JP5156726B2 - ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および区別 - Google Patents
ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および区別 Download PDFInfo
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Description
表1:配列表。
表2:プライマー対。
表3:プローブの組。
表4:スタフィロコッカス(Staphylococcus)種
・第1に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および/またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第2に、また必要であれば、核酸が存在するならば、以下に特定するように、1つもしくは別の標的増幅システムで増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。しかし、いくつかのサンプル、またはいくつかの高感度シグナル増幅システムでは、増幅は必要ないかもしれない。
・第3に、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物をプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、簡便かつ互換性の検出システムを使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、1種もしくは数種のスタフィロコッカス(Staphylococcus)種の有無を推測することができる。
(i)必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および/または濃縮する工程、
(ii)必要であれば、少なくとも1つの適切なプライマー対で、16S〜23S rRNAスペーサー領域、または標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程、
(iii)工程(i)または(ii)のポリ核酸と、標的配列(ここで、標的配列は、配列番号1もしくは2またはその相同物よりなる)、あるいはそれらのRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、あるいはそれらの相補形態、あるいはその少なくとも20連続ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程、
(iv)形成されたハイブリッドを検出する工程、ならびに
(v)得られるシグナルを解釈し、スタフィロコッカス(Staphylococcus)種の存在を推論し、および/またはサンプル中のスタフィロコッカス(Staphylococcus)種を同定する工程、
を含んでなる。
(i)必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および/または濃縮する工程、
(ii)少なくとも1つの適切なプライマー対で、16S〜23S rRNAスペーサー領域、または標的配列、または標的配列を含んでなるスペーサーの部分、または標的配列の部分を増幅する工程、
(iii)ポリ核酸と標的配列にハイブリダイズする少なくとも2つのハイブプローブ(HybProbe)の少なくとも1つの組とをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、標的配列は、配列番号1もしくは2、または前記配列番号のRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、または前記配列番号の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも20連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる上記工程、
(iv)工程(iii)において形成されたハイブリッドを検出する工程、
(v)工程(iv)において得られる特異なハイブリダイゼーションシグナルから、スタフィロコッカス(Staphylococcus)種の存在を推論し、またはサンプル中のスタフィロコッカス(Staphylococcus)種を同定する工程、
を含んでなる。
(i)必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および/または濃縮する工程、
(ii)標識されたプライマー対で、標的配列、またはその部分を増幅する工程、
(iii)ポリ核酸と、間に25未満のヌクレオチドを伴って前記標識されたプライマーに隣接する、配列番号1、または前記配列番号1のRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、または前記配列番号1の相補形態、あるいは任意の相補物、あるいはその少なくとも20連続ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする少なくとも1つのハイブプローブ(HybProbe)とをハイブリダイズさせる工程、
(iv)形成されたハイブリッドを検出する工程、
(v)工程(iv)において得られるシグナルから、スタフィロコッカス(Staphylococcus)種の存在を推論し、および/またはサンプル中のスタフィロコッカス(Staphylococcus)種を同定する工程、
を含んでなる。
・第1に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および/またはハイブリダイゼーションに利用可能な状態にする。
・第2に、存在するならば、核酸を、以下に記載のように、1つもしくは別の標的増幅システムで増幅させる。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するのに必要である。
・第3に、終局的に、変性工程後、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物を、目的の生物体の検出を可能にする1つもしくはそれ以上のプローブ(DNA−、RNA−、変性もしくは修飾されたプローブ)が固定化されたLiPAストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、終局的に洗浄工程を実施した後、簡便かつ互換性の検出システムを使用してハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特定の生物学的サンプルにおいてスクリーニングされた1種もしくは数種の生物体の有無を推測することができる。
(i)必要であれば、サンプル中に存在するポリ核酸を遊離、単離および/または濃縮する工程、
(ii)必要であれば、少なくとも1つの適切なプライマー対で、16S〜23S rRNAスペーサー領域、またはその部分を増幅する工程、
(iii)ポリ核酸と、配列番号1もしくは2、または前記配列番号1もしくは2のRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、または前記配列番号の相補形態、あるいは任意の相同物、あるいはその少なくとも20連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも1つのプローブとをハイブリダイズさせる工程、
(iv)工程(iii)において形成されたハイブリッドを検出する工程、
(v)工程(iv)において得られる異なるハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中に存在する微生物を同定する工程、
を含んでなる。
・配列番号1もしくは2よりなる標的配列、前記配列番号1もしくは2のRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、前記配列番号1もしくは2の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする少なくとも1つのポリヌクレオチド、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
・25ヌクレオチド未満、好ましくは、5ヌクレオチド未満で相互に隣接する、配列番号1もしくは2よりなる標的配列、前記配列番号1もしくは2のRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、前記配列番号1もしくは2の相補形態、またはそれらのいずれかの相同物にハイブリダイズする2つのハイブプローブ(HybProbe)の少なくとも1つの組、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる。
1/.純培養物由来のDNA
純培養物由来のDNAを調製するために、異なる精製方法を使用することができる。
・リソスタフィン(5μg/μl)で1時間、37℃での溶解およびQIAamp血液DNA単離キット(キアゲン(Qiagen))による精製
・ピッチャー(Pitcher)らの方法(1989)
・MagNAPure器具上のMagNAPure LC DNA単離キットIII(細菌、真菌)。LBプレートまたはスラント上O/Nで増殖させた細菌細胞を、−20℃での保存のために100〜1000μl TE pH8に懸濁させた。製造者の推奨に従って、2μl〜20μlを抽出のために使用した。
・QIAamp DNAミニキット(カタログ番号51306−キアゲン(QIAGEN))。リゾチームおよびリソスタフィンを使用して、培養物を酵素的に前処置した。
血液サンプルを通気血液培養ボトル(BacT/ALERT FA)に播種し、BacT/Alert 3Dシステム(オルガノン・テクニカ(Organon Teknika))中、37℃、陽性になるまでインキュベートした。暗緑色から黄色への色の変化によって、陽性をモニターした。
キットLC−ファストスタート(LC−FastStart)DNAマスター(Master)ハイブリダイゼーションプローブ(カタログ番号3003248または2239272)の製造者の指示に従って、
・精製、濃縮、および阻害剤の非存在について、PCRに適切な任意のサンプル材料を使用することができる、
・プライマーは、それぞれ0.3〜1μMの最終濃度であるべきである、
・それぞれ0.2μM、または2倍の最終濃度のハイブプローブ(HybProbe)、
・MgCl2の濃度は最適化されるべきであり、1〜5mMに変動し得る、
・そして、陰性コントロールを稼動させるべきである。
1/包括性
試験したすべてのS.アウレウス(S.aureus)単離物(n=63)を首尾よく増幅(Ct範囲17.25〜33.51)し、どのような地理的または種由来についても53.13℃±0.52℃の平均Tmを有する1つの均質な融解ピークを得た。
50を超える異なる細菌種について試験し(マイコバクテリア(Mycobacteria)、シュードモナス(Pseudomonas)、連鎖球菌(Streptococci)など)、また若干の真菌についても試験した。試験した生物体のうち、アッセイにより定量曲線または融解ピークを作成したものは認められなかった。
調査したすべてのS.アウレウス(S.aureus)単離物が検出され(100%の感受性)、研究した他のすべての単離物から明白に識別することができた。
患者サンプルと共に播種された合計で16個の陽性血液培養ボトルのアリコートについて試験した。
S.エピダーミディス(S.epidermidis)およびS.ハエモリティカス(S.haemolyticus)以外の合計で51株のCoNS株について研究した。結果を以下の表にまとめる。
Claims (5)
- スタフィロコッカス・アウレウスの検出および/または同定のための2つのポリヌクレオチドプローブの組であって、前記2つのプローブは、配列番号1もしくは配列番号2、あるいはそれらのRNA形態(ここで、TはUによって置き換えられる)、あるいはそれらの相補形態に特異的にハイブリダイズし、ここで、前記2つのプローブ間には25以下のヌクレオチドが存在し、配列番号15および20、または配列番号15および21、または配列番号17および16、または配列番号17および19、または配列番号27および28、または配列番号29および22、または配列番号30および18からなる、2つのポリヌクレオチドプローブの組。
- 請求項1に記載の2つのポリヌクレオチドプローブの組を含んでなる組成物。
- (i)サンプル由来のポリ核酸と、少なくとも1つの請求項1に記載の2つのポリヌクレオチドプローブの組とをハイブリダイズさせる工程、
(ii)形成されたハイブリッドを、融解曲線解析を実施することによって検出する工程、ならびに
(iii)得られるシグナルを解釈し、スタフィロコッカス・アウレウスの存在を推論し、サンプル中のスタフィロコッカス・アウレウスを同定する工程、
を含んでなる、サンプル中のスタフィロコッカス・アウレウスの検出および/または同定のための方法。 - (i)サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および/または濃縮する工程、
(ii)配列番号61および58、ならびに配列番号68および58からなる群から選択される順方向プライマーポリヌクレオチドおよび逆方向プライマーポリヌクレオチドの任意の組み合わせよりなる少なくとも1つの適切なプライマー対で、16S〜23S rRNAスペーサー領域、または標的配列を含んでなるフラグメント、または標的配列もしくはそのフラグメントを増幅する工程、
(iii)工程(i)または(ii)のポリ核酸と、少なくとも1つの請求項1に記載の2つのポリヌクレオチドプローブの組とをハイブリダイズさせる工程、
(iv)形成されたハイブリッドを、融解曲線解析を実施することによって検出する工程、ならびに
(v)得られるシグナルを解釈し、スタフィロコッカス・アウレウスの存在を推論し、サンプル中のスタフィロコッカス・アウレウスを同定する工程、
を含んでなる、サンプル中のスタフィロコッカス・アウレウスの検出および/または同定のための方法。 - 以下の成分:
・少なくとも1つの請求項1に記載の2つのポリヌクレオチドプローブの組、
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分
を含んでなる、スタフィロコッカス・アウレウスの検出および/または同定のためのキット。
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