CN115427567A - 判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针 - Google Patents

判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针 Download PDF

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Abstract

本发明的一个以上实施方式提供用于在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中判定erm(41)基因的单碱基突变的新方法。本发明的一个以上实施方式涉及一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中相当于erm(41)基因的第28位的碱基的方法，该方法包括：在判定对象的抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，上述指标碱基序列存在表明上述碱基为胞嘧啶，上述指标碱基序列不存在表明上述碱基为胸腺嘧啶。

Description

判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单 碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针
技术领域
本发明涉及判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针。另外，本发明涉及判断抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针。
背景技术
抗酸菌为抗酸性、非运动性的革兰氏阳性杆菌。抗酸菌大致分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculousmycobacteria；NTM)这2种。
目前，非结核分枝杆菌已报告了170种以上的菌种，已知其中30种左右对人显示出致病性。
在非结核分枝杆菌病中，对于脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacteroides abscessuscomplex)症而言，现有的抗菌药物难以起效，尚未建立有效的治疗方法，因此，患者人数增加，重症病例也在增加。作为病原菌群的脓肿分枝杆菌复合群包括：脓肿分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacteroides abscessus subsp.abscessus)、脓肿分枝杆菌马赛亚种(Mycobacteroides abscessus subsp.massiliense)、以及脓肿分枝杆菌博莱亚种(Mycobacteroides abscessus subsp.bolletii)这3个亚种。需要说明的是，脓肿分枝杆菌(Mycobacteroides abscessus)有时也称为脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)。
在专利文献1中，为了判断脓肿分枝杆菌复合群的上述3个亚种，公开了一种包含第1引物和第2引物的引物组，所述第1引物是以3个亚种中共通的膜转运体基因的下游区域作为靶点并且设计为各亚种的扩增产物的大小不同，所述第2引物是3个亚种中共通的ATP结合盒转运体基因的下游区域作为靶点并且设计为各亚种的扩增产物的大小不同。
在脓肿分枝杆菌复合群中，已知通过基因突变产生对抗生素的耐药性。脓肿分枝杆菌复合群中存在大环内酯敏感性株和给药中产生耐药性的诱导耐药性株。已知该诱导耐药性的有无与erm(41)基因的单核苷酸多态性相关，erm(41)基因的第28位碱基为胸腺嘧啶的T28株具有诱导耐药性，但上述碱基为胞嘧啶的C28株为敏感性(参照非专利文献1)。
另一方面，作为检测肺炎支原体等细菌中的大环内酯类抗生素耐药性突变菌的方法，专利文献2中记载了使在标准株和突变菌株中行为不同的水解探针与受试体的生物学试样接触并用实时PCR进行检测的方法。
作为判断基因的单核苷酸多态性的技术，已知有利用基于等位基因特异性引物的引物伸长反应(包括核酸扩增法)的技术。等位基因特异性引物是指，取决于作为靶点的单核苷酸多态性的碱基种类而在引物伸长反应效率方面产生显著差异的引物。因此，例如，可以使用等位基因特异性引物进行PCR，并对其扩增产物量进行分析，从而确定作为靶点的单核苷酸多态性的碱基种类。但是，在该情况下，如果不严格限定反应条件，则会产生假阳性的问题。专利文献3中记载了一种假阳性反应少的单核苷酸多态性判断方法，该方法使用了以从3’末端起第2位及第3位的碱基作为特定模式的、3’末端碱基与作为靶点的单核苷酸多态性相对应的等位基因特异性引物。但是，无论怎样，在用于直接检测单核苷酸多态性的等位基因特异性引物的设计中，需要在引物的3’末端附近配置与单核苷酸多态性部位相对应的部位，设计的灵活性降低，根据单核苷酸多态性的周边序列，难以筛选兼具足以进行判断的引物伸长效率和很少的假阳性反应的引物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2019-97493号公报
专利文献2：国际公开WO2013/136818
专利文献3：日本特许第3859678号公报
非专利文献
非专利文献1：J Antimicrob Chemother 2017；72:1669-1677
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，已知脓肿分枝杆菌复合群有无大环内酯诱导耐药性与erm(41)基因的单核苷酸多态性相关，erm(41)基因的第28位碱基为胸腺嘧啶的T28株具有诱导耐药性，但上述碱基为胞嘧啶的C28株为敏感性。因此，在推定脓肿分枝杆菌复合群的大环内酯敏感性的方面，判断是T28株还是C28株是有用的。
为了获得用于直接检测单核苷酸多态性的等位基因特异性引物，如专利文献3所述，需要从有限的序列候选中设计兼具足以进行判断的引物伸长效率和很少的假阳性反应的引物，并不容易实施。
因此，本发明的一个以上实施方式提供用于判断在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的第28位碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的新方式。另外，本发明的一个以上实施方式提供用于判断在抗酸菌中erm(41)基因的第28位碱基为胞嘧啶的新方式。
解决课题的方法
本发明人等令人意外地发现了在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的基因组DNA上，在erm(41)基因的第28位碱基为胞嘧啶时存在但在上述碱基为胸腺嘧啶时不存在的指标碱基序列。然后发现，基于该指标碱基序列的有无，能够判断判定对象的抗酸菌的erm(41)基因的第28位碱基，从而完成了以下的发明。
[1]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
在判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在上述碱基为胸腺嘧啶时不存在，
检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，
未检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胸腺嘧啶。
[2]
根据[1]所述的方法，其中，上述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与上述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
[3]
根据[2]所述的方法，其中，上述第1碱基序列至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[4]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，该方法包含[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，
检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，
未检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[5]
一种引物组，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含在3’末端含有碱基序列f12的多核苷酸，所述碱基序列f12能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列f11的互补碱基序列杂交，
所述第2引物包含在3’末端含有碱基序列r12的多核苷酸，所述碱基序列r12能够与包含于上述指标碱基序列中、且位于比上述部分碱基序列f11的3’末端更靠近3’末端侧的连续10个碱基以上的部分碱基序列r11杂交。
[6]
根据[5]所述的引物组，其中，上述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的第3碱基序列。
[7]
根据[6]所述的引物组，其中，上述第3碱基序列中包含的从上述部分碱基序列f11的5’末端的碱基至部分碱基序列r11的3’末端的碱基的碱基序列至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的碱基序列。
[8]
根据[6]或[7]所述的引物组，其中，上述部分碱基序列f11为：
(f11-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列，
上述部分碱基序列r11为：
(r11-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[9]
根据[5]～[8]中任一项所述的引物组，其中，上述第1引物及上述第2引物中的一者进一步包含作为能够与标记物质结合的标签或标记物质的标记部，另一者进一步包含作为能够与固相载体结合的标签的结合部。
[10]
一种试剂盒，其包含：
[9]所述的引物组、和
至少在一部分包含能够与上述结合部结合的部分的固相载体，
所述的引物组用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在。
[11]
一种探针，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述探针包含多核苷酸，所述多核苷酸包含能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列p1杂交的碱基序列。
[12]
根据[11]所述的探针，其中，上述指标碱基序列为与序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与上述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
[13]
根据[12]所述的探针，其中，上述部分碱基序列p1至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列、或者其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[14]
根据[12]或[13]所述的探针，其中，
上述部分碱基序列p1为：
(p1-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(p1-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[15]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
以判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸作为模板，使用[5]～[9]中任一项所述的引物组进行核酸扩增反应；
检测由上述核酸扩增反应得到的扩增产物；以及
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，在未检测到上述扩增产物的情况下，判定上述碱基为胸腺嘧啶。
[16]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，其包含[15]所述的方法，其中，
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，在未检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[17]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
将判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸、和[11]～[14]中任一项所述的探针在能够杂交的条件下进行孵育；
检测上述基因组DNA或上述多核苷酸与上述探针的杂交；以及
在检测到上述杂交的情况下，判定上述判定对象的抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，在未检测到上述杂交的情况下，判定上述碱基为胸腺嘧啶。
[18]
一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，该方法包含[17]所述的方法，其中，
在检测到上述杂交的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，在未检测到上述杂交的情况下，判定上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[19]
一种判定在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的方法，该方法包括：
在判定对象的抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
检测到上述指标碱基序列表明上述判定对象的抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
[20]
根据[19]所述的方法，其中，上述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与上述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
[21]
根据[20]所述的方法，其中，上述第1碱基序列至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[22]
一种判定抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，该方法包含[19]～[21]中任一项所述的方法，其中，
检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[23]
一种引物组，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含在3’末端含有碱基序列f12的多核苷酸，所述碱基序列f12能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列f11的互补碱基序列杂交，
所述第2引物包含在3’末端含有碱基序列r12的多核苷酸，所述碱基序列r12能够与包含于上述指标碱基序列中、且位于比上述部分碱基序列f11的3’末端更靠近3’末端侧的连续10个碱基以上的部分碱基序列r11杂交。
[24]
根据[23]所述的引物组，其中，上述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的第3碱基序列。
[25]
根据[24]所述的引物组，其中，上述第3碱基序列中包含的从上述部分碱基序列f11的5’末端的碱基至部分碱基序列r11的3’末端的碱基的碱基序列至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的碱基序列。
[26]
根据[24]或[25]所述的引物组，其中，
上述部分碱基序列f11为：
(f11-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列，
上述部分碱基序列r11为：
(r11-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[27]
根据[23]～[26]中任一项所述的引物组，其中，上述第1引物及上述第2引物中的一者进一步包含作为能够与标记物质结合的标签或标记物质的标记部，另一者进一步包含作为能够与固相载体结合的标签的结合部。
[28]
一种试剂盒，其包含：
[27]所述的引物组、和
至少在一部分包含能够与上述结合部结合的部分的固相载体，
所述试剂盒用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在。
[29]
一种探针，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述探针包含多核苷酸，所述多核苷酸包含能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列p1杂交的碱基序列。
[30]
根据[29]所述的探针，其中，上述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与上述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
[31]
根据[30]所述的探针，其中，上述部分碱基序列p1至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列、或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[32]
根据[30]或[31]所述的探针，其中，
上述部分碱基序列p1为：
(p1-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(p1-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
[33]
一种判定在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的方法，该方法包括：
以判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸作为模板，使用[23]～[27]中任一项所述的引物组进行核酸扩增反应；
检测由上述核酸扩增反应得到的扩增产物、以及
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
[34]
一种判定抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，该方法包含[33]所述的方法，其中，
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[35]
一种判定在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的方法，该方法包括：
将判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸、和[29]～[32]中任一项所述的探针在能够杂交的条件下进行孵育；
检测上述基因组DNA或上述多核苷酸与上述探针的杂交；以及
在检测到上述杂交的情况下，判定上述判定对象的抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
[36]
一种判定抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法，该方法包含[35]所述的方法，其中，
在检测到上述杂交的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
[37]
[5]～[8]中任一项所述的引物组、[10]所述的试剂盒、或[11]～[14]中任一项所述的探针的用途，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在该碱基为胸腺嘧啶时不存在。
[38]
[5]～[8]中任一项所述的引物组、[10]所述的试剂盒、或[11]～[14]中任一项所述的探针的用途，其用于判定抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶。
[39]
[5]～[8]中任一项所述的引物组、[10]所述的试剂盒、或、[11]～[14]中任一项所述的探针的用途，其用于判定抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性。
[40]
[5]～[8]中任一项所述的引物组、[10]所述的试剂盒、或、[11]～[14]中任一项所述的探针的用途，其用于判定在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2020-066277号的公开内容。
发明的效果
根据本发明的一个以上实施方式，可以容易地判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的第28位碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶。另外，根据本发明的一个以上实施方式，可以容易地判断抗酸菌中erm(41)基因的第28位碱基是胞嘧啶。
附图说明
图1示出了核酸检测装置10的示意图。1：固相载体、2：结合垫(标记物质保持部)、3：样品垫(试样容纳部)、4：吸收垫、5：基材、6：包含标签捕获机构的部分。
图2示出了在实施例2中以不同的抗酸菌株的基因组DNA作为模板，通过核酸色谱法对使用了能够将序列号2所示的指标碱基序列特异性扩增的引物组的PCR的扩增产物进行检测而得到的结果。
图3示出了在实施例2中以Mycobacteroides abscessus ATCC19977(T28株)及Mycobacteroides abscessus LRC18036(C28株)的基因组DNA作为模板，通过琼脂糖凝胶电泳对使用了能够将序列号2所示的指标碱基序列的不同的区域特异性扩增的第2～7引物组的PCR的扩增产物进行检测而得到的结果。在图3中，A示出了使用第2引物组、B示出了使用第3引物组、C示出了使用第4引物组、D示出了使用第5引物组、E示出了使用第6引物组、F示出了使用第7引物组的PCR的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测而得到的结果。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
＜用语＞
在本发明中，多核苷酸或核酸这样的用语是指DNA或RNA，代表性地为DNA。多核苷酸或核酸这样的用语对碱基数没有特别限定，也包含寡核苷酸。在本发明中，引物或探针所包含的多核苷酸或核酸代表性地为天然的核苷酸的聚合物。天然的核苷酸是指由天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的碱基、以及脱氧核糖或核糖的糖部分及磷酸基构成的核苷酸，是各部分未经人工修饰的核苷酸。天然的核苷酸通常为D型核苷酸。D型核苷酸表示糖部分由D型的脱氧核糖或核糖构成的核苷酸。
碱基序列X与碱基序列Y“能够杂交”是指，包含碱基序列X的多核苷酸(特别是DNA片断)在严格条件下与包含碱基序列Y的多核苷酸(特别是DNA片断)杂交，而不与不具有碱基序列Y的多核苷酸进行杂交。即，进行杂交是指特异性进行杂交。这里，“严格条件”是指形成所谓的特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件，例如，可以参照Green andSambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012),Cold Spring Harbor Laboratory Press而适当确定。具体而言，可以通过Southern杂交时的温度、溶液中包含的盐浓度、以及Southern杂交的清洗工序时的温度、溶液中包含的盐浓度来设定严格条件。更详细而言，作为严格条件，例如，在杂交工序中，钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为40～68℃、优选为40～65℃。更具体而言，可以在1～7×SSC(1×SSC为150mM氯化钠、15mM柠檬酸一钠、pH7.2)、0.02～3％SDS、温度40℃～60℃下进行杂交。另外，可以在杂交之后进行清洗工序，清洗工序例如可以在0.1～2×SSC、0.1～0.3％SDS、温度50～65℃下进行。
作为严格条件的具体例，例如可以举出如下条件：在包含5×SSC、0.1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、0.02％(w/v)SDS的杂交溶液中将包含碱基序列X的DNA片断与包含碱基序列Y的DNA片断的杂交进行过夜(8～16小时左右)，接着，使用包含0.1～0.5×SSC、0.1％(w/v)SDS、优选包含0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS的清洗溶液进行15分钟、2次清洗。进行杂交及清洗的温度优选为50℃以上、更优选为65℃以上，杂交溶液中优选进一步包含0.5～2(w/v)的核酸杂交用封闭试剂。该条件下的杂交及清洗后，在包含碱基序列X的DNA探针与包含碱基序列Y的DNA片断进行了杂交的情况下，可以称为碱基序列X与碱基序列Y“能够杂交”。
在碱基序列X能够与碱基序列Y杂交的情况下，包含碱基序列X的多核苷酸(特别是DNA)与包含碱基序列Y的多核苷酸(特别是DNA)只要是足以在核酸扩增反应的退火条件下进行杂交而能够形成稳定的双链的氢键的组合即可，不需要是彼此完全互补的碱基序列。例如，在碱基序列X与碱基序列Y之间可以存在10个碱基中1个错配、20个碱基中1个错配、或30个碱基中1个错配等若干错配。
在碱基序列X能够与碱基序列Y杂交的情况、或表达为“能够与碱基序列X杂交的碱基序列Y”的情况下，优选满足以下(A)～(C)中的1个以上的关系。
(A)碱基序列X的互补碱基序列与碱基序列Y相同。需要说明的是，在碱基序列X的互补碱基序列和碱基序列Y的一者为DNA的碱基序列、另一者为RNA的碱基序列的情况下，一者中的胸腺嘧啶和另一者中的尿嘧啶视为相同的碱基。
(B)碱基序列Y是在碱基序列X的互补碱基序列中1个或多个碱基发生了缺失、置换、添加和/或插入的碱基序列。
(C)碱基序列Y是与碱基序列X的互补碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列。
在上述(B)中，“1个或多个”优选为1～5个、更优选为1～4个、更优选为1～3个、特别优选为1个或2个、最优选为1个。
在上述(C)中，同一性的值表示使用能够运算多个碱基序列间的同一性的软件(例如，FASTA、DANASYS及BLAST)以默认的设定计算出的值。对于碱基序列的同一性的值而言，计算出以一致度达到最大的方式将一对碱基序列比对时一致的碱基的数量，以该一致的碱基的数量相对于所比较的碱基序列的全部碱基数量的比例的形式计算。这里，在存在空位的情况下，上述的全部碱基数是将1个空位计数为1个碱基的碱基数。对于同一性的确定方法的详细情况，例如可参照Altschul et al,Nuc.Acids.Res.25,3389-3402,1977及Altschul et al,J.Mol.Biol.215,403-410,1990。
在上述(C)中，同一性更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性。
上述(A)～(C)中，特别优选为上述(A)。
在本发明中，引物和/或探针中包含的多核苷酸的制造方法没有特别限定，可以利用多核苷酸合成装置制造，也可以利用委托合成服务生产制造。
＜核酸扩增反应＞
在使用本发明的一个以上实施方式的引物组进行核酸扩增反应的情况下，可以是使用耐热性聚合酶的核酸扩增反应，也可以是使用链置换型聚合酶的核酸扩增反应。聚合酶是指核酸聚合酶，为DNA聚合酶或RNA聚合酶，优选为DNA聚合酶。
作为使用耐热性聚合酶的核酸扩增反应，可以举出聚合酶链式反应法(PCR法)。作为耐热性聚合酶，可以利用市售的DNA聚合酶，例如，可以适宜地利用TaKaRa Ex Taq(注册商标)等。另外，温度、时间、缓冲液的组成等可以根据使用的DNA聚合酶、各引物的浓度等而适当选择。PCR法中的变性、退火、伸长的各工序的时间、温度、缓冲液组成、底物核苷酸浓度、循环数等各条件可以考虑选择的DNA聚合酶、引物序列、靶核酸的碱基数、模板浓度等要素而适当设定。
链置换型聚合酶是将包含靶核酸的双链核酸的氢键自解离、并且合成新的DNA链的酶，可以列举例如：
Figure BDA0003866506700000171
DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶、96-7DNA聚合酶、Aac DNA聚合酶及Csa DNA聚合酶等。链置换型聚合酶不需要双链的解离，因此能够进行等温下的核酸扩增。
作为使用链置换型聚合酶的核酸扩增反应，优选为等温核酸扩增法，可以示例出RPA法(Recombinase Polymerase Amplification)、TRIAmp法(Tandem Repeat-mediatedIsothermal Amplification)、LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification、HDA法(Helicase-dependent amplification)等方法。
使用链置换型聚合酶的等温核酸扩增法可以通过如下方式进行：使模板核酸、引物、链置换型聚合酶、以及底物核苷酸共存，扩增引物与模板核酸形成稳定的碱基对结合，并且在能够发挥酶活性的温度下进行孵育。基于等温核酸扩增法的核酸扩增反应的温度、缓冲液组成、底物核苷酸浓度、反应时间等各条件可以考虑选择的链置换型聚合酶、引物序列、靶核酸的碱基数、模板核酸浓度等要素而适当设定。
“靶核酸”是指指标碱基序列中包含待检测和/或扩增的碱基序列的核酸、或者包含待检测和/或扩增的碱基序列的互补碱基序列的核酸。靶核酸可以与其互补链一起以双链的形式存在。以双链的形式存在的靶核酸的一条链也可以称为“靶核酸”。也可以将待检测的核酸和其互补链中的任意一者称为“靶核酸”。即，在本发明中，“检测靶核酸”或“扩增靶核酸”包含以下两者：以靶核酸本身为目的对靶核酸进行检测或扩增、以及以靶核酸的互补链或靶核酸和互补链的双链核酸的检测或扩增为目的对靶核酸、靶核酸的互补链、或靶核酸和互补链的双链核酸进行检测或扩增。
进行核酸扩增反应的情况下，成为模板的核酸只要部分包含指标碱基序列和/或其互补碱基序列即可，可以是DNA，也可以是RNA，优选为DNA。通常，成为核酸扩增反应的模板的核酸为至少在一部分包含靶核酸的多核苷酸链与该多核苷酸链的互补链的双链DNA。
成为模板的核酸可以是天然的，也可以是人工合成的。例如，可以是从生物体试样提取出的天然核酸，也可以是通过PCR等核酸扩增反应扩增的核酸、通过逆转录反应合成的cDNA等。
＜抗酸菌＞
本说明书中成为判断的对象的“抗酸菌”是指抗酸性、非运动性的革兰氏阳性杆菌。在本说明书中，“抗酸菌”可以包含“非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria；NTM)”，其中，可以包含“属于脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacteroides abscessus complex)的抗酸菌”。脓肿分枝杆菌复合群中如已经说明的那样包含3个亚种。本发明的一个以上实施方式优选用于检测脓肿分枝杆菌复合群中的erm(41)基因的第28位碱基的突变，特别优选用于检测脓肿分枝杆菌脓肿亚种及脓肿分枝杆菌博莱亚种中的erm(41)基因的第28位碱基的突变。需要说明的是，有时将Mycobacteroides属记载为Mycobacterium属。
＜erm(41)基因＞
erm(41)基因是编码红霉素核糖体甲基转移酶的基因。erm(41)基因在克拉霉素等大环内酯类抗生素的存在下表达红霉素核糖体甲基转移酶，诱导对大环内酯类抗生素的耐药性。
脓肿分枝杆菌复合群的标准株的基因组DNA中包含的erm(41)基因具有序列号1的碱基序列。在序列号1的碱基序列中，第28位碱基为胸腺嘧啶。erm(41)基因具有序列号1的碱基序列的抗酸菌是能够诱导对大环内酯类抗生素的耐药性的耐药性菌。
另一方面，在约10％的脓肿分枝杆菌复合群中，erm(41)基因的碱基序列的与序列号1的碱基序列的第28位相当的碱基从胸腺嘧啶突变为胞嘧啶。该基因型的抗酸菌无法诱导对大环内酯类抗生素的耐药性，是大环内酯类抗生素敏感性菌。
需要说明的是，属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的一部分是erm(41)基因部分缺失株，其不具有erm(41)基因的序列号1所示的碱基序列的全长而缺失了一部分。即使是erm(41)基因部分缺失株，也具有序列号1的碱基序列的第28位碱基上游的碱基序列，存在上述碱基为胸腺嘧啶的菌株和为胞嘧啶的菌株。
在以下的说明中，将erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胸腺嘧啶的类型表示为“正常型”、“erm(41)T28”或“T28”。另外，将erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胸腺嘧啶的抗酸菌株表示为“T28株”。需要说明的是，erm(41)T28基因的碱基序列是指相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胸腺嘧啶的序列，其它位置的碱基序列可以与序列号1的碱基序列相同，也可以是序列号1的碱基序列中缺失、置换、添加和/或插入了1个或多个碱基的序列，还可以如上所述位于erm(41)基因的28位的下游的部分序列发生了缺失。
在以下的说明中，另外，将erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的类型表示为“突变型”、“erm(41)C28”或“C28”。另外，将erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的抗酸菌株表示为“C28株”。需要说明的是，erm(41)C28基因的碱基序列是指相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的序列，其它位置的碱基序列可以与序列号1的碱基序列相同，也可以是序列号1的碱基序列中缺失、置换、添加和/或插入了1个或多个碱基的序列，还可以如上所述位于erm(41)基因的28位的下游的部分序列发生了缺失。
在上述的两段中，“1个或多个”优选为1～5个、更优选为1～4个、更优选为1～3个、特别优选为1个或2个、最优选为1个。
＜抗酸菌的erm(41)基因型的判定方法1＞
本发明的第一实施方式涉及一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
在判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域、在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，
未检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胸腺嘧啶。
根据上述第一实施方式的方法，能够不检测erm(41)基因中的单碱基突变而检测指标碱基序列来判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌是C28株还是28株，所述指标碱基序列在上述抗酸菌为C28株时特异性地存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域。在上述第一实施方式的方法中，不需要直接检测单碱基突变，只要能够检测基因组DNA中的指标碱基序列存在或不存在，就能够判定是C28株还是T28株，因此可以简便地实施。
另外，上述第一实施方式的方法可以用于判定抗酸菌、特别是属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌是否具有对大环内酯类抗生素的敏感性。判定抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法包括在判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA中检测上述指标碱基序列，检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，未检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
另外，上述指标序列可以作为判定抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的指标。
本发明人等出人意料地发现，在C28株的基因组DNA中特异性地存在具有序列号2的碱基序列的区域，而在T28株的基因组DNA中不存在。
序列号2的碱基序列是从5’末端至3’末端序列号3的碱基序列、序列号4的碱基序列、序列号5的碱基序列、序列号6的碱基序列、序列号7的碱基序列、序列号8的碱基序列、序列号9的碱基序列、序列号10的碱基序列、以及序列号11的碱基序列按照该顺序连接而成的碱基序列。序列号3～11的各碱基序列的5’末端及3’末端的碱基在序列号2的碱基序列上的位置如下表所示。
表1
Figure BDA0003866506700000211
在序列号2的碱基序列中，序列号3的碱基序列、序列号5的碱基序列、序列号7的碱基序列、序列号9的碱基序列、以及序列号11的碱基序列为尤其在T28株的基因组DNA中不存在同源性较高的碱基序列的碱基序列，因此特别优选作为C28株的判定指标。
作为上述指标碱基序列，只要是在抗酸菌C28株的基因组DNA中特异性地存在的碱基序列即可，具体而言，优选为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列或与上述第1碱基序列互补的第2碱基序列。上述第1碱基序列更优选为序列号2的碱基序列中包含的连续20个碱基以上、50个碱基以上、100个碱基以上、500个碱基以上、或1000个碱基以上的碱基序列。上述第1碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，例如可以为3000个碱基以下、或1500个碱基以下。
上述第1碱基序列更优选为至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、优选为20个碱基以上、50个碱基以上、100个碱基以上、500个碱基以上、或1000个碱基以上的碱基序列。这样的第1碱基序列或作为其互补碱基序列的第2碱基序列是在T28株的基因组DNA中不存在同源性较高的碱基序列的碱基序列，因此，能够基于其存在而高精度地判定C28株。
在上述第一实施方式的方法中，检测上述指标碱基序列的方法没有特别限定，例如，可以通过使用后述的探针或引物的方法来实施。
在上述第一实施方式的方法中，在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的基因组DNA中检测到上述指标碱基序列的情况下，可以判断上述抗酸菌为C28株，在上述抗酸菌的基因组DNA中未检测到上述指标碱基序列的情况下，可以判断上述抗酸菌为T28株。
＜用于检测对C28株特异性的指标碱基序列的探针＞
本发明的第二实施方式涉及一种探针，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域、在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述探针包含多核苷酸，所述多核苷酸包含能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列p1杂交的碱基序列。
上述第二实施方式中的上述指标碱基序列可以从与第一实施方式相关的指标碱基序列相同的范围内选择。
上述部分碱基序列p1是上述指标碱基序列中与第二实施方式的探针进行杂交的区域。
上述部分碱基序列p1是上述指标碱基序列中的连续的部分碱基序列，只要具有为了保持特异性所必需的碱基数即可，其碱基数可以为10个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上。上述部分碱基序列p1的碱基数的上限没有特别限定，例如可以是400个碱基以下、300个碱基以下、200个碱基以下、100个碱基以下、或50个碱基以下的上述指标碱基序列的部分碱基序列。
上述部分碱基序列p1更优选至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上、例如400个碱基以下、300个碱基以下、200个碱基以下、100个碱基以下、或50个碱基以下的碱基序列。
上述部分碱基序列p1优选为：
(p1-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(p1-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列，
更优选为
(p1-12-2)序列号2的碱基序列的第4629～4663位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-18-2)序列号2的碱基序列的第2361～2392位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-20-2)序列号2的碱基序列的第2629～2658位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-22-2)序列号2的碱基序列的第4049～4078位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-24-2)序列号2的碱基序列的第6540～6570位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-26-2)序列号2的碱基序列的第7483～7515位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-28-2)序列号2的碱基序列的第7634～7668位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-13-2)序列号2的碱基序列的第4699～4735位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-19-2)序列号2的碱基序列的第2677～2706位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-21-2)序列号2的碱基序列的第3544～3578位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-23-2)序列号2的碱基序列的第5066～5098位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-25-2)序列号2的碱基序列的第6571～6600位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(p1-27-2)序列号2的碱基序列的第7936～7971位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(p1-29-2)序列号2的碱基序列的第8307～8341位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列。
本发明的上述第二实施方式的探针能够在严格条件下与包含上述指标碱基序列的多核苷酸中上述部分碱基序列p1的区域进行杂交。因此，本发明的上述第二实施方式的探针可以用于核酸杂交法(例如Southern杂交)、实时PCR法(例如(例如TaqManTM法、Molecular Beacon法)等。
构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸包含与上述部分碱基序列p1的互补碱基序列相同或同源的碱基序列。这里，“同源”是指满足上述(B)或(C)的条件，具体而言，满足以下的(B1)或(C1)的条件。
(B1)构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸的碱基序列是在上述部分碱基序列p1的互补碱基序列中缺失、置换、添加和/或插入了1个或多个的碱基的碱基序列。
(C1)构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸的碱基序列是与上述部分碱基序列p1的互补碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列。
上述(B1)中的“1个或多个”、上述(C1)中的“同一性”的优选范围如与上述(B)及(C)相关的部分所述。
构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸不需要仅由与上述部分碱基序列p1的互补碱基序列相同或同源的碱基序列(以下称为“碱基序列q1”)构成，可以在碱基序列q1的5’末端侧及3’末端侧的一者或两者添加有其它碱基序列。碱基序列q1特别优选与上述部分碱基序列p1的互补碱基序列相同。
构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸的总体的碱基数没有特别限定，可以为8个碱基以上、10个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为20个碱基以上，优选为400个碱基以下、300个碱基以下或200个碱基以下。在将该探针用于实时PCR法的情况下，多核苷酸优选为50个碱基以下，更优选为40个碱基以下或35个碱基以下。
作为构成上述第二实施方式的探针的多核苷酸的具体例，可以示例出：包含序列号12、13、18～29中的任意碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、特别优选为20个碱基以上的碱基序列的多核苷酸。
上述第二实施方式的探针可以在上述多核苷酸进一步添加标记部，所述标记部是能够与标记物质结合的标签或标记物质。这样的标记部的具体例与引物相关，如后所述。包含标记部的探针与包含上述指标碱基序列的多核苷酸杂交而生成的复合体可将标记部作为指标而容易地进行检测。
另外，上述第二实施方式的探针可以在上述多核苷酸进一步添加结合部，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。这样的结合部的具体例与引物相关，如后所述。包含结合部的上述探针与包含上述指标碱基序列的多核苷酸杂交而生成的复合体能够经由结合部而固定于固相载体，复合体的检测及分离变得容易。
包含结合部的上述探针可以以经由结合部预先固定于固相载体的状态而提供。固定于固相载体的上述探针能够捕获包含上述指标碱基序列的多核苷酸。
在将上述第二实施方式的探针用于实时PCR法的情况下，优选用扩增产物的实时检测中通常使用的标记物质进行标记化。例如，在作为探针而使用的多核苷酸的5’末端连接报告荧光物质，在3’末端连接猝灭剂色素。作为报告荧光物质，可以示例出羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)等。作为猝灭剂色素，可以示例出羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质、Black Hole Quencher色素(BHQ)、4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid(DABCYL)等非荧光物质等。
上述第二实施方式的探针可以用于判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法。
具体而言，该方法可以包括：
将判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸、和上述探针在能够杂交的条件下进行孵育；
检测上述基因组DNA或上述多核苷酸与上述探针的杂交；以及
在检测到上述杂交的情况下，判定上述判定对象的抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，在未检测到上述杂交的情况下，判定上述碱基为胸腺嘧啶。
另外，上述第二实施方式的探针可以用于判定抗酸菌、特别是属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性的方法。具体而言，该方法可以包括：
将判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸、和上述探针在能够杂交的条件下进行孵育；
检测上述基因组DNA或上述多核苷酸与上述探针的杂交；以及
在检测到上述杂交的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，在未检测到上述杂交的情况下，判定上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
另外，上述第二实施方式的探针可以用于判定抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的方法。具体而言，该方法包括：
将判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸、和上述探针在能够杂交的条件下进行孵育；
检测上述基因组DNA或上述多核苷酸与上述探针的杂交；以及
在检测到上述杂交的情况下，判定上述判定对象的抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
这里，作为“由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸”，可以列举：上述基因组DNA的一部分的部分多核苷酸、通过核酸扩增反应将上述基因组DNA的全部或包含上述指标碱基序列的部分进行扩增而得到的扩增产物。
作为上述的各方式中的“能够杂交的条件”，优选为与以作为“严格条件”而记载的条件相同的条件。
＜用于检测对C28株特异性的指标碱基序列的引物组＞
本发明的第三实施方式涉及一种引物组，其用于检测指标碱基序列，所述指标碱基序列在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域、在该碱基为胸腺嘧啶时不存在，
所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含在3’末端含有碱基序列f12的多核苷酸，所述碱基序列f12能够与上述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列f11的互补碱基序列杂交，
所述第2引物包含在3’末端含有碱基序列r12的多核苷酸，所述碱基序列r12能够与包含于上述指标碱基序列中、且位于比上述部分碱基序列f11的3’末端更靠近3’末端侧的连续10个碱基以上的部分碱基序列r11杂交。
作为上述指标碱基序列，只要是在抗酸菌C28株的基因组DNA中特异性地存在的碱基序列即可，具体而言，优选为序列号2的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的第3碱基序列。上述第3碱基序列更优选为序列号2的碱基序列中包含的连续的40个碱基以上、50个碱基以上、100个碱基以上、500个碱基以上、或1000个碱基以上的碱基序列。上述第3碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，例如可以为3000个碱基以下、或1500个碱基以下。
在以下的说明中，将上述第3碱基序列中包含的从上述部分碱基序列f11的5’末端的碱基至部分碱基序列r11的3’末端的碱基的碱基序列称为“靶序列”。靶序列及其互补碱基序列可通过使用了本实施方式的引物组的核酸扩增反应而扩增。靶序列优选至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续20个碱基以上、优选为40个碱基以上、50个碱基以上、100个碱基以上、500个碱基以上、或1000个碱基以上的碱基序列。该靶序列是在T28株的基因组DNA中不存在同源性较高的碱基序列的碱基序列，因此，能够基于其存在而高精度地判定C28株。
上述靶序列的长度没有特别限定。为了提高检测精度，靶序列优选包含上述指标碱基序列中优选为20个碱基以上、更优选为40个碱基以上、50个碱基以上、100个碱基以上、500个碱基以上、或1000个碱基以上的连续的部分。上述靶序列的长度的上限没有特别限定，通常为3000个碱基以下或1500个碱基以下。
上述部分碱基序列f11位于靶序列的5’末端。上述部分碱基序列r11位于靶序列的3’末端。
上述部分碱基序列f11及上述部分碱基序列r11的长度可以分别为10个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上，代表性地可以为40个碱基以下、30个碱基以下或27个碱基以下。
上述部分碱基序列f11优选为
(f11-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列，
更优选为
(f11-12-2)序列号2的碱基序列的第4629～4661位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-2)序列号2的碱基序列的第2361～2390位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-2)序列号2的碱基序列的第2629～2656位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-2)序列号2的碱基序列的第4049～4076位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-2)序列号2的碱基序列的第6540～6568位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-2)序列号2的碱基序列的第7483～7513位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-2)序列号2的碱基序列的第7634～7666位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列，
特别优选为
(f11-12-3)序列号2的碱基序列的第4629～4658位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-3)序列号2的碱基序列的第2361～2387位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-3)序列号2的碱基序列的第2629～2653位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-3)序列号2的碱基序列的第4049～4073位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-3)序列号2的碱基序列的第6540～6565位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-3)序列号2的碱基序列的第7483～7510位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-3)序列号2的碱基序列的第7634～7663位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列。
在上述(f11-12-1)～(f11-28-1)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从3’末端起第1～12位的碱基至5’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。
在上述(f11-12-2)～(f11-28-2)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从3’末端起第1～5位的碱基至5’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。
在上述(f11-12-3)～(f11-28-3)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从3’末端起第1～2位的碱基至5’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。这里，“从3’末端起第1～2位的碱基”更优选为“3’末端的碱基”。
上述部分碱基序列r11优选为
(r11-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列，
更优选为
(r11-13-2)序列号2的碱基序列的第4701～4735位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-2)序列号2的碱基序列的第2679～2706位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-2)序列号2的碱基序列的第3546～3578位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-2)序列号2的碱基序列的第5068～5098位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-2)序列号2的碱基序列的第6573～6600位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-2)序列号2的碱基序列的第7938～7971位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-2)序列号2的碱基序列的第8309～8341位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列，
特别优选为
(r11-13-3)序列号2的碱基序列的第4704～4735位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-3)序列号2的碱基序列的第2682～2706位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-3)序列号2的碱基序列的第3549～3578位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-3)序列号2的碱基序列的第5071～5098位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-3)序列号2的碱基序列的第6576～6600位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-3)序列号2的碱基序列的第7941～7971位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-3)序列号2的碱基序列的第8312～8341位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列。
在上述(r11-13-1)～(r11-29-1)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从5’末端起第1～12位的碱基至3’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。
在上述(r11-13-2)～(r11-29-2)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从5’末端起第1～5位的碱基至3’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。
在上述(r11-13-3)～(r11-29-3)中，“连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”优选为“从5’末端起第1～2位的碱基至3’末端方向的连续10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的碱基序列”。“从5’末端起第1～2位的碱基”更优选为“5’末端的碱基”。
上述部分碱基序列f11和上述部分碱基序列r11只要是上述部分碱基序列f11的3’末端的碱基比部分碱基序列r11的5’末端的碱基在序列号2的碱基序列中位于更靠近5’末端侧(上游侧)的组合即可。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-12-1)、(f11-12-2)或(f11-12-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-13-1)、(r11-13-2)、(r11-13-3)、(r11-23-1)、(r11-23-2)、或(r11-23-3)。在该情况下，能够扩增序列号7的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-18-1)、(f11-18-2)或(f11-18-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-19-1)、(r11-19-2)、(r11-19-3)、(r11-21-1)、(r11-21-2)、或(r11-21-3)。在该情况下，能够扩增序列号5的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-20-1)、(f11-20-2)或(f11-20-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-19-1)、(r11-19-2)、(r11-19-3)、(r11-21-1)、(r11-21-2)、或(r11-21-3)。在该情况下，能够扩增序列号5的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-22-1)、(f11-22-2)或(f11-22-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-13-1)、(r11-13-2)、(r11-13-3)、(r11-23-1)、(r11-23-2)、或(r11-23-3)。在该情况下，能够扩增序列号7的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-24-1)、(f11-24-2)或(f11-24-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-25-1)、(r11-25-2)、或(r11-25-3)。在该情况下，能够扩增序列号9的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-26-1)、(f11-26-2)或(f11-26-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-27-1)、(r11-27-2)、(r11-27-3)、(r11-29-1)、(r11-29-2)、或(r11-29-3)。在该情况下，能够扩增序列号11的部分碱基序列。
优选上述部分碱基序列f11为(f11-28-1)、(f11-28-2)或(f11-28-3)时，上述部分碱基序列r11为(r11-27-1)、(r11-27-2)、(r11-27-3)、(r11-29-1)、(r11-29-2)、或(r11-29-3)。在该情况下，能够扩增序列号11的部分碱基序列。
第1引物中的多核苷酸可以以在3’末端包含能够与上述部分碱基序列f11的互补碱基序列进行杂交的碱基序列f12的方式设计。第1引物中的多核苷酸只要在3’末端包含碱基序列f12即可，可以在碱基序列f12的5’末端侧进一步添加其它碱基序列。第1引物中的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以设为10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上，代表性地可以为40个碱基以下、30个碱基以下或27个碱基以下。
在上述碱基序列f12能够与上述部分碱基序列f11的互补碱基序列杂交的情况下，上述部分碱基序列f11与上述碱基序列f12相同或同源。这里，“同源”是指满足上述(B)或(C)的条件，具体而言，是指满足以下的(B2)或(C2)的条件。
(B2)上述碱基序列f12是在上述部分碱基序列f11中缺失、置换、添加和/或插入了1个或多个的碱基的碱基序列。
(C2)上述碱基序列f12是与上述部分碱基序列f11具有80％以上的同一性的碱基序列。
上述(B2)中的“1个或多个”、上述(C2)中的“同一性”的优选范围如与上述(B)及(C)相关部分所述。
第2引物中的多核苷酸可以以在3’末端包含能够与上述部分碱基序列r11杂交的碱基序列r12的方式设计。第2引物中的多核苷酸只要在3’末端包含碱基序列r12即可，可以在碱基序列r12的5’末端侧进一步添加其它碱基序列。第2引物中的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为10个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上，代表性地可以为40个碱基以下、30个碱基以下或27个碱基以下。
在上述碱基序列r12能够与上述部分碱基序列r11杂交的情况下，上述部分碱基序列r11的互补碱基序列与上述碱基序列r12相同或同源。这里，“同源”是指满足上述(B)或(C)的条件，具体而言，是指满足以下的(B3)或(C3)的条件。
(B3)上述碱基序列r12是在上述部分碱基序列r11的互补碱基序列中缺失、置换、添加和/或插入了1个或多个的碱基的碱基序列。
(C3)上述碱基序列r12是与上述部分碱基序列r11的互补碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列。
上述(B3)中的“1个或多个”、上述(C3)中的“同一性”的优选范围如与上述(B)及(C)相关部分所述。
第1引物与第2引物的组合没有特别限定，可以以能够通过核酸扩增反应将基因组DNA的靶区域扩增为多核苷酸片断的方式进行组合。
作为上述第三实施方式的引物组的优选例，可以示例出如下引物组，其中，
第1引物为包含40个碱基以下的多核苷酸，该多核苷酸在3’末端包含与(C28f)序列号12、18、20、22、24、26或28所示的碱基序列相同或同源的碱基序列C28fa中包含的连续10个碱基以上的碱基序列C28fb，
第2引物为包含40个碱基以下的多核苷酸，该多核苷酸在3’末端包含与(C28r)序列号13、19、21、23、25、27或29所示的碱基序列相同或同源的碱基序列C28ra中包含的连续10个碱基以上的碱基序列C28rb。
在上述(C28f)中，碱基序列C28fa与序列号12、18、20、22、24、26或28的碱基序列相同或同源，即满足上述(B)或(C)的关系(序列号12、18、20、22、24、26或28的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列C28fa相当于碱基序列Y)。
在上述(C28f)中，碱基序列C28fa优选为如下碱基序列：从3’末端起连续的优选为3个碱基以上、更优选为5个碱基以上、更优选为10个碱基以上、更优选为12个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的部分与序列号12、18、20、22、24、26或28所示的碱基序列相同，剩余部分同源(即，满足上述(B)或(C)的关系(序列号12、18、20、22、24、26或28的碱基序列的剩余部分相当于碱基序列X，碱基序列C28fa的剩余部分相当于碱基序列Y))，优选与序列号12、18、20、22、24、26或28所示的碱基序列相同。
上述碱基序列C28fb优选为上述碱基序列C28fa中包含的连续的12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上的碱基序列，更优选为从上述碱基序列C28fa的3’末端的碱基起连续的碱基序列。
上述碱基序列C28fb更优选与上述碱基序列C28fa相同。
在上述(C28r)中，碱基序列C28ra与序列号13、19、21、23、25、27或29的碱基序列相同或同源，即满足上述(B)或(C)的关系(序列号13、19、21、23、25、27或29的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列C28ra相当于碱基序列Y)。
在上述(C28r)中，碱基序列C28ra优选为如下碱基序列：从3’末端起连续的优选为3碱基以上、更优选为5个碱基以上、更优选为10个碱基以上、更优选为12个碱基以上、更优选为15个碱基以上、更优选为17个碱基以上、更优选为20个碱基以上的部分与序列号13、19、21、23、25、27或29所示碱基序列相同，剩余部分同源(即，满足上述(B)或(C)的关系(序列号13、19、21、23、25、27或29的碱基序列的剩余部分相当于碱基序列X，碱基序列C28ra的剩余部分相当于碱基序列Y))，优选与序列号13、19、21、23、25、27或29所示的碱基序列相同。
上述碱基序列C28rb优选为上述碱基序列C28ra中包含的连续的12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上的碱基序列，更优选为从上述碱基序列C28ra的3’末端的碱基起连续的碱基序列。
上述碱基序列C28rb更优选与上述碱基序列C28ra相同。
第1引物可以仅由上述多核苷酸构成，也可以进一步包含后述的标记部或结合部。上述多核苷酸和标记部或结合部可以通过后述的适当的间隔物而化学连接。在第1引物中，标记部及结合部中的一者与上述多核苷酸连接的位置只要是不妨害上述多核苷酸与包含靶区域的多核苷酸或其互补链的退火及核酸扩增反应中的伸长的位置即可，没有特别限定，优选为上述多核苷酸的5’末端。
第2引物可以仅由上述多核苷酸构成，也可以进一步包含后述的标记部或结合部。上述多核苷酸与标记部或结合部可以通过后述的适当的间隔物而化学连接。在第2引物中，标记部及结合部中的一者与上述多核苷酸连接的位置只要是不妨害上述多核苷酸与包含靶区域的多核苷酸或其互补链的退火及核酸扩增反应中的伸长的位置即可，没有特别限定，优选为上述多核苷酸的5’末端。
在第1引物及第2引物中的至少一者包含标记部的情况下，在使用其的核酸扩增反应中可得到包含标记部的扩增产物，因此易于进行扩增产物的检测。
第1引物及第2引物中的至少一者包含结合部的情况下，在使用其的核酸扩增反应中可得到包含结合部的扩增产物，因此，能够将扩增产物固定于固相载体，易于进行扩增产物的检测。
更优选为第1引物及第2引物中的一者进一步包含标记部，另一者进一步包含结合部。在使用了该方式的引物组的核酸扩增反应中，可得到包含标记部和结合部的双链的扩增产物，因此易于进行基于核酸色谱法的检测。
以下，对包含标记部及结合部的引物组进行说明。
(标记部)
标记部是能够与标记物质结合的标签或标记物质的任一种，优选为能够与标记物质结合的标签。在本说明书中，有时将能够与标记物质结合的标签称为标记用标签。在标记部为标记用标签的情况下，可以通过使核酸扩增反应的扩增产物与标记物质接触而标记扩增产物的一端所包含的标签。在标记部为标记物质的情况下，可以得到一端包含标记物质的扩增产物作为核酸扩增反应的扩增产物。
标记物质只要能够进行扩增产物的检测即可，没有特别限定，优选为能够肉眼检测扩增产物的标记物质。作为这样的标记物质，可以列举：着色粒子、色素、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶等)等，优选为着色粒子。“着色粒子”是指金属(例如，金、银、铜、铂等)粒子、金属棒、着色的胶乳粒子、包含色素的二氧化硅纳米粒子等，但并不限定于此。标记物质的大小只要不妨害将扩增产物捕获于后述的固相载体即可。标记物质优选为在检测时显色良好的物质，可以以成为小于后述的固相载体、具备固相载体的核酸检测装置的各种多孔构件的孔径的尺寸的方式适当选择。例如，标记物质的大小可以为约500nm以下、优选为约0.1nm～250nm、更优选为约1nm～100nm的粒径。作为色素，也可以使用荧光色素(荧光素、酞菁等)等，在该情况下，优选照射各荧光色素的激发波长光而进行检测。
可以用作标记部的标记用标签只要能够与标记物质结合即可，可以根据标记物质的结构而适当选择，没有特别限定，例如，可以利用核酸(DNA、RNA等)、蛋白质、肽、或其它化合物(例如，生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、地高辛(DIG)等低分子化合物)、或由它们的组合所形成的物质。作为标记用标签的一个优选方式，包含多核苷酸，或由多核苷酸构成。标记用标签中可包含的该多核苷酸只要不实质性妨害基于上述引物组的核酸扩增反应即可，没有特别限定，例如为碱基数5～50、优选为10～35的多核苷酸，更优选可以使用包含序列号14或15所示的碱基序列或其部分碱基序列或它们的互补碱基序列(或由它们构成)的多核苷酸。作为标记用标签的另一个优选方式，由生物素、FITC、DIG等低分子化合物形成。
在标记部为上述的标记用标签的情况下，标记物质与标记用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方式可以根据利用的标记物质与标记用标签的组合而选择适当合适的方式。例如，在标记用标签包含多核苷酸的情况下，可以通过使标记物质与能够和该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如，包含该多核苷酸的碱基序列和互补的序列的多核苷酸)结合，并使两者的多核苷酸杂交，从而将标记物质与标记用标签间接地结合。标记物质与多核苷酸的结合可以经由肽、蛋白质、核酸等进行，也可以经由适当的官能团进行。杂交的条件只要是发生杂交的条件即可，没有特别限定，例如，可以通过在20℃～40℃下、于包含10mM～50mM的磷酸的缓冲液(pH6～7)中使其反应而进行。为了提高杂交效率，可以在缓冲液中进一步包含氯化钠等盐。
另外，在标记用标签为低分子化合物的情况下，可以利用与其特异性结合的蛋白质(例如，与生物素结合的抗生物素蛋白、与FITC结合的蛋白质)、抗体(例如抗DIG抗体)、与适体等结合性物质连接的标记物质进行标记。在该情况下，标记用标签和结合性物质可以使用各种中性附近的缓冲液而使其结合。
标记部(标记用标签或标记物质)、和第1引物中包含的多核苷酸或第2引物中包含的多核苷酸可以通过任意方式结合，可以直接或间接地结合。其中，在标记部中至少与上述多核苷酸连接的部分由多核苷酸形成的情况下，以该部分不会因核酸扩增反应而与上述多核苷酸一起双链化的方式经由能够抑制或停止DNA聚合酶反应进行的间隔物而将上述多核苷酸与标记部结合。作为这样的“间隔物”，只要能够抑制或停止DNA聚合酶反应的进行，防止标记部的双链化即可，例如，具有牢固的发夹结构、假结结构的核酸序列、L型核酸、肽核酸(PNA)、交联化核酸(Bridged Nucleic Acid(BNA)或Locked Nucleic Acid(LNA))、荧光素、Cy3、Cy5、下述式I表示的包含偶氮苯结构的二价基团、脂肪链(亚烷基链或聚氧亚烷基链)、包含5’-5’键、3’-3’键这样的反向序列结构的二价基团等，但并不限定于此。
[化学式1]
Figure BDA0003866506700000401
在经由式I表示的二价基团连接2个多核苷酸分子的情况下，该二价基团的一个3’端的磷酸基是指一个多核苷酸分子的5’末端的核苷酸的磷酸基，另一个5’端的氧原子与另一个多核苷酸分子的3’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键。
作为脂肪链的间隔物，可以举出例如以下的式(II)表示的间隔物。
5’-O-CmH2m-O-3’ 式(II)
(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，m表示1以上且40以下的整数。H任选被取代基所取代。)
在式(II)中，m优选为2以上且36以下，更优选为3以上且16以下。式(II)中的H任选被取代基所取代，作为取代基，代表性地可以列举：烷基、烷氧基、羟基等。作为取代基的烷基及烷氧基的碳原子数优选为1～8、更优选为1～4。另外，在具有2个以上取代基的情况下，取代基可以相同或不同。此外，优选不具有取代基。
另外，作为其它间隔物，可以举出以下式(III)表示的间隔物。
5’-(OCnH2n)L-O-3’ 式(III)
(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，n表示2以上且4以下的整数，L表示1以上、且(n+1)×L为40以下的整数。H任选被取代基所取代。)
在式(III)中，(n+1)×L优选为2以上且36以下、更优选为3以上且16以下。式(III)中的H的取代基可适用与式(II)中的取代基相同的方式。
作为其它脂肪链的间隔物，可以举出例如以下的二价基团。
[化学式2]
Figure BDA0003866506700000421
在经由这些二价基团连接2个多核苷酸分子的情况下，各二价基团的一端的磷酸基是指一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基，另一端的氧原子与另一个多核苷酸分子的5’末端或3’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键。
(结合部及固相载体)
结合部是能够与后述的固相载体结合的标签。在本说明书中，有时将能够与固相载体结合的标签称为固定化用标签。
可以用作结合部的固定化用标签只要能够与固相载体结合即可，可以根据固相载体的结构而适当选择，没有特别限定，例如，可以利用多核苷酸(DNA、RNA等)、蛋白质、肽、或其它化合物(例如低分子化合物)、或由它们的组合所形成的物质。固定化用标签优选包含多核苷酸，或由多核苷酸构成。固定化用标签中可包含的该多核苷酸只要不实质性妨害基于上述引物组的核酸扩增反应即可，没有特别限定，例如为碱基数5～50、优选为10～35的多核苷酸，更优选可以使用包含序列号14或15所示的碱基序列或其部分碱基序列或它们的互补碱基序列(或由它们构成)的多核苷酸。
固相载体没有特别限定，可以利用由树脂、金属、多糖类、矿物等制成的载体，可以为膜片、膜、无纺布、板、凝胶等形状。优选固相载体具有多孔结构，以便能够展开溶液中的扩增产物、标记物质。在本发明中，作为可利用的固相载体，可以列举例如：滤纸、硝酸纤维素膜、聚醚砜膜、尼龙膜、干燥的各种凝胶(硅胶、琼脂糖凝胶、硅凝胶、明胶凝胶)、硅、玻璃、塑料等。固相载体的大小及形态可以适当选择，以便适合各种操作、检测。
固相载体只要以至少一部分能够与固定化用标签结合的方式构成即可，更优选以仅一部分能够与固定化用标签结合的方式构成。通过以仅能够将固相载体的特定部分与固定化用标签结合的方式构成，可以将捕获至固相载体的扩增产物限制于仅上述部分而进行检测，因此能够容易地判断阳性或阴性。
固相载体与固定化用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方式可以根据利用的固相载体与固定化用标签的组合而选择适当合适的方式。例如，在固定化用标签包含多核苷酸的情况下，可以通过将能够与该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如，包含该多核苷酸的碱基序列和互补的序列的多核苷酸)固定化于固相载体而制成标签捕获机构，并使两者的多核苷酸杂交，从而将固相载体与固定化用标签间接地结合。多核苷酸向固相载体的固定化可以经由肽、蛋白质、核酸等进行，也可以经由适当的官能团进行。杂交的条件可以通过标记用标签与标记物质的结合相关的上述条件来进行。在将多核苷酸固定化于固相载体的情况下，通过限制在特定的部分进行固定化，被捕获的扩增产物仅局限于给定的部分而进行检测，因此能够容易地判断阳性或阴性。
结合部(固定化用标签)、和第1引物中包含的多核苷酸或第2引物中包含的多核苷酸可以通过任意方式结合，可以直接或间接地结合。其中，在固定化用标签中至少与上述多核苷酸连接的部分由多核苷酸形成的情况下，以该部分不因核酸扩增反应而与上述多核苷酸一起双链化的方式经由能够抑制或停止DNA聚合酶反应进行的间隔物而将上述多核苷酸与固定化用标签结合。设置在结合部与多核苷酸之间的间隔物的具体例与针对设置在标记部与多核苷酸之间的间隔物而所述的例子相同。
＜使用了用于检测对C28株特异性的指标碱基序列的引物组的基因型的判定方法＞
使用包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组，可以判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶。
该判定方法例如包括：
以判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸作为模板，使用包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组进行核酸扩增反应；
检测由上述核酸扩增反应得到的扩增产物；以及
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶，在未检测到上述扩增产物的情况下，判定上述碱基为胸腺嘧啶。
另外，包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组可以用于判定在抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶的方法。该方法例如包括：
以判定对象的抗酸菌的基因组DNA或判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸作为模板，使用包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组进行核酸扩增反应；
检测由上述核酸扩增反应得到的扩增产物；以及
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
这里，作为“由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸”，可以举出上述基因组DNA的一部分的部分多核苷酸、通过核酸扩增反应将上述基因组DNA的全部或包含上述指标碱基序列的部分进行扩增而得到的扩增产物。
核酸扩增反应的例子如上所述。
在判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸中包含使用了上述第1引物和上述第2引物的核酸扩增反应所得到的靶序列的情况下，产生包含靶序列的多核苷酸片断作为扩增产物。
由核酸扩增反应产生的扩增产物的检测方法没有特别限定，例如可以示例出如下方法：利用凝胶电泳将核酸扩增反应的反应液分级，确认有无相当于包含给定靶序列的多核苷酸片断的尺寸的条带的方法；使对包含给定靶序列的多核苷酸片断进行了特异性标记而得到的多核苷酸探针与核酸扩增反应的反应液或其产物杂交来检测复合体的方法。
另外，在多核苷酸的5’末端连接有报告荧光物质、且在3’末端连接有猝灭剂色素的本发明的第二实施方式的探针的存在下进行核酸扩增反应，以扩增了包含给定靶序列的多核苷酸片断时产生的荧光作为指标，对多核苷酸片断进行检测，这也是扩增产物的检测方法的一个方式。
另外，在第1引物及第2引物中的一者进一步包含作为能够与标记物质结合的标签或标记物质的标记部，另一者进一步包含作为能够与固相载体结合的标签的结合部的情况下，可以进行使用了以下的固相载体的检测工序。
(使用了固相载体的检测工序)
在该检测工序中，使核酸扩增反应的产物与固相载体接触，以标记部作为指标，对固相载体的上述部分处的扩增产物进行检测，所述固相载体至少在一部分包含能够与结合部结合的部分。
在标记部为上述的标记用标签的情况下，可以进一步进行使标记物质与标记用标签结合的标记工序。标记工序的详细情况在后面说明。在标记部为上述的标记物质的情况下，不需要标记工序。在检测工序中，“以标记部作为指标”是指，在标记部为标记用标签的情况下，以经过标记工序而结合的标记物质作为指标对扩增产物进行检测，在标记部为标记物质的情况下，以该标记物质作为指标对扩增产物进行检测。
核酸扩增反应的产物是指可能包含扩增产物的核酸扩增反应的反应液、由该反应液将扩增产物进一步浓缩而得到的试样等。
固相载体的详细情况如上所述。
对于上述产物与能够和固相载体的结合部结合的部分的接触而言，根据固相载体与结合部的组合，在上述产物中包含扩增产物的情况下，在以扩增产物的结合部与上述部分结合的方式进行了适当调节的条件(例如，杂交的条件、或pH5～9左右的缓冲液条件)下进行。
扩增产物的检测可以通过对捕获至固相载体的扩增产物所结合的上述标记物质进行检测、优选进行肉眼观察检测而进行。在存在扩增产物的情况下，可检测捕获/结合于固相载体的扩增产物的标记物质。以有无该检测作为指标，可以判断有无核酸扩增反应的反应体系中的扩增产物(包含靶序列的多核苷酸片断)。
(标记工序)
标记工序是在引物组中包含的上述标记部为上述的标记用标签的情况下进行的工序，通过使核酸扩增反应的产物与标记物质接触而使标记用标签与标记物质结合来进行。标记工序可以在使核酸扩增反应的产物与固相载体接触之前进行，也可以在接触之后进行，还可以在接触的同时进行。
对于标记物质与上述产物的接触而言，根据标记物质与标记用标签的组合，在上述产物中包含有扩增产物的情况下，可以在以标记物质与扩增产物的标记用标签结合的方式进行了适当调节的条件(例如，上述的杂交的条件、或pH5～9左右的缓冲液条件)下进行。
(检测装置)
上述的检测工序及标记工序可以使用利用核酸色谱法的核酸检测装置来进行。通过利用该核酸检测装置，能够在不需要特殊装置的情况下检测/判断有无核酸扩增反应的反应体系中的扩增产物(包含靶序列的多核苷酸片断)，可以简便且迅速地得到结果。
核酸检测装置可以使用为了检测通过核酸色谱法标记的核酸扩增产物而利用的公知的核酸检测装置(WO2012/070618)。
图1中示出了在本发明中可利用的核酸检测装置的一个实施方式，但核酸检测装置并不限定于本实施方式。需要说明的是，在以下的说明中，对各构件赋予的符号与图1中所示的符号相对应。
图1的核酸检测装置10是使作为用于容纳核酸扩增反应的反应体系的反应体系容纳部的样品垫3、保持标记物质的结合垫2、在一部分包含能够与扩增产物中包含的结合部结合的部分6的多孔固相载体1、以及吸收垫4以彼此依次接触的方式配置在基材5上而形成的。固相载体1的部分6是局部地配置/固定有用于捕获扩增产物的机构(捕获机构)(例如，上述寡核苷酸等)的部分。虽然未图示，但固相载体1的表面可以被膜覆盖。样品垫3、结合垫2、固相载体1及吸收垫4可以通过具有能够用作上述固相载体的多孔结构的构件而构成。它们可以由相同的构件构成，也可以由不同的构件构成。基材5可以支撑在其上配置的各种构件，只要易于核酸检测装置的操作即可，例如，可以利用由树脂、金属、矿物等形成的构成。在将标记物质混合于展开溶液中的情况、标记部为标记物质的情况下，可以省略结合垫2。
将核酸扩增反应的反应体系添加于样品垫3。可以直接添加上述反应体系，也可以和适当的展开溶液(例如，磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、SSC缓冲液)一起添加。展开溶液中可以根据需要进一步包含表面活性剂、盐、蛋白质、核酸等。添加于样品垫3的上述反应体系通过毛细现象而沿图1中的箭头所示的方向从上游向下游展开。
另外，作为其它方式，也可以通过将该核酸检测装置放入保持有核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的容器(例如，PCR管、Eppendorf管、96孔板等)、并使样品垫3浸渍于核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的方法而进行展开。在该情况下，样品垫3的宽度优选设为2.0～10.0mm、更优选设为2.0～5.0mm，以便将样品垫3放入保持有核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的容器。
在上述标记部为标记用标签的实施方式中，反应体系中的扩增产物通过保持有标记物质的结合垫2时，与标记物质接触，经由标记用标签被标记物质所标记。
接着，反应体系中的扩增产物通过固相载体1时，与固定于部分6的捕获机构接触，经由固定化用标签而被捕获/结合于固相载体1。
在存在扩增产物的情况下，与被捕获/结合于包含捕获机构的固相载体1的部分6的扩增产物结合的标记物质在部分6被检测。如果标记物质能够肉眼观察确认，则由于标记物质而使部分6显色。以该标记物质的检测(显色)的有无作为指标，可以判断试样中的扩增产物的有无。
＜使用了用于检测对C28株特异性的指标碱基序列的引物组的对于大环内酯类抗生素的敏感性的判定方法＞
使用包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组，可以判定抗酸菌、特别是属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌对大环内酯类抗生素的敏感性。
该判定方法例如包括：
以判定对象的抗酸菌的基因组DNA或由判定对象的抗酸菌的基因组DNA诱导得到的多核苷酸作为模板，使用包含上述第1引物及第2引物的上述第三实施方式的引物组进行核酸扩增反应；
检测由上述核酸扩增反应得到的扩增产物；以及
在检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌具有对大环内酯类抗生素的敏感性，在未检测到上述扩增产物的情况下，判定上述抗酸菌不具有对大环内酯类抗生素的敏感性。
上述判定方法中的核酸扩增反应及扩增产物的检测可以与上述同样地进行。
＜抗酸菌的erm(41)基因型的判定方法2＞
本发明的第四实施方式涉及一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
在判定对象的上述抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，在上述erm(41)基因的上述碱基为胸腺嘧啶时，所述指标碱基序列存在于基因组DNA的上述erm(41)基因以外的区域，在上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶时不存在所述指标碱基序列，
检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胸腺嘧啶，
未检测到上述指标碱基序列表明上述抗酸菌的基因组DNA中的上述erm(41)基因的上述碱基为胞嘧啶。
实施例
脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacteroides abscessus complex)的标准株的基因组信息由NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacteroides abscessus complex)的临床分离株及购买株(下述表5所示菌株)的基因组信息分别利用下一代测序仪(MiSeq(illumina))对由单纯培养的菌体而制备的DNA进行分析来获得。以这些基因组信息为基础，对具有erm(41)基因正常型(T28)的菌株(T28株)和具有erm(41)基因突变型(C28)的菌株(C28株)进行了分子系统发育分析，结果发现，T28株和C28株在分子系统发育上可以分类为2个不同的组。另外，使用Mauve软件(Darling等(2005))进行核酸序列的比对，进行了比较分析，结果发现了具有对C28株特异性高度保守的序列号2的插入碱基序列。
有时将序列号2的碱基序列称为“插入碱基序列”。
＜实施例1＞
作为与序列号2的插入碱基序列特异性杂交的引物组，设计了C28-f引物及C28-r引物。各引物的序列示于表2。使用设计的引物组进行PCR，通过核酸色谱法对核酸扩增产物进行分析，由此验证了能否特异性地检测C28株。
(I)引物的结构
为了应对利用核酸色谱法的检测，经由将包含抑制聚合酶反应的偶氮苯结构的上述式I所表示的二价基团，将由以下的标签序列构成的DNA连接于各引物的5’末端。此时，上述式I所示的包含偶氮苯的结构的二价基团的5’端与由标签序列构成的DNA的3’末端的核苷酸的磷酸基形成磷酸酯键，该二价基团的3’端的磷酸基与上述引物的引物部分的5’末端的核苷酸的脱氧核糖的5’位羟基形成磷酸酯键。
在由序列号12的碱基序列构成的C28-f引物的5’末端经由偶氮苯结构添加了由序列号15的碱基序列构成的固定化用标签1。在由序列号13的碱基序列构成的C28-r引物的5’末端同样地添加了由序列号14的碱基序列构成的标记用标签1。
使用分别添加了标签的C28-f引物及C28-r引物的组合作为第1引物组。
序列号12的碱基序列为序列号2的第4634位～第4658位的部分碱基序列，为序列号7的第581位～第605位的部分碱基序列。
序列号13的碱基序列为序列号2的第4704位～第4730位的部分碱基序列的互补碱基序列，为序列号7的第651位～第677位的部分碱基序列的互补碱基序列。
表2
名称 序列 序列号
C28-f TCCTCGGAATCGGCACTGTCCGTTG 12
C28-r TACAGCAGCTCAACAGTGACACCGAAG 13
标记用标1 TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG 14
固定化用标签1 TGCATCGAGTGACAGCTAATGTGTGAT 15
(II)寡核苷酸结合金胶体的制作
将金胶体(Gold Colloid，40nm，9.0×1010(粒子数/ml)、British BiocellInternational公司制)与具有表3的序列号16的碱基序列的含硫醇基寡核苷酸混合，在50℃下孵育16小时。以6000rpm离心分离15分钟，去除上清，添加0.05M氯化钠、5mM磷酸缓冲液(pH7)并混和后，再次在50℃下孵育40小时。
在孵育后进行离心分离(6000rpm、15分钟)，去除上清，添加了5mM磷酸缓冲液(pH7)。再次进行该缓冲液置换。
通过以上的操作，制备了寡核苷酸结合金胶体。
将制备的寡核苷酸结合金胶体的悬浮液均匀地添加于玻璃纤维制垫之后，利用真空干燥机使其干燥，制成了结合垫。
(含硫醇基寡核苷酸)
含硫醇基寡核苷酸是由序列号16的碱基序列构成的寡核苷酸的3’末端的3’位磷酸基与HO-(CH2)m-SH(m为6)所表示的化合物的羟基通过磷酸酯键键合而成的。
(III)固定化有标签捕获机构的膜的制作
作为标签捕获机构，使用分配器将包含由序列号17的碱基序列构成的寡核苷酸探针1的溶液以与展开方向正交的宽度1mm的线状涂布于Merck Millipore公司制硝酸纤维素膜(Hi-Flow180)。然后，在40℃下干燥30分钟，从而制成了具备标签捕获机构的膜。将涂布有序列号17的寡核苷酸探针1的线设定为T1线。
表3
名称 序列 序列号
含硫醇基寡核苷酸 CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA-SH 16
寡核苷酸探针1 ATCACACATTAGCTGTCACTCGATGCA 17
(IV)核酸检测装置的制作
按照图1的示意图所示的检测装置制作了核酸检测装置。
即，将作为基材5的聚丙烯制背板(Lohmann公司)、作为结合垫2的上述(II)中制作的结合垫、上述(III)中制作的在部分6具备作为标签捕获机构的寡核苷酸探针1的膜(固相载体)1、作为样品垫3的玻璃纤维制的样品垫、作为吸收垫4的纤维素制的吸收垫分别如图1所示相互重合地贴合，制作了核酸检测装置10。
(V)PCR
使用上述(I)中记载的添加有标签的第1引物组，按照TaKaRa TaqHS perfect Mix的手册制备了下述的PCR用反应液。
表4
2x TaKaRa TaqHS perfect Mix 10.0μl
第1引物组
5μM正向引物(序列号12) 0.5μl
5μM反向引物(序列号13) 0.5μl
模板DNA(1ng/μl) 1.0μl
灭菌蒸馏水 8.0μl
作为模板DNA，使用由表5所示的抗酸菌株(Mycobacteroides abscessus complex及其它抗酸菌的临床分离株、购买株、相关的抗酸菌株)纯化得到的DNA。作为阴性对照，使用了灭菌蒸馏水1μL来代替上述模板DNA溶液，除此以外，制备了相同组成的PCR反应液。5μMFw引物溶液及5μM Rv引物溶液是以使给定的引物达到5μM浓度的方式溶解于灭菌蒸馏水中而成的。
将PCR反应液设置于PCR装置(Bioer公司、LifeEco)，在94℃下反应1分钟后，重复35次94℃-5秒/62℃-10秒/72℃-5秒的循环。
需要说明的是，如上所述，对于试验所使用的Mycobacteroides abscessuscomplex的各菌株，通过测序分析辨别是T28株还是C28株。
(VI)使用了核酸色谱法检测体系的检测
将上述条件下PCR后的反应液应用于上述核酸检测装置10，尝试了核酸扩增产物的检测。具体而言，在上述设备10上的样品垫3添加PCR后的反应液5μL，进一步添加80μL的展开溶液(配合有表面活性剂的柠檬酸缓冲液)，由此展开了反应液。在室温下10分钟后，通过肉眼观察确认了包含固定成膜1上的线状的标签捕获机构的部分6的T1线有无着色。
在确认到T1线着色的情况下，表明模板DNA中包含对C28株特异性存在的序列号2所示的插入碱基序列，表示得到了来自C28株的核酸扩增产物。
将结果示于表5(表5-1及表5-2)、图2。在表5中，将能够确认到着色的情况表示为“+”，将无法确认到的情况表示为“－”。
表5-1
Figure BDA0003866506700000531
表5-2
Figure BDA0003866506700000541
试验的结果是构建的色谱法检测体系能够特异性地检测Mycobacteroidesabscessus complex的erm(41)基因的第28位为胞嘧啶的菌株(C28株)，确认了与T28株、其它抗酸菌种没有交叉反应。
＜实施例2＞
以对C28株的基因组DNA特异性地存在的序列号2的插入碱基序列的序列信息作为基础，设计了特异性检测C28株的引物。以与插入碱基序列中的部分碱基序列特异性杂交、并且在样本中包含来自于C28株的DNA的情况下发生核酸扩增反应的方式设计了各引物。使用设计的引物进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法对核酸扩增产物进行分析，由此验证了能够特异性地检测C28株。
表6
Figure BDA0003866506700000551
(I)PCR
分别使用由表6中记载的序列号18及19构成的第2引物组、由序列号20及21构成的第3引物组、由序列号22及23构成的第4引物组、由序列号24及25构成的第5引物组、由序列号26及27构成的第6引物组、由序列号28及29构成的第7引物组，按照TaKaRa TaqHSperfect Mix的手册制备了下述的PCR用反应液。
表7
2x TaKaRa TaqHS perfect Mix 10.0ul
第2～7引物组
5μM正向引物 0.5μl
5μM反向引物 0.5μl
模板DNA(1ng/μl) 1.0μl
灭菌蒸馏水 8.0μl
作为模板DNA，使用了由Mycobacteroides abscessus ATCC19977及Mycobacteroides abscessus LRC18036分别制备的纯化基因组DNA。Mycobacteroidesabscessus ATCC19977为T28株，Mycobacteroides abscessus LRC18036为C28株。根据碱基序列信息，使用第2引物组以Mycobacteroides abscessus LRC18036的基因组DNA作为模板实施PCR时，推测可以特异性地得到336bp的区域作为核酸扩增产物。使用第3引物组同样地实施PCR时，推测可以特异性地得到940bp的区域作为核酸扩增产物。使用第4引物组同样地实施PCR时，推测可以特异性地得到1040bp的区域作为核酸扩增产物。使用第5引物组同样地实施PCR时，推测可以特异性地得到51bp的区域作为核酸扩增产物。使用第6引物组同样地实施PCR时，推测可以特异性地得到479bp的区域作为核酸扩增产物。使用第7引物组同样地实施PCR时，推测可以特异性地得到698bp的区域作为核酸扩增产物。另一方面，以作为T28株的Mycobacteroides abscessus ATCC19977的基因组DNA作为模板实施PCR时，推测使用第2～第7引物组中的任意引物组也无法得到核酸扩增产物。
作为阴性对照，使用了灭菌蒸馏水1μL来代替上述模板DNA溶液，除此以外，制备了相同组成的PCR反应液。5μM Fw引物溶液及5μM Rv引物溶液使用了以使给定的引物为5μM浓度的方式溶解在灭菌蒸馏水中而成的溶液。
将PCR反应液设置于PCR装置(Bioer公司、LifeEco)，在94℃下反应1分钟后，重复35次94℃-5秒/62℃-10秒/72℃-5秒的循环。将反应后的PCR反应液供于琼脂糖凝胶电泳分析，检测了有无核酸扩增产物。将结果示于图3。在图3中，A示出了使用第2引物组、B示出了使用第3引物组、C示出了使用第4引物组、D示出了使用第5引物组、E示出了使用第6引物组、F示出了使用第7引物组的PCR的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测而得到的结果。
试验的结果是，即使在使用了任意引物组的情况下，仅在样本中包含来自于Mycobacteroides abscessus complex的C28株(Mycobacteroides abscessus LRC18036)的DNA时可通过琼脂糖凝胶电泳分析确认到特异性的核酸扩增产物。根据该结果可以确认，通过检测有无序列号2所示的插入碱基序列，能够特异性地检测C28株。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用而导入本说明书。
序列表
<110> 国立感染症研究所所长代表的日本国(JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES)
株式会社钟化(Kaneka Corporation)
<120> 判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针
<130> B190585
<150> JP 2020-066277
<151> 2020-04-01
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 1
gtgtccggcc aacggtcgcg acgccagtgg ggctggtatc cgctcactga tgactgggcg 60
gcgcggatcg tcgccgaatc cggtgttcgc tcaggggagt tcgttgtgga tctgggcgca 120
ggacacggcg cgctgacggc acatctggtt gccgctggtg ccagggtgct agccgtcgag 180
ctgcatccgg ggcgggctcg acaccttcgt tcacggtttg ccgaggaaga tgtccggata 240
gcggaagcgg acctgctcgc cttccggtgg ccgcgacggc catttcgggt ggtggcgagc 300
ccgccctacc aagtcaccag cgcactgata cggagtctct tgacgccgga atcccggctg 360
ctggctgccg acctggtgct gcagcgcggg gctgtgcaca aacatgcgaa gcgagcacct 420
gttcgccatt ggacgctacg ggccggaatc acattgccgc gaagcgcttt ccatcatcca 480
ccgcaggtgg attcgtcggt gctggtgatc aggcggcgct ga 522
<210> 2
<211> 8336
<212> DNA
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aaggcggcgc gggtggcacc gctcagaacc tgcgtgcgct gatggcccag aaccaaaaag 2460
gtaggagaat gccgccgtgc gggaggacga acgtttaggc ggcggcttgc aagcgccggc 2520
tgctggaggc ttcccataag gccgctctgg gggcctctct caagaaccgg gcatcatttg 2580
acctgcgata atgatcaatc ggttggtggg tgtcggtcat agccgtcata gtggacgcag 2640
atacgatggt gcaatcgagg atctgagaaa ggagttccgc cgtgaccgtc acagagactg 2700
cgtgtgaagt agtggagttg acctcagatg aaggtgccga gttgttcgac agcatcgctc 2760
agaacaacat gggcatcaca ggggcggagt ttgtgcgacg ttggaacgca ggggaatttg 2820
aagggatcaa ctgggacgac gttccagggc tgacgtcggt cgcgacggcg ctgcctttcg 2880
caggcatctg agagacacgt ttgccaaagt gcctggtcgc acccctcacg acgcgatccg 2940
taattacata gatccgcttc aacaggcggt ttcatgttta gggtgcgcca agatccaact 3000
ttcacaaacg cccaagaggt acggcgaatt cggagcatgg atcctcaacg ggggcaacgg 3060
aatggtgctc cgaggattcg gtaagttcta cgccacccag cggtttgagt tagttcctac 3120
gacagcggat ctgcacgatg ctcctgaaaa ggagcccttt cgggtttcga cgcgcgaata 3180
tatctaccga ctcgaaattg ctaatgagag tcatgtcatc gaatggcact ggcacccggt 3240
agggaacagc gacgagcggc gcccccacat ccaccctgca atcaaccggg atgcgcatct 3300
ccccggtccc cgggtggtgc tggaagacgt aatagagggc tgtatcgcac taggcgcgac 3360
acctgcctgc gaggactgga aagagcggct agccgccagc ggtggcgtcc acaagctgta 3420
caggacatgg gtccacgagc ctggcgatct aaagaagcct gcagtaaaag aggactagct 3480
agctttcacg tggtcccgaa cttgggacgc gtgagcgcca agagccgctg aggccgccgg 3540
gagagggcca catcgcacca gcagccggtt tcaccttccg tggatcgtgt tggtggcgaa 3600
taaaaaacgg gatttcagtg acggttgggt gttgaaaaca aattggggca gggggggcgt 3660
ttgcctaagc catgaggggc gggcgccgga cccctcgggt tcactccccc ggggggtcgt 3720
cgtggagtgc ggcttgtccg aggcgctcga cgtagccgct gacggtgggc agcactggcc 3780
gaaatccgca gcgggccacg tgccaggcgt cgcgcagatc agacttgttc ttggcgcggg 3840
cggcgacgat gcgtgcagcg gaggcatcgc cgttagggat caacgtgtgg gcgcggtcgc 3900
caccgatccc ggcagattgc agcagcgcgc cgagtccttc gacggcgtag ccgaatcgtt 3960
cgcgcgccac gagggcttcg gaccatgcga tgacggcttt cggtccggcc ttggtgatcg 4020
tcggcccgtc gttgaggtca tcggtcggga tcacttcagc ggcagcttca agcgaattag 4080
cgtatggttc aagggattta gaccactggg ccaatatggt gtcggcgtga gcgttgagcg 4140
cctcaccgat cgtgcgcccc tcctcgtcct tggcggcgcg gtctaggccg agctgcgcaa 4200
gcatgtggtc aagaaggtgg ccggttacca cagggtcagc gtggtaatcc tggtccttct 4260
tcatgcagct gagcacggag tacctgaggg cgtccgcgct gccagcaccg atctgcgcct 4320
tctcgaccaa cgctcgggcc gaggccacag cctctacgaa tggatcgggc agcggaattt 4380
caaggcgttc ggcggcgcgt tgcacctgga cgaggtagga acgggttgtg gcggtgtaga 4440
cggacatgtg tttgtctcct agtagttttc gttgaaagcg atttcgccgg ttagggcttc 4500
gcgcaggaag ttgatttcga cttgacgcgg gtgtttccgg ggccggtgat tgttgccctc 4560
gcccggtacg tagttggacg attcaggctg cggtgcggga ggagtgccga ggcgttcgta 4620
aagacgctta aggtcctcgg aatcggcact gtccgttgcg gtctcgtcgc cacgcagtcg 4680
ccgtagcaga tcggtggcag gggcttcggt gtcactgttg agctgctgta gcacctgctt 4740
ccagtcgggt ttatccatgt ggttcttgcc tttcgtcgaa gatccagcgc ccgccgactt 4800
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cagccctttg ttgcactgtc tccaattctg ctcccgccgt ttcggggtgt ccagaaacct 4920
gtccgctatc ggacacactg cgctgcaacg cttcccatgt tcgatgcaag gccggtggga 4980
tcggggtgcc ttggcggcga cggcgcgcta gttcctcccc gagcacccat gcggcggtgc 5040
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ctgtcgtgct catgccgccc ccgtcgcctc gtcctggccg tctttggtgg tgatttcctg 5160
cttctttcgc ggcgggtacg agttgaccac cacggcggcg gtaaccccga gcggccgctg 5220
ctcgtgcggc agggaatcga accactcccg gcacgaggcc agcgcagggc attggcggca 5280
tatccgcgtc gctgcctggc gggcgtagtc gcgctcgtcc agggcgcctc ggccatcgcc 5340
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cggttctccc tccctgggct tgcgcccagc tgacgtgacg cgggcagggc ttgagtccgt 5700
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ggcagctctc acccacccag gcatcaggtg cgatgtgcgc gtgcttggcg caacgcgtcc 5880
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ccgggtcgtc aagttccgta cccccataac gcaaccccct cttttgatgt ggtcctgatg 6000
tggtgggggg caccgccgtg cgggtcaaag aggcaccgcc gtacgggcta tcggaccgtt 6060
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gctgggccaa cgtcagggcc ttggccccga gaacataatc gcgccagtca cggcgctgct 6420
ctggcgtcac ggtaagccgc cctgtgcgtc agcaggcaat gcacggcttc ggctagcgcg 6480
cacgctggcg tgcaactggg ccgcgcgatg cacgtcgcag cgcacaacag ggcgcacacc 6540
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aagcccgccg cccaatggtg cccgtgcgca ctcacgcaga ggcatcgcgc tccaccgcgt 6660
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gatggttggt tgcagcggct cccgcccgac gttgccgcgt cggggactac gggggccgtt 7260
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ttcggaacca ccttgccatc ccgaataatg catggcgaca agggaaccca cggctcttgc 7440
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tgtactcgtt gatctgcctg tcagtgctga atcggcgctt accaatcctc acgctggcga 7560
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cacgcagaca tccgataagt tgcgtttctg cgactcaata gataccaggc ggatggcaat 7740
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accccggccc gtattccgat tcggtggaat ttctacctga acgagaagtt ccggaattcg 8100
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tcgaaatgta cgacagaatg attcgcgaat tgtggcaaca aatcgagggt aacgag 8336
<210> 3
<211> 128
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 3
cgcatacgtt agagccattg gggcgcattg ctttacatcg gtttcatact gctgtgttcg 60
tactcgtacg ctagtgttca gctgcgtttg tatcaggaaa gtggcgacac gggagtcata 120
tctccttt 128
<210> 4
<211> 2237
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 4
gtcaagcttt cgatgatgtt gggcaccccg gcaccacatg atcgttcgtg atcgagtaca 60
ggtaccagtt atcggttttg cggagctcca cagtggcctc ggaggcaaag ggttttgggt 120
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tgtaaatcct gccctgcgat tcgtcagctt tctgaactgt tccgagttcg tgtaccgcgt 300
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ggctttagcg accttctcgg cggcatcagc cttatcgccc agatctacac gcgtcttgcc 1680
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tgctggtccc acccggcacg taagttttcc attgctgagc cgaccacccc tggccagcga 2040
gaagctaatt cggtcaggtc cgcatcgtgg ccgatgtggt cctggcggtg cgtctccaca 2100
tggtccaaca gcttgttggc ctgcctgtgc agcaactccg ggtcgaatct caacggctcg 2160
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<210> 5
<211> 1208
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 5
gcgcgatgag acaggtcacc cgtgccgtta ctgccaaggc ggcgcgggtg gcaccgctca 60
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tctgggggcc tctctcaaga accgggcatc atttgacctg cgataatgat caatcggttg 240
gtgggtgtcg gtcatagccg tcatagtgga cgcagatacg atggtgcaat cgaggatctg 300
agaaaggagt tccgccgtga ccgtcacaga gactgcgtgt gaagtagtgg agttgacctc 360
agatgaaggt gccgagttgt tcgacagcat cgctcagaac aacatgggca tcacaggggc 420
ggagtttgtg cgacgttgga acgcagggga atttgaaggg atcaactggg acgacgttcc 480
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aaagtgcctg gtcgcacccc tcacgacgcg atccgtaatt acatagatcc gcttcaacag 600
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gacgtaatag agggctgtat cgcactaggc gcgacacctg cctgcgagga ctggaaagag 1020
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gatctaaaga agcctgcagt aaaagaggac tagctagctt tcacgtggtc ccgaacttgg 1140
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cggtttca 1208
<210> 6
<211> 480
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 6
ccttccgtgg atcgtgttgg tggcgaataa aaaacgggat ttcagtgacg gttgggtgtt 60
gaaaacaaat tggggcaggg ggggcgtttg cctaagccat gaggggcggg cgccggaccc 120
ctcgggttca ctcccccggg gggtcgtcgt ggagtgcggc ttgtccgagg cgctcgacgt 180
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
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cttcagcggc agcttcaagc gaattagcgt atggttcaag ggatttagac cactgggcca 60
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<212> DNA
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<400> 8
ggctgcgctg tcgtgctcat gccgcccccg tcgcctcgtc ctggccgtct ttggtggtga 60
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agcatctgtt tcgttgagtg cttgtgcggc agcccaattg ccgtgtcgtg ggcagtcggt 420
gaggttgtcc aggcgcccgt agtcgtcaca gtgtgggcag ttgcgtatct gccggatcgc 480
ttcgcggcgg gtgttggcgc gctcgcgtgt cttgcggcag tgtgcgcagt agcggcagga 540
catcaggcgg ttctccctcc ctgggcttgc gcccagctga cgtgacgcgg gcagggcttg 600
agtccgtcat cgacttcgat ccggcccaag tcgtcgcaat ccgggcagtc ccgaatcacc 660
tgcacggctg cgcgtttgcg ttcggcctcc gacgccgtgg cagccttgcg cagcgctgcg 720
cagtcgcggc agctctcacc cacccaggca tcaggtgcga tgtgcgcgtg cttggcgcaa 780
cgcgtccccg tctcattgcc gttagctgat tgccgccctc ggctggcggg ggtgatcgcg 840
taggcgtccg ggtcgtcaag ttccgtaccc ccataacgca accccctctt ttgatgtggt 900
cctgatgtgg tggggggcac cgccgtgcgg gtcaaagagg caccgccgta cgggctatcg 960
gaccgttgac ccgcaccgct gtgcgggctt tggctgtttt gacccgcacg gccatgcggg 1020
gtatcaccgt tttgacccgc accgccatgc ggggtatttg cgatcggaac cagccgatac 1080
acggcggcat gacgcttgaa tccgtttgct gtgcgctgga tgagccccag ctcgcggcct 1140
cgcttgagcg ccgtttccac agcccgttcg gtgagcccgc atttccgcat gagcccttct 1200
attccaggcc gcgcgttggt gccgtccgcg tagtcggcga acgtctcaag cgccaggaga 1260
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<400> 9
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<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 10
ccaacaagcc cgccgcccaa tggtgcccgt gcgcactcac gcagaggcat cgcgctccac 60
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gattccttag agcccatgtt catccactgg tcagcatgtg aggcttgagc tgggatcggc 360
acatgcgcga accggatacc agcttgatgc gtctcgatat cgagggtgat cttgaaaagg 420
agactcaacg ctgcgttgtc ggcctgactc gtggcccgcc atggcgtgac cccagccgcc 480
gccaactcct cggcgcgctc caactgcgct acccagtcag ccggtagtcg atcaaccaag 540
tcacgccatg tccgggtgtc gtcgccaaat tcgatctgta ccatgagatt tacctacttt 600
ctgttgatgg ttggttgcag cggctcccgc ccgacgttgc cgcgtcgggg actacggggg 660
ccgttggcat agccgaactt gtgccgacga gctgaacttg tgcgcgatat tcgcgcttgg 720
ccccgtcagc gtcggtcacg gtcaccgtga tcacatcgcc ctcggcctcc acgctggccg 780
tggaattcgg aaccaccttg ccatcccgaa taatgcatgg cgacaaggga acccacggct 840
cttgcgctag ccgcgccgcg atcctgtacg cctcgatact cacgccgcgc ct 892
<210> 11
<211> 849
<212> DNA
<213> 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 11
tcaagcttgg cgatgtactc gttgatctgc ctgtcagtgc tgaatcggcg cttaccaatc 60
ctcacgctgg cgagggcacc agagtgccag agctggaaca ccagcgttct gctgatacct 120
ccgagctttg cccccactgc cttgtggtcg tgcattgcgt cctcctccgt tcatggctgc 180
ttgtgcgttc aaacacgcag acatccgata agttgcgttt ctgcgactca atagatacca 240
ggcggatggc aatgaacgca agcagtgcat atcctgcgtg tcatgacgca atcagggccg 300
aaaaggccga gttggacgga acggccgccc gacagctggg cggaacgtga agcgcataga 360
ttggcgcgcg aggtttaccg gcttcgcgga aagaggtcag cgcagtggct tgcggctcgg 420
accaaggaac tcggccacga agtatcccgt tcggtgattt ccgatttgga gaatgggcga 480
cgtaggtatg tcacgaccgc tgagctagta atactcgctg ccgcactcga tacgtcccca 540
gtaacgctga tgtaccccgg cccgtattcc gattcggtgg aatttctacc tgaacgagaa 600
gttccggaat tcgatgcagc gcagtggttt tcggcaaacg ggtggtcgca agagctagcg 660
agtgcgttcg acggcgattt cggatttgct tggcgcacag atcagcttcg ccaatggcga 720
cgcctggcgg aattggaaga tgcccgcgcc cgcgtgacgg cgcgagccga acttgaccgt 780
gaccgcgatc aaatcgaaat gtacgacaga atgattcgcg aattgtggca acaaatcgag 840
ggtaacgag 849
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> C28-f 引物
<400> 12
tcctcggaat cggcactgtc cgttg 25
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> C28-r 引物
<400> 13
tacagcagct caacagtgac accgaag 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 14
tggcaacatt tttcactggg tttatag 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 15
tgcatcgagt gacagctaat gtgtgat 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 16
ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 17
atcacacatt agctgtcact cgatgca 27
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 1-C28-1f 引物
<400> 18
gcgcgatgag acaggtcacc cg 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 1-C28-1r 引物
<400> 19
gcagtctctg tgacggtcac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 1-C28-2f 引物
<400> 20
gacgcagata cgatggtgca 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 1-C28-2r 引物
<400> 21
tgaaaccggc tgctggtgcg atgtg 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 2-C28-1f 引物
<400> 22
cttcagcggc agcttcaagc 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 2-C28-1r 引物
<400> 23
ttgcacccaa tgcgccacgg gag 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 3-C28-1f 引物
<400> 24
cgcaccgtga cgcacaactc g 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 3-C28-1r 引物
<400> 25
tcggctgccc gatgggcctg 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 4-C28-1f 引物
<400> 26
tcaagcttgg cgatgtactc gtt 23
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 4-C28-1r 引物
<400> 27
cgcccattct ccaaatcgga aatcac 26
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 4-C28-2f 引物
<400> 28
gcattgcgtc ctcctccgtt catgg 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 4-C28-2r 引物
<400> 29
ctcgttaccc tcgatttgtt gccac 25
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T28-1f 引物
<400> 30
gatgagtgcg cccgaag 17
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T28-1r 引物
<400> 31
tctactcgtc gccgcttg 18

Claims (13)

1.一种判定属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基是胞嘧啶还是胸腺嘧啶的方法，该方法包括：
在判定对象的所述抗酸菌的基因组DNA中检测指标碱基序列，在所述erm(41)基因的所述碱基为胞嘧啶时，所述指标碱基序列存在于基因组DNA的所述erm(41)基因以外的区域，在所述erm(41)基因的所述碱基为胸腺嘧啶时，所述指标碱基序列不存在，
检测到所述指标碱基序列表明所述抗酸菌的基因组DNA中的所述erm(41)基因的所述碱基为胞嘧啶，
未检测到所述指标碱基序列表明所述抗酸菌的基因组DNA中的所述erm(41)基因的所述碱基为胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与所述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
所述第1碱基序列在至少一部分中包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
4.一种引物组，其用于检测指标碱基序列，在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时，所述指标碱基序列存在于基因组DNA的所述erm(41)基因以外的区域，在所述第28位的碱基为胸腺嘧啶时，所述指标碱基序列不存在，
所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含在3’末端含有碱基序列f12的多核苷酸，所述碱基序列f12能够与所述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列f11的互补碱基序列杂交，
所述第2引物包含在3’末端含有碱基序列r12的多核苷酸，所述碱基序列r12能够与包含于所述指标碱基序列中、且位于比所述部分碱基序列f11的3’末端更靠近3’末端侧的连续10个碱基以上的部分碱基序列r11杂交。
5.根据权利要求4所述的引物组，其中，
所述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的第3碱基序列。
6.根据权利要求5所述的引物组，其中，
所述第3碱基序列中包含的从所述部分碱基序列f11的5’末端的碱基至部分碱基序列r11的3’末端的碱基的碱基序列至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列中包含的连续20个碱基以上的碱基序列。
7.根据权利要求5或6所述的引物组，其中，
所述部分碱基序列f11为
(f11-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(f11-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(f11-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列，
所述部分碱基序列r11为
(r11-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(r11-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(r11-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的引物组，其中，
所述第1引物及所述第2引物中的一者进一步包含作为能够与标记物质结合的标签或标记物质的标记部，另一者进一步包含作为能够与固相载体结合的标签的结合部。
9.一种试剂盒，其包含：
权利要求8所述的引物组、和
至少在一部分包含能够与所述结合部结合的部分的固相载体，
所述试剂盒用于检测指标碱基序列，在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时，所述指标碱基序列存在于基因组DNA的所述erm(41)基因以外的区域，在所述第28位的碱基为胸腺嘧啶时，所述指标碱基序列不存在。
10.一种探针，其用于检测指标碱基序列，在属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌中erm(41)基因的相当于序列号1的碱基序列的第28位的碱基为胞嘧啶时，所述指标碱基序列存在于基因组DNA的所述erm(41)基因以外的区域，在所述第28位的碱基为胸腺嘧啶时，所述指标碱基序列不存在，
所述探针包含多核苷酸，所述多核苷酸包含能够与所述指标碱基序列中包含的连续10个碱基以上的部分碱基序列p1杂交的碱基序列。
11.根据权利要求10所述的探针，其中，
所述指标碱基序列为序列号2的碱基序列中包含的连续10个碱基以上的第1碱基序列、或与所述第1碱基序列互补的第2碱基序列。
12.根据权利要求11所述的探针，其中，
所述部分碱基序列p1至少在一部分包含序列号3、5、7、9或11的碱基序列、或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
13.根据权利要求11或12所述的探针，其中，
所述部分碱基序列p1为
(p1-12-1)序列号2的碱基序列的第4624～4668位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-18-1)序列号2的碱基序列的第2356～2397位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-20-1)序列号2的碱基序列的第2624～2663位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-22-1)序列号2的碱基序列的第4044～4083位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-24-1)序列号2的碱基序列的第6535～6575位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-26-1)序列号2的碱基序列的第7478～7520位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-28-1)序列号2的碱基序列的第7629～7673位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-13-1)序列号2的碱基序列的第4694～4740位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-19-1)序列号2的碱基序列的第2672～2711位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-21-1)序列号2的碱基序列的第3539～3583位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-23-1)序列号2的碱基序列的第5061～5103位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-25-1)序列号2的碱基序列的第6566～6605位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、
(p1-27-1)序列号2的碱基序列的第7931～7976位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列、或
(p1-29-1)序列号2的碱基序列的第8302～8346位范围的碱基序列或其互补碱基序列中包含的连续10个碱基以上的碱基序列。
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