQ IDNO：7的从684至712)的核苷酸的区域进行杂交。本文可用的此类vanB探针可以与包含SEQ ID NO：8的从约517至约607(优选地为SEQ IDNO：8的从549至573)的核苷酸的区域进行杂交。

通常，vanA探针设计用于本发明采用特定一组vanA引物的方法中，而vanB探针则设计用于本发明采用特定一组vanB引物的方法中。vanA和vanB探针可以采用类似于本文所述的设计引物的方式进行设计。设计本文所述方法中可用的探针时可以考虑的因素包括(但不限于)熔融温度、长度、探针相对于引物的位置。通常，探针的T_M高于与该探针一起使用的引物的最高T_M。优选地，探针的T_M比与该探针一起使用的引物对的最高T_M高至少约8℃、至少约8.5℃、至少约9℃、至少约9.5℃、或至少约10℃。通常，较高的Tm允许探针在引物之前杂交，这有助于使具有探针的每个扩增产物的标记最大化。

通常，探针具有足够的长度，可以与靶多核苷酸(和扩增产物)杂交，而不与微生物(优选地为肠球菌)中存在的其他非靶多核苷酸和扩增反应中存在的其他多核苷酸杂交。探针长度通常在约15个核苷酸和约30个核苷酸之间。优选地，探针和与其一起使用的引物不会与扩增产物的相同核苷酸进行杂交。探针会与扩增产物的一个链杂交，并且通常设计用于在杂交该链的引物之前与扩增产物进行杂交。在本发明的一些方面，探针在杂交相同链的引物的1、2、3、4或5个核苷酸内与扩增产物的一个链杂交。在本发明涉及使用两个探针的一些方面，该两个探针优选地与扩增产物的相同链杂交，并且该两个探针可以任选地在彼此的1、2、3、4或5个核苷酸内与相同扩增产物杂交。

本发明可用的探针可以与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6具有序列相似性。该具有序列相似性的探针内的非互补核苷酸可以位于整个探针上的几乎任何位置。在一些方面，优选的是保留胞核嘧啶或鸟嘌呤残基。例如，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6具有序列相似性的探针具有在引物对的引物能够杂交的相同条件下与扩增产物杂交的活性。具有序列相似性的该候选探针(即，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6相对比的探针)是否具有该活性，可以通过以下方式测定：在与引物对的扩增反应中添加候选探针，并且确定该候选探针在退火步骤中是否与扩增产物形成杂交体。用于评价与SEQ ID NO：3具有序列相似性的候选探针的靶多核苷酸是包含SEQ ID NO：7的648至751核苷酸的靶多核苷酸，并且用于评价与SEQ ID NO：6具有序列相似性的候选探针的靶多核苷酸是包含SEQ ID NO：8的492至630核苷酸的靶多核苷酸。在测试与SEQ ID NO：3具有序列相似性的候选探针时，使用SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2作为引物对。在测试与SEQ ID NO：6具有序列相似性的候选探针时，使用SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5作为引物对。

本发明的探针还可以包含其他核苷酸。此类其他核苷酸可以存在于5′端和/或3′端，并且包括(例如)形成发夹环的核苷酸以及使该探针可用作(例如)分子信标的其他核苷酸。如果探针包含此类其他核苷酸，在确定探针是否与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有序列相似性时，不包括其他核苷酸。同样，在确定探针长度(通常在约15至约30个核苷酸之间)时，也不包括其他核苷酸。

可以对本发明的寡核苷酸的核苷酸进行改性。这种改性可用来提高多核苷酸在某些环境下的稳定性。这些改性物可以包括核酸主链改性物、碱基改性物、糖改性物、或它们的任何组合。改性物可以为合成的、天然存在的或非天然存在的。本发明的多核苷酸可以包含在该多核苷酸内存在的一个或多个核酸处的改性物。骨架改性物的例子包括(但不限于)磷酰基乙酸酯、硫代磷酰基乙酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、以及肽核酸(Nielson等人，美国专利No.5,539,082；Egholm等人，《自然》1993年第365期第566-568页)。核酸碱基改性物的例子包括(但不限于)肌核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如5-甲基尿苷)、5-卤代尿苷(如5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、或丙炔改性物。核酸糖改性物的例子包括(但不限于)2′-糖改性物，如2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代核苷酸、2′-脱氧-2′-氟尿嘧啶核苷、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟代甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或2′-脱氧核苷酸。

寡核苷酸可以包含标记。标记的例子包括(但不限于)荧光团标记(包括(例如)淬灭物或吸收基团)、非荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、整体改性基团、亲和标记、磁粒子、抗原、酶(包括(例如)过氧化物酶、磷酸酶)、基质等等。标记可以提供通过以下方法检测的信号：荧光、辐射、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性等等。亲和标记提供了与另一个分子的特定交互作用。亲和标记的例子包括(例如)生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、二硝基苯基、地高辛、胆固醇、聚氧乙烯、半抗原、以及肽(例如抗体)。

在某些方面，标记为荧光团。荧光团标记包括(但不限于)荧光素类、羧基罗丹明类、花青类和罗丹明类染料。可用于本发明的其他类别的染料包括(如)聚卤代荧光素类染料、六氯荧光素类染料、香豆素类染料、噁嗪类染料、噻嗪类染料、方酸类染料、镧螯合物类染料、以商品名Alexa FluorJ得自Molecular Probes的系列染料、以及以商品名BodipyJ得自Invitrogen(Carlsbad，CA)的系列染料。荧光素类染料包括(如)6-羧基荧光素(FAM)、2′，4′，1，4，-四氯荧光素(TET)、2′，4′，5′，7′，1，4-六氯荧光素(HEX)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2′-氯-5′-氟-7′，8′-熔融苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)、2′-氯-7′-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、以及2′，4′，5′，7′-四氯-5-羧基-荧光素(ZOE)。羧基罗丹明类染料包括四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四丙醇-6-羧基罗丹明(ROX)、德克萨斯红、R110和R6G。花青类染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。荧光团易商购自(例如)Perkin-Elmer(Foster City，Calif.)、Molecular Probes，Inc.(Eugene，Oreg.)和Amersham GE Healthcare(Piscataway，N.J.)。

标记可以为淬灭物。淬灭物可以为荧光淬灭物或非荧光淬灭物。荧光淬灭物包括(但不限于)TAMRA、ROX、DABCYL、DABSYL、包括硝基噻唑蓝(NTB)在内的花青染料、蒽醌、孔雀石绿、硝基噻唑、以及硝基咪唑化合物。可以耗散从荧光团吸收的能量的非荧光淬灭物的例子包括：可以商品名Black HoleJ得自Biosearch Technologies，Inc.(Novato，CA)的非荧光淬灭物、可以商品名Eclipse DarkJ得自EpochBiosciences(Bothell，WA)的非荧光淬灭物、可以商品名QxlJ得自Anaspec，Inc.(San Jose，CA)的非荧光淬灭物、以及可以商品名IowaBlackJ得自Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa)的非荧光淬灭物。

荧光团和淬灭物通常一起使用，并且可以在相同或不同的寡核苷酸上。当成对使用时，荧光团和荧光淬灭物可以分别称为供体荧光团和受体荧光团。多个常见的荧光团/淬灭物对是本领域所已知的(参见(例如)Glazer et al，Current Opinion in Biotechnology，1997；8：94-102(Glazer等人，《生物技术近期述评》1997年第8期第94-102页)；Tyagi et al，1998，Nat.Biotechnol.，16：49-53(Tyagi等人，《自然生物技术》1998年第16期第49-54页))，并且易商购自(例如)MolecularProbes(Junction City，OR)和Applied Biosystems(Foster City，CA)。可与多种受体荧光团一起使用的供体荧光团的例子包括(但不限于)荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基1-吡啶酸、以及4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸的衍生物。受体荧光团通常取决于所用的供体荧光团。受体荧光团的例子包括(但不限于)LCJ-Red 640、LCJ-Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二亚乙基三胺五醋酸酯或其他镧离子(如，铕或铽)螯合物。供体和受体荧光团易商购自(例如)MolecularProbes或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。

使用供体和受体荧光团的实时分析中可用的探针的例子包括(但不限于)相邻探针(Cardullo et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8790-8794(Cardullo等人，《美国科学院学报》1988年第85期第8790-8794页)；Wittwer，1997，BioTechniques，22：130-131(Wittwer，《生物技术》1997年第22期第130-131页))和Taqman探针(Hollandet al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7276-7280(Holland等人，《美国科学院学报》1991年第88期第7276-7280页)；Livak et al.，1995，PCR Methods Appl.，4：357-62(Livak等人，《PCR方法应用》1995年第4期第357-362))。使用荧光团和非荧光淬灭物的实时分析中可用的探针和引物的例子包括(但不限于)分子信标(Tyagi et al.，1996，Nat.Biotechnol.，14：303-308(Tyagi等人，《自然生物技术》1996年第14期第303-308页)；Johansson et al.，2002，J.Am.Chem.Soc.，124：6950-6956(Johansson等人，《美国化学学会期刊》2002年第124期第6950-6956页))、蝎形引物(包括双蝎形引物)(Whitcombe等人，美国专利6,326,145；Whitcombe et al.，1999，Nat.Biotechnol.，17：804-817(Whitcombe等人，《自然生物技术》1999年第17期第804-817页))、amplifluor引物(Nazarenko et al.，1997，Nucl.Acids res.，25：2516-2521(Nazarenko等人，《核酸研究》1997年第25期第2516-2521页))、以及light-up探针(Svanvik et al.，2000，Anal.Biochem.，287：179-182(Svanvik等人，《生物化学年鉴》2000年第287期第179-182页))。

本发明的多核苷酸可存在于载体中。载体是复制的多核苷酸(例如，质粒、噬菌体或粘粒)，另一个多核苷酸可以连接到其上，以形成连接的多核苷酸的复制品。包含本发明的多核苷酸的载体的构造采用本领域已知的标准连接技术。参见例如Sambrook et al，MolecularCloning：A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989年)。载体可以提供进一步的克隆(扩增多核苷酸)(即克隆载体)或表达多核苷酸(即表达载体)。术语载体包括(但不限于)质粒载体和病毒载体。病毒载体的例子包括(例如)腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、以及疱疹病毒载体。通常，载体能够在细菌宿主(例如，大肠杆菌)内复制。优选地，载体为质粒。载体也可以包括vanA编码区(例如SEQ IDNO：7或其一部分，优选的是SEQ ID NO：7的从约648至约751的核苷酸)或vanB编码区(例如SEQ ID NO：8或其一部分，优选的是SEQ IDNO：8的从约492至约630的核苷酸)。这种载体可以用作(例如)对照靶多核苷酸。

载体的选择取决于在所得构造中的多种所需特性，例如，选择标记、载体复制速率等。用于克隆和表达本文所述载体的合适的宿主细胞为原核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌)。可以采用技术人员已知和常用的方法将载体引入宿主细胞。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、微脂粒感染、显微注射和病毒介导的核酸转移都是用于将核酸引入宿主细胞的常用方法。此外，可以将裸DNA直接导入细胞。

本发明的多核苷酸可以体外制备或体内制备。例如，用于体外合成的方法包括(但不限于)采用常规DNA/RNA合成仪的化学合成。用于此类合成的合成多核苷酸和试剂的供应商是人们所熟知的。用于体外合成的方法还包括(例如)在无细胞体系内使用环状或直链表达载体进行体外转录。表达载体也可用来在细胞内制备本发明的多核苷酸，然后将多核苷酸与细胞分离。

与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的一者或其片段所含的核苷酸序列相同或基本相同的多核苷酸可用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以检测肠球菌属的耐药原核微生物(以及属于肠球菌以外种属的微生物的基因编码同系物和直系同源物，这些同系物和直系同源物与该靶多核苷酸序列的序列相似性很高)特有的靶多核苷酸。通常，这些引物多核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的其中一种核苷酸序列具有至少约80％到至少约95％的同一性(如具有至少约80％的序列同一性、至少约85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性)。

与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中的一者或其片段所含的核苷酸序列相同或基本相同的多核苷酸可用作核酸检测反应(如杂交)的探针，以检测肠球菌属的耐药原核微生物(以及属于肠球菌以外种属的微生物的基因编码同系物和直系同源物，这些同系物和直系同源物与该靶多核苷酸序列的序列相似性很高)特有的靶多核苷酸。通常，这些探针多核苷酸与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中所示的其中一种核苷酸序列具有至少约80％到至少约95％的同一性(如具有至少约80％的序列同一性、至少约85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性)。

使用方法

本发明包括用于检测耐药原核微生物特有的多核苷酸的方法，该耐药原核微生物优选的是肠球菌属的细菌，例如，粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、鸡肠球菌、或坚韧肠球菌，更优选的是粪肠球菌或屎肠球菌，最优选的是粪肠球菌。耐药微生物的其他例子包括(但不限于)葡萄球菌属(例如，金黄色酿脓葡萄球菌)和链球菌属。如果样品来自于受试者，可利用该方法确定受试者是否感染了该耐药微生物。本发明此方面的方法通常包括用本发明的引物对接触靶多核苷酸，扩增多核苷酸，以及检测所得的扩增产物。

该方法所用的靶多核苷酸可以在样品中存在。样品可以为食物样品、饮料样品、发酵肉汤、法医样品、环境样品(如污垢、灰尘、垃圾、污水或水)或生物样品。优选地，样品为生物样品。“生物样品”是指可以从真核或原核源获得的样品。真核源的例子包括哺乳动物，例如人类或鼠科生物(诸如大鼠或小鼠之类的鼠科动物)。原核源的例子包括肠球菌以及含有内源或重组vanA或vanB编码区的其他微生物。

生物样品可以为(例如)单细胞形式、组织形式或流体形式。细胞或组织可以通过体外培养获得。如果来自于动物，则生物样品可得自(例如)肛门拭子、直肠周围拭子、粪便样品、血液和/或体液。在一些方面，生物样品得自疑似感染肠球菌的受试者。样品可以为分离的多核苷酸(例如本文所述载体中存在的多核苷酸)或使用下文所述方法分离的多核苷酸。

样品可以为溶解或分散在水或有机介质中的固体样品(如固体组织)，或者为从中将多核苷酸提取到水中或有机介质中的固体样品。例如，样品可以为器官均浆。因此，样品可以包括此前提取的多核苷酸。

在一些方面，样品可以用富集肉汤培养，以富集所存在的微生物(优选的是肠球菌)。通过在样品制备之前增加富集培养过程以提取扩增和检测所需的多核苷酸，可以提高样品对此类微生物的敏感性。利用样品材料(如生物样品)培养补充了一定浓度抗生素的适当介质/肉汤，这些抗生素可以杀死样品内的其他微生物，但又允许耐抗生素微生物增殖，然后将培养物在合适的温度(如37℃)下培养一段时间(例如，18至24小时)。优选地，抗生素为可以在(例如)4毫克/毫升(mg/ml)和8mg/ml之间的浓度下使用的万古霉素。在富集培养过程结束时，通过离心、过滤或其他合适的方法从培养物的一部分中收集含有所关注的微生物的样品，然后将其用于本发明涉及扩增和检测的方法中。

多核苷酸可以来自不纯净、部分纯净、或纯净的样品。初始样品的纯度并不重要，因为即使从纯度非常低的样品中也可以获得多核苷酸。例如，多核苷酸可以从生物流体(例如血液、唾液、粪便、或组织)的不纯净样品中获得。如果需要更高纯度样品，可以在实施本发明的方法之前按照本领域的技术人员已知的任何常规方法对样品进行处理。多核苷酸可以用下文所述的方法进行分离。

复杂的生物样品(粪便、血液、食物、组织、唾液等)可以包含固体碎屑和/或扩增抑制剂。固体碎屑一般通过沉淀或离心(将上清液与固体分离)、过滤等方式移除。扩增抑制剂一般通过用蛋白质变性剂或蛋白酶、稀释液等处理来移除。通过选择性裂解、差速离心、过滤等方法可以减少无用的含多核苷酸的细胞。

在扩增肠球菌属中存在的靶多核苷酸之前，可以从样品中移除特定微生物(优选的是肠球菌)。例如，可以将生物样品暴露在用介质官能化的基质中，该基质将与肠球菌相互作用，但不会与生物样品中存在的其他组分相互作用。通过包括弱相互作用(例如，范德瓦尔斯相互作用、静电相互作用、亲和结合或物理捕获)在内的多种机理可以可逆地保持相互作用。可用的介质的例子包括(但不限于)特异性相互作用(例如通过耐肠球菌抗体介导的相互作用)和非特异性相互作用。可用来介导与微生物的非特异性相互作用的试剂的例子包括二氧化硅、氧化锆、氧化铝小珠、金属胶体(例如金)和已经通过巯基化学物质(例如，Parthasarathy，提交于2007年4月25日的美国临时申请No.60/913,813，代理人案卷号62470US002)官能化的镀金薄板。

与肠球菌相互作用的试剂可存在于任何固相材料中。这些材料的例子包括聚烯烃、聚苯乙烯、尼龙、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多糖和氟化聚合物，以及树脂(例如琼脂糖、乳胶、纤维素和葡聚糖)。固体材料可以为任何形式，优选地为颗粒物质形式(如粒子、小珠、微珠、微球)或可以引入微流装置的任何其他形式(如原丝)(Parthasarathy，提交于2007年4月25日的美国临时申请No.60/913,813，代理人案卷号62470US002)。

在用于扩增反应之前，可以为扩增反应而制备样品(例如生物样品)中存在的多核苷酸。用于扩增反应的多核苷酸的制备方法是本领域所熟知的并且经常使用。多核苷酸可以从生物样品中提取。提取过程通常包括裂解微生物以释放多核苷酸。本文所述裂解是指细胞膜的物理破坏。提取可通过使用标准技术和试剂来实现。提取的例子包括(例如)煮制、蛋白酶水解、超声波照射、清洁剂、强碱、或有机溶剂(例如酚氯仿)(Lin等人，美国专利No.5,620,852；Kellogg等人，美国专利No.5,010,183)。多核苷酸可以在结合多核苷酸的适当条件下用粒子(例如磁性玻璃粒)制备，然后洗涤以除去杂质，之后通过设计用来移除结合的多核苷酸的洗涤步骤获得提纯的多核苷酸(MagNAPure，国际专利公开WO 01/37291A1)。

在本发明的方法中用作靶的多核苷酸可以具有任何分子量，并且可以为单链形式、双链形式、环状形式和质粒形式等。多种类型的多核苷酸可以彼此分离(如RNA与DNA分离，或双链DNA与单链DNA分离)。例如，本发明的方法中可以使用长度至少约100个碱基的多核苷酸，长度为1,000个碱基至10,000个碱基的较长分子多核苷酸，甚至多达约320万个碱基的高分子量核酸。

多核苷酸扩增(例如聚合酶链反应(PCR))是用于多核苷酸特定链段酶扩增的方法。扩增基于以下列基本步骤的反复循环：使双链多核苷酸变性，然后对靶多核苷酸进行引物退火，接着利用聚合酶进行引物延伸(Mullis等人，美国专利4,683,195；Mullis，美国专利4,683,202；以及Mullis等人，美国专利4,800,159)。引物设计用于使DNA的反向链退火，并且其所处位置使得一个引物的聚合酶催化的延伸产物可以用作另一个引物的模板链。扩增过程可以导致由引物5′端限定长度的离散多核苷酸片段进行指数增加。

一般来讲，这些步骤在循环步骤中实现。DNA扩增中使用的典型循环步骤涉及两个目标温度，从而实现变性、退火和延伸。第一温度是在预定目标变性温度基础上的增加，该温度应足够高，以便将双链靶多核苷酸分离为单链。一般来讲，循环步骤的目标变性温度为大约92℃至98℃(例如94℃至96℃)，并且反应在该温度下保持0秒至5分钟。然后使反应混合物的温度降至第二目标温度。第二目标温度使引物(以及探针(如果有))退火或与单链DNA杂交，并且利用DNA聚合酶促进延伸产物的合成。一般来讲，循环步骤的第二温度为大约57℃至63℃(例如59℃至61℃)，并且反应在该温度下保持0秒至1分钟。第二温度会根据所用的引物(以及探针(如果有))和靶多核苷酸而有很大不同。这样就完成了一个循环步骤。然后将反应混合物的温度升高至变性温度，以进行下一个循环。通常，通过重复循环过程可以得到所需结果，该结果可以是制备一定量的DNA和/或检测扩增产物。当用于检测时，循环步骤的次数将取决于样品的性质。例如，如果样品为多核苷酸的复杂混合物，可能需要更多的循环步骤，以将靶多核苷酸扩增到足以进行检测。一般来讲，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。技术人员应当理解，以上有关热循环反应的描述只是为了举例说明，因此温度、时间和循环次数可以根据热循环反应和应用的性质而变化。

可任选地，循环步骤中还可以使用第三温度。使用三个目标温度也会导致变性、退火和延伸，但变性、退火和延伸使用不同的目标温度。当使用三个目标温度时，根据应用情况，退火温度通常在从45℃至60℃的范围内。用于延伸的第三目标温度通常保持30秒至10分钟，并且处于退火温度和变性温度之间的温度范围。

本发明的方法和组合物中使用的DNA聚合酶能够按照本发明的方法影响引物的延伸。因此，优选的聚合酶是能够沿靶多核苷酸延伸引物的聚合酶。优选地，聚合酶具有热稳定性。热稳定聚合酶是在受热情况下保持稳定的聚合酶，即在足以使双链模板核酸变性的所需时间内经受高温时，聚合酶能够促进与模板互补的引物延伸产物的形成，并且不会发生不可逆的变性。可用的热稳定聚合酶是熟知的并且经常使用。人们已经从黄栖热菌、红色栖热菌、嗜热栖热菌、水生栖热菌、乳栖热菌、淡红栖热菌、嗜热酯肪芽孢杆菌和炽热甲烷嗜热菌中分离出热稳定聚合酶。

聚合酶通常在退火到靶多核苷酸的引物的3′端处引发合成，并且在5′方向沿靶多核苷酸进行合成。聚合酶可以具有5′至3′核酸外切酶活性，并且水解中间退火的探针(如果有)，以便释放探针的一部分，直至合成结束。具有5′至3′核酸外切酶活性的适当聚合酶的例子包括(例如)Tfi、Taq和FastStart Taq(Roche)。在其他方面，聚合酶具有很少或不具有5′至3′核酸外切酶活性，从而使引物降解、终止或引物延伸多核苷酸最小化。该核酸外切酶活性可以取决于多个因素，例如pH值、盐浓度、靶是否为双链或单链等等，所有这些因素都是本领域技术人员熟悉的。具有很少或不具有5′至3′核酸外切酶活性的适当聚合酶的例子包括Klentaq(Sigma，St.Louis，MO)。

通常，扩增涉及将一种或多种靶多核苷酸混合，这些靶多核苷酸可以具有不同序列，并且具有包含反应组分的“主混合物”，以便进行扩增反应并且使反应混合物处于允许靶多核苷酸扩增的温度条件下。主混合物内的反应组分可以包括用来调节反应混合物pH值的缓冲液、镁离子、用来提供扩增产物合成所需能量和核苷的一种或多种天然核苷酸(与腺嘌呤、胞核嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶相对应，常常以相同浓度存在)、与靶结合以有利于引发多核苷酸合成的引物对、将核苷酸添加到被合成的互补链上的聚合酶、以及可任选地一种或多种探针。本领域的技术人员将会认识到，虽然本发明的方法不要求使用靶多核苷酸，但在没有靶多核苷酸的情况下，扩增反应无法顺利进行。

可以检测是否存在扩增产物，并且可以测量扩增产物的量。可以通过本领域已知的常用标准方法检测扩增产物。检测可以在(例如)完成多个扩增循环之后进行，或在每个扩增循环过程中(通常称之为实时)进行。通过(例如)在凝胶上溶解扩增产物并确定是否存在所期望的扩增产物，可以很容易地在完成多个扩增循环之后检测扩增产物。为了有利于实时检测或量化扩增产物，可以对扩增反应中使用的一种或多种引物和/或探针进行标记，并且存在多种形式的标记可用于生成能够指示扩增产物是否存在的可检测信号。最方便的标记通常为荧光标记，该标记可以通过多种形式使用，包括(但不限于)使用供体荧光团标记、受体荧光团标记、荧光团、淬灭物、以及它们的组合。使用多种形式的分析类型可以包括使用被标记的一种或多种引物(例如，蝎形引物、amplifluor引物)、被标记的一种或多种探针(例如，相邻探针、Taqman探针、light-up探针、分子信标)、或它们的组合。技术人员将会理解，除了这些已知形式外，通常也公开了新的标记形式。本发明并不局限于用于检测扩增产物的方法的类型或探针和/或引物的类型。通过使用合适的标记(例如，不同的荧光团)，可以将若干不同引物对(以及可任选的探针(如果有))在单个反应中的结果组合(叠加)在一起。

作为使用被标记的引物和/或探针进行检测的替代方法，可以使用多核苷酸结合染料(例如荧光DNA结合染料)来检测扩增产物。这样的例子包括(例如)SYBRGreen或SYBRGold(Molecular Probes)。与双链扩增产物相互作用之后，这类多核苷酸结合染料在用适当波长的光激发后会发出荧光信号。还可以使用诸如多核苷酸插入染料之类的多核苷酸结合染料。

当扩增反应进行时，可以添加对照物。使用(例如)对照引物和对照探针可以从阳性对照样品(如，除vanA或vanB之外的靶多核苷酸)扩增对照靶多核苷酸。阳性对照样品还可以用于扩增靶vanA或vanB多核苷酸。这类对照物可以内部扩增(例如，在每个扩增反应内)或在与受试者样品并排运行的单独样品内扩增。每次运行也可以包括(例如)缺少靶vanA或vanB多核苷酸的阴性对照物。

应当理解，本发明并不局限于用来进行扩增和检测扩增产物的装置。例如，合适的装置可以包括常规扩增装置，例如Lightcycler

实时PCR系统(Lightcycler

Real-Time PCR System(Roche))(犹他大学研究基金会，国际专利公开No.WO 97/46707、WO 97/46714和WO97/46712)、MX3005p(Stratagene，La Jolla，CA)、以及可得自Bio-Rad的扩增装置。优选地，本发明可以结合微流装置进行。“微流装置”是指这样的装置：该装置的一个或多个流体通道、室或导管具有至少一个小于500μm，并且通常在0.1μm和500μm之间的内部横截面尺寸(如深度、宽度、长度、直径等)。通常，微流装置包括多个室(如扩增反应室、加料室等)，每个室都限定了用于容纳样品的一定体积。可能适合的微流装置的一些例子在下列文献中有所描述：美国专利申请公开No.2002/0064885(Bedingham等人)；US2002/0048533(Bedingham等人)；US2002/0047003(Bedingham等人)；和US2003/138779(Parthasarathy等人)；以及美国专利No.6,627,159(Bedingham等人)；6,720,187(Bedingham等人)；6,734,401(Bedingham等人)；6,814,935(Harms等人)；6,987,253(Bedingham等人)；7,026,168(Bedingham等人)；和7,164,107(Bedingham等人)。

本发明还包括用于分离(优选地提纯)多核苷酸的方法。本发明在这方面的方法通常包括提供包含单链多核苷酸的混合物，在适于寡核苷酸特异性杂交至单链多核苷酸以形成杂交体的条件下，将混合物暴露于本发明的寡核苷酸中，以及将杂交体与未杂交的单链多核苷酸分离。在扩增耐药肠球菌中存在的靶多核苷酸之前，可以用该方法制备样品。

混合物可以得自样品，优选地为生物样品。通常，样品可以包含耐药微生物，优选地为肠球菌。可以按照上述提取方法制备要分离的样品。混合物内的多核苷酸可以不纯净(例如，存在其他多孔材料和/或固体碎屑)、部分纯净或经过提纯。混合物内的多核苷酸可以通过已知的常规方法变性。这类方法的例子包括(例如)加热或暴露在碱性环境中。

在适于寡核苷酸和互补的单链多核苷酸特异性杂交的条件下将单链多核苷酸的混合物暴露在本发明的寡核苷酸中。寡核苷酸通常包含标记，优选的是亲和标记。尤其可用的常规杂交形式包括将寡核苷酸固定在固体载体(固相杂交)上的形式和多核苷酸(单链多核苷酸和寡核苷酸)均处于溶液中(溶液杂交)的形式。

在固相杂交形式中，寡核苷酸通常在杂交前连接至固相材料上。在溶液杂交形式中，寡核苷酸通常在杂交后连接至固相材料上。在两种形式中，连接通过连接到寡核苷酸的标记(优选地为亲和标记)介导。可用的固相材料的例子包括(例如)聚烯烃、聚苯乙烯、尼龙、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多糖和氟化聚合物、以及树脂(例如琼脂糖、乳胶、纤维素和葡聚糖)。固体材料可以为任何形式，优选地为颗粒物质形式(如粒子、小珠、微珠、微球)或可以引入微流装置的任何其他形式(如原丝)(Parthasarathy，提交于2007年4月25日的美国临时申请No.60/913,813，代理人案卷号62470US002)。

杂交在适当的条件下(如严格的杂交条件)进行，在该条件下可以将被标记的寡核苷酸选择性地结合到混合物中存在的基本上互补(优选地为互补)的单链多核苷酸上。用于杂交反应和探针合成的一般方法在T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory，1982(T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆，Cold Spring Harbor Laboratory，1982年)中有所公开。优选地，杂交条件包括使用杂交缓冲液(例如，6x SSC、5x Denhardt试剂，0.5％(w/v)SDS)和封闭剂(例如100μg/ml鲑鱼精)。杂交可以在68℃下进行至少2小时。杂交(以及连接被标记的寡核苷酸(如果有))之后，可以于室温下在含有2x SSC和0.5％SDS的溶液中洗涤多次，以除去未杂交的多核苷酸和可能存在的任何其他材料。可任选地，可以通过下列方式提纯分离的多核苷酸：使杂交体变性以释放分离的多肽，并且移除结合的寡核苷酸和固体载体。

试剂盒

本发明提供了试剂盒，该试剂盒可以包括本发明的寡核苷酸，例如引物对和(可任选地)探针。本发明的试剂盒内可以包括的其他组分包括常规试剂，例如，主混合物、固相载体、杂交溶液、外部阳性或阴性对照物等。

试剂盒通常包括包装材料，即用来容纳试剂盒的内容物的一个或多个物理结构。包装材料可以通过熟知的方法构造，优选地提供无菌、无污染物的环境。包装材料可以具有表明试剂盒内容物的标记。此外，试剂盒具有说明书，以描述试剂盒内的材料的使用方法。如本文所用，术语“包装”是指固体基体或材料，例如玻璃、塑料、纸张、包装箔等。

“说明书”通常具有明确的表述，说明本发明的多种方法，包括样品制备条件、扩增条件等等。

本发明通过以下实例进行说明。应当理解，具体的实例、材料、数量和步骤应结合本文所述的本发明的范围和精神进行广义地解释。

实例

实例1

利用特定基因的引物和探针检测核酸样品中的vanA和vanB基因

用于辨识耐糖肽基因的基于核酸的检测方法可以在分析中使用，以判断样品是否包含在用糖肽抗生素处理之后能够存活的微生物。在该实例中，利用引物和探针检测屎肠球菌(ATCC 700221，Manassas VA)和粪肠球菌(ATCC 700802，Manassas VA)(也称为耐万古霉素肠球菌(VRE))中的vanA和vanB基因。

将VRE划线培养在血液琼脂介质上，并且在37℃下培养20小时。通过在TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)内稀释新生物制备细胞悬浮液，悬浮液的浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于大约1×10⁸菌落形成单位/毫升(CFU/mL)。按照制造商说明，使用MagNA PureLC DNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(MagNA Pure LC DNA IsolationKit III(Bacteria，Fungi))套装在MagNA Pure LC系统上提取和分离一百微升该细胞悬浮液(仪器和试剂可得自Roche，Indianapolis，IN)。

引物和探针由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成。分别使用6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE)和BHQ(黑洞淬灭物，Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)在5′-和3′-位置双重标记vanA探针序列5′ACTGCAGCCTGATTTGGTCCACCTCGCCA(SEQ ID NO：3)。分别使用6-羧基荧光素(FAM)和BHQ在5′-和3′-位置双重标记vanB探针序列5′TCCCATGACCGCGCAGCCGACCTCA(SEQ ID NO：6)。引物和探针序列在表1中列出。

利用下列优化浓度的引物、探针和酶以及热循环方案对每个样品进行有关vanA和vanB基因的实时PCR扩增。PCR扩增在10μL的总容积内进行，其中包含5微升(μL)样品和5μL下列混合物：两种引物(均为10微摩尔/升(μM)、0.5μL)、探针(2μM、1μL)、MgCl₂(25mM、2μL)和LightCycler

DNA Master杂交探针(LightCycler

DNA MasterHybridization Probe)(1μL 10x，Roche(Indianapolis，IN))。扩增按照下列方案在LightCycler

2.0实时PCR系统(LightCycler

2.0 Real-TimePCR System)(Roche)上进行：95℃下持续30秒(变性)；95℃下持续0秒的45次PCR循环(20℃/s的斜率)，60℃下持续20秒(20℃/s的斜率，单次采集)。

使用配备了Roche LightCycler2.0实时PCR系统的软件对结果进行分析。如表2和3所示，引物在本实例所提供的条件下成功地扩增了vanA和vanB基因。

表2：对VRE(屎肠球菌)(ATCC 700221)DNA中的vanA进行实时PCR扩增，利用MagNA Pure System进行纯化，并在TE缓冲液中连续稀释。利用5μL的每种样品进行两次实时PCR。

1.Ct，循环阈值。

以上结果表明，利用SEQ ID NO：1、2和3的引物和探针可以成功地扩增和检测vanA基因。

表3：对VRE(粪肠球菌)(ATCC 700802)DNA中的vanB进行实时PCR扩增，利用MagNA Pure System进行纯化，并在TE缓冲液中连续稀释。利用5μL的每种样品进行两次实时PCR。

1.Ct，循环阈值。

上述结果表明，利用SEQ ID 4-6可以成功地扩增和检测vanB基因。

对肠球菌的若干参照菌株进行测试，以确定其已知的耐万古霉素特征是否与细菌染色体中vanA或vanB基因的存在有关。具体地讲，将购自American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas，VA)的肠球菌分离物划线培养在血液琼脂介质上，并且在37℃下培养20小时。通过在TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)内稀释新生物制备细胞悬浮液，悬浮液的浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于大约1×10⁸CFU/mL。按照制造商说明，使用MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III(Bacteria，Fungi))套装在MagNA Pure LC系统上提取和分离一百微升该细胞悬浮液(仪器和试剂可得自Roche，Indianapolis，IN)。

利用下列优化浓度的引物、探针和酶以及热循环方案对每个样品进行有关vanA和vanB基因的实时PCR扩增。PCR扩增在10μL的总容积内进行，其中包含5μL样品和5μL下列混合物：两种引物(均为10μM、0.5μL)、探针(2μM、1μL)、MgCl₂(25mM、2μL)和LightCycler

DNA Master杂交探针(LightCycler

DNA Master Hybridization Probe)(1μL 10x，Roche(Indianapolis，IN))。扩增按照下列方案在LightCycler2.0实时PCR系统(LightCycler

2.0 Real-Time PCR System)(Roche)上进行：95℃下持续30秒(变性)；95℃下持续0秒的45次PCR循环(20℃/s的斜率)，60℃下持续20秒(20℃/s的斜率，单次采集)。结果见表4。

表4：多种肠球菌菌株内vanA和vanB基因的存在。菌株用其ATCC 名称表示。所列耐药性由ATCC提供。耐万古霉素基因型一列显示了通过实时PCR扩增确定的vanA或vanB基因是否存在或者均不存在 (无)。

种类	菌株	耐药性	耐万古霉素基因型
				ATCC 51559	屎肠球菌；菌株MMC4	氨苄青霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平、替考拉宁、万古霉素	VanA
ATCC 51575	粪肠球菌	庆大霉素、链霉素、万古霉素	VanB
				ATCC 700802	粪肠球菌	庆大霉素、万古霉素和替考拉宁	VanB
ATCC 700221	屎肠球菌	万古霉素	VanA
				ATCC 43076	解糖肠球菌	N/A	无
ATCC 11576	坚韧肠球菌	N/A	无
				ATCC 29212	粪肠球菌	N/A	无
ATCC 14506	粪肠球菌	N/A	无
				ATCC 49032	屎肠球菌	N/A	无
ATCC 27270	屎肠球菌	N/A	无
				ATCC 49533	粪肠球菌	链霉素	无
ATCC 7080	粪肠球菌	N/A	无
				ATCC 19433	粪肠球菌	N/A	无
ATCC 49452	粪肠球菌	N/A	无
				ATCC 49532	粪肠球菌	庆大霉素	无
ATCC 33186	粪肠球菌	N/A	无
				ATCC 51299	粪肠球菌	万古霉素(低耐药性)	VanB
ATCC 35667	屎肠球菌	N/A	无
				ATCC 6569	屎肠球菌	N/A	无

上述结果表明，SEQ ID 1-6对于肠球菌染色体内的vanA和vanB基因具有特异性，并且不会杂交至非vanA或vanB序列。

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子版资料(包括(例如)在如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交物；在如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交物；以及来自GenBank和RefSeq的带注释编码区的翻译内容)的完整公开内容均以引用方式并入本文。当本专利申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文件中的公开内容存在不一致时，应以本专利申请的公开内容为准。上述详细说明和实例仅为了清晰理解而示出。而不应将其理解为任何不必要的限制。本发明不应限于所示出和描述的具体细节，因为对于本领域的技术人员显而易见的变型形式将包括在权利要求所限定的本发明内。

除非具体说明，否则所有标题均是为了便于读者理解，并且不应用于限制标题下面的文字的含义。

序列表

<110>3M创新有限公司

<120>用于检测耐药微生物的方法(METHODS FOR DETECTING DRUG RESISTANT MICROBES)

<130>SCT100558-10

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>1

ttgtgcggta ttgggaaaca gtg 23

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>2

tttccggctc gacttcctga tgaata 26

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>3

actgcagcct gatttggtcc acctcgcca 29

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>4

agaagcagca ggacaatatg atgga 25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>5

gataccgtgg ctcaaccgga ttt 23

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>primer sequence

<400>6

tcccatgacc gcgcagccga cctca 25

<210>7

<211>1032

<212>DNA

<213>Enterococcus faecalis

<400>7

atgaatagaa taaaagttgc aatactgttt gggggttgct cagaggagca tgacgtatcg 60

gtaaaatctg caatagagat agccgctaac attaataaag aaaaatacga gccgttatac 120

attggaatta cgaaatctgg tgtatggaaa atgtgcgaaa aaccttgcgc ggaatgggaa 180

aacgacaatt gctattcagc tgtactctcg ccggataaaa aaatgcacgg attacttgtt 240

aaaaagaacc atgaatatga aatcaaccat gttgatgtag cattttcagc tttgcatggc 300

aagtcaggtg aagatggatc catacaaggt ctgtttgaat tgtccggtat cccttttgta 360

ggctgcgata ttcaaagctc agcaatttgt atggacaaat cgttgacata catcgttgcg 420

aaaaatgctg ggatagctac tcccgccttt tgggttatta ataaagatga taggccggtg 480

gcagctacgt ttacctatcc tgtttttgtt aagccggcgc gttcaggctc atccttcggt 540

gtgaaaaaag tcaatagcgc ggacgaattg gactacgcaa ttgaatcggc aagacaatat 600

gacagcaaaa tcttaattga gcaggctgtt tcgggctgtg aggtcggttg tgcggtattg 660

ggaaacagtg ccgcgttagt tgttggcgag gtggaccaaa tcaggctgca gtacggaatc 720

tttcgtattc atcaggaagt cgagccggaa aaaggctctg aaaacgcagt tataaccgtt 780

cccgcagacc tttcagcaga ggagcgagga cggatacagg aaacggcaaa aaaaatatat 840

aaagcgctcg gctgtagagg tctagcccgt gtggatatgt ttttacaaga taacggccgc 900

attgtactga acgaagtcaa tactctgccc ggtttcacgt catacagtcg ttatccccgt 960

atgatggccg ctgcaggtat tgcacttccc gaactgattg accgcttgat cgtattagcg 1020

ttaaaggggt ga 1032

<210>8

<211>732

<212>DNA

<213>Enterococcus faecalis

<400>8

aacattaata ctgaaaaatt cgatccgcac tacatcggaa ttacaaaaaa cggcgtatgg 60

aagctatgca agaagccatg tacggaatgg gaagccgata gtctccccgc catattctcc 120

ccggatagga aaacgcatgg tctgcttgtc atgaaagaaa gagaatacga aactcggcgt 180

attgacgtgg ctttcccggt tttgcatggc aaatgcgggg aggatggtgc gatacagggt 240

ctgtttgaat tgtctggtat cccctatgta ggctgcgata ttcaaagctc cgcagcttgc 300

atggacaaat cactggccta cattcttaca aaaaatgcgg gcatcgccgt ccccgaattt 360

caaatgattg aaaaaggtga caaaccggag gcgaggacgc ttacctaccc tgtctttgtg 420

aagccggcac ggtcaggttc gtcctttggc gtaaccaaag taaacagtac ggaagaacta 480

aacgctgcga tagaagcagc aggacaatat gatggaaaaa tcttaattga gcaagcgatt 540

tcgggctgtg aggtcggctg cgcggtcatg ggaaacgagg atgatttgat tgtcggcgaa 600

gtggatcaaa tccggttgag ccacggtatc ttccgcatcc atcaggaaaa cgagccggaa 660

aaaggctcag agaatgcgat gattatcgtt ccagcagaca ttccggtcga ggaacgaaat 720

cgggtgcaag aa 732

Claims

1.一种用于在生物样品内检测耐药微生物的方法，包括：

扩增生物样品内存在的靶多核苷酸以生成扩增产物，其中所述靶多核苷酸与所述耐药微生物对万古霉素的耐药性相关，其中扩增包括至少一个循环步骤，其中循环步骤包括在合适条件下使所述生物样品与第一引物和第二引物接触以生成所述扩增产物，并且在合适条件下使所述扩增产物与探针接触，以使所述探针与所述扩增产物杂交，并且其中所述探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃；以及

检测所述扩增产物，其中所述扩增产物的存在表明所述生物样品内存在耐药微生物。

2.一种用于在生物样品内检测耐药微生物的方法，包括：

扩增生物样品内存在的靶多核苷酸以生成扩增产物，其中使所述生物样品在合适条件下与第一vanA引物和第二vanA引物接触以生成扩增产物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751；以及

3.一种用于在生物样品内检测耐药微生物的方法，包括：

扩增生物样品内存在的靶多核苷酸以生成扩增产物，其中使所述生物样品在合适条件下与第一vanB引物和第二vanB引物接触以生成扩增产物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630；以及

4.一种用于检测生物样品内不存在耐药微生物的方法，包括：

使生物样品与探针、第一引物和第二引物接触以形成混合物，其中所述引物能够扩增与微生物对万古霉素的耐药性相关的靶多核苷酸，其中所述探针将与所述靶多核苷酸杂交，并且其中所述探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃；

如果所述生物样品内存在与耐药性相关的所述靶多核苷酸，则将所述混合物暴露于适于形成扩增产物的条件下；以及

检测不存在所述扩增产物，其中不存在所述扩增产物表明所述生物样品内不存在耐药微生物。

5.一种用于检测生物样品内不存在耐药微生物的方法，包括：

使生物样品与第一vanA引物和第二vanA引物接触以形成混合物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751；

如果所述生物样品内存在vanA多核苷酸，则将所述混合物暴露于适于形成扩增产物的条件下；以及

6.一种用于检测生物样品内不存在耐药微生物的方法，包括：

使生物样品与第一vanB引物和第二vanB引物接触以形成混合物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630；

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述微生物为肠球菌属(Enterococcus)的成员。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述肠球菌属的所述成员为粪肠球菌(E.faecalis)。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸为vanA多核苷酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一引物包含与SEQID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一引物包含SEQ IDNO：1，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：2。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述探针包含与SEQ IDNO：3具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且杂交至SEQ IDNO：7。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸为vanB多核苷酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一引物包含与SEQID NO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一引物包含SEQ IDNO：4，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：5。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述探针包含与SEQ IDNO：6具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且杂交至SEQ IDNO：8。

17.根据权利要求1或4所述的方法，还包括第二探针，其中所述第二探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃。

18.根据权利要求17所述的方法，其中一个探针包含供体荧光团，所述第二探针包含受体荧光团。

19.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述生物样品来自疑似感染耐药微生物的个体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物样品包括粪便物。

21.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，还包括获得所述生物样品。

22.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述检测是在每个循环步骤之后进行。

23.根据权利要求2、4或10所述的方法，其中所述第一vanA引物包含SEQ ID NO：1，并且所述第二vanA引物包含SEQ ID NO：2。

24.根据权利要求3、6或14所述的方法，其中所述第一vanB引物包含SEQ ID NO：4，并且所述第二vanB引物包含SEQ ID NO：5。

25.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述扩增还包括使所述生物样品与探针接触，其中所述探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃。

26.根据权利要求5所述的方法，其中所述扩增还包括使所述生物样品与探针接触以形成混合物，所述混合物包含所述第一vanA引物、所述第二vanA引物和所述探针，其中所述探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃。

27.根据权利要求6所述的方法，其中所述扩增还包括使所述生物样品与探针接触以形成混合物，所述混合物包含所述第一vanB引物、所述第二vanB引物和所述探针，其中所述探针的T_M比所述第一引物和所述第二引物的T_M高至少8℃。

28.根据权利要求1、4、25、26或27所述的方法，其中所述探针包含荧光团和淬灭物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述检测包括检测荧光团。

30.根据权利要求1、4、25、26或27所述的方法，其中所述扩增包括含有5′至3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

31.一种分离多核苷酸的方法，包括：

提供包含单链多核苷酸的混合物；

在适于使所述寡核苷酸特异性杂交至单链多核苷酸的条件下，将所述混合物暴露于寡核苷酸，从而生成杂交体，其中所述寡核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：与SEQ ID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：3具有至少约80％的同一性的核苷酸序列、与SEQ IDNO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列、或与SEQ ID NO：6具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且其中所述寡核苷酸包含亲和标记；以及

洗涤所述杂交体。

32.根据权利要求31所述的方法，还包括在所述暴露后使所述寡核苷酸连接至固相材料。

33.根据权利要求31所述的方法，其中在所述暴露前使所述寡核苷酸连接至固相材料。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述混合物得自生物样品。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述生物样品包括粪便物。

36.一种试剂盒，包括包装材料、第一vanA引物、第二vanA引物和探针，其中所述探针的T_M比所述第一和第二vanA引物的T_M高至少8℃。

37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述探针包含与SEQ IDNO：3具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且杂交至SEQ IDNO：7。

38.一种试剂盒，包括包装材料、第一vanB引物、第二vanB引物和探针，其中所述探针的T_M比所述第一和第二vanB引物的T_M高至少8℃。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述探针包含与SEQ IDNO：6具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且杂交至SEQ IDNO：8。

40.根据权利要求36或38所述的试剂盒，其中所述探针包含荧光团和淬灭物。

41.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述第一引物包含SEQID NO：1，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：2。

42.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述第一引物包含SEQID NO：4，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：5。

43.一种试剂盒，包括包装材料、第一vanA引物和第二vanA引物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：7的核苷酸648-751。

44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述第一引物包含SEQID NO：1，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：2。

45.一种试剂盒，包括包装材料、第一vanB引物和第二vanB引物，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，并且所述第二引物包含与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述引物对扩增SEQ ID NO：8的核苷酸492-630。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述第一引物包含SEQID NO：4，并且所述第二引物包含SEQ ID NO：5。

47.一种分离的多核苷酸，包含与SEQ ID NO：1具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：2一起使用时扩增包含SEQ ID NO：7的核苷酸648-751的多核苷酸。

48.一种分离的多核苷酸，包含与SEQ ID NO：2具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：1一起使用时扩增包含SEQ ID NO：7的核苷酸648-751的多核苷酸。

49.一种分离的多核苷酸，包含与SEQ ID NO：4具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：5一起使用时扩增包含SEQ ID NO：8的核苷酸492-630的多核苷酸，从而生成约139个核苷酸的扩增产物。

50.一种分离的多核苷酸，包含与SEQ ID NO：5具有至少约80％的同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸在与SEQ ID NO：4一起使用时扩增包含SEQ ID NO：8的核苷酸492-630的多核苷酸。