JPH08510386A - ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サルモネラ菌種の検出および同定のための核酸分子、ＤＮＡに基づく検出システムにおけるプローブまたはプライマーとして、本発明に係る核酸分子を使用する、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型の検出方法、および本発明を実施するためのキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 化合物 本発明は、サルモネラ菌種の検出および同定に関する。 サルモネラ症は、最近の２０年間に幾つかの西欧諸国で著しく増加している。 一般に、ヒト集団は汚染された食品および水を介してサルモネラ菌（Salmonella ）に感染するが、伝染は、僅かな程度で、感染動物との直接的接触によって起こ る。食品中のSalmonellaの検出には、標準的培養方法が今も広く用いられている が、感染の防御は、一次動物生産物、異なる食品加工段階および最終食品製品を モニターするための迅速かつ正確な診断試験の利用可能性に益々左右される。こ の目的のために、Salmonella検出の幾つかの迅速な方法が開発された。 これらの方法としては、多価の体細胞性抗体（somatic antibody）または鞭毛 性抗体（flagellar antibody）を用いた酵素免疫アッセイ（Krysinski，E.P.and Heimsch，R．C．（1977）Applied and Environmental Microbiology 33，947- 954；Minnich，S.A.，Hartman，P.A．and Heimsch,R．C．（1982）Applied and Environmental Microbiology 43，877-833；Rigby，C.E．（1983）Applied and Environmental Microbiology 47，1327-1330）；モノクローナル抗体を用いた 酵素免疫アッセイ（Mattingly，J.A．（1984）Journal of Immunological Metho ds 73，147-156）；ＤＮＡポリヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡハイブリ ッド化アッセイ（Fitts，R.，Diamond，M.，Hamilton，C.，and Neri，M.（1983 ）Applied and Environmental Microbiology 46，1146-1151）；Gopo，J.M.，M elis，E.，Filipska，E.，Meneveri，R．and Filipski，J．（1988）Molecular and Collular Probes 2，271-279；Tsen，H.Y.，Chen，M.H.，Shieh，J.S.，Wa ng,S.J．and Hu，N.T．（1989）Journal of Fermentation and Bioengenering 6 8 ，1-6；Scholl，D.R.，Kaufmann，C.，Jollick J.D.，York，C. K.，Goodrom，G.R.，and Charache，P．（1990）Journal of clinicalmicrobiol ogy 28，237-241；Olsen，J.E.，Aabo，S.，Nielsen，E.O.，and Nielsen，B.B ．（1991）APMIS 99，114-120）およびリボソームＲＮＡ遺伝子からのオリゴヌ クレオチドプローブを用いたＤＮＡハイブリッド化アッセイ（Wilson，S.G.，Ch an,S.，Deroo，M.，Vera-Garcia，M.，Jonson，A.，Lane，D.，and Halbert，D. N．（1990）Journal of Food Science 55，1394-1398）または単一コピー標的 配列（シークエンス）からのオリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡハイブ リッド化アッセイ（Tsen，H.Y.，Wang，S.J.，Roe，B.A.，Green，S.S．（1991 ）Applied Microbiology and Biotechnology 35，339-347）が挙げられる。 ポリメラーゼ鎖反応（PCR）は、鎌状赤血球貧血と関連する遺伝子変化を検出 するのに用いられており、また、食品由来の病原体、例えばマイコバクテリア菌 （Mycobacteria）、赤痢菌（Shigella）、ベロトキシン産生大腸菌（Verotoxinp roducing Escherichia coli）、エルシニア菌（Yersinia）、リステリア菌（Lis teria ）を検出するためのＰＣＲについて多数の報告が出版されている。最近、 免疫磁気（immunomgnetic）分離法（Lund，A.，Hellemann，A.L．& Vartdal，F ．（1988）Journal of Clinical Microbiology 26，2572-2575）と、バクテリア の純粋培養物におけるＰＣＲとを組み合わせた Salmonella 特異的検出方法が 出版された（Widjojoatmodjo，M.N.，Fluit，A.C.，Torensma，R.，Keller，B.H .Ｉ.，and Verhoef，J.（1991）European Journal of Clinical Microbiology a nd Infectious Diseases 10，935-938）。 上記J.E．Olsen et alの1991年刊行物には、Salmonella typhimurium（ネズミ チフス菌）LT2染色体の2.3 kbフラグメントを含むサルモネラ菌特異的ＤＮＡハ イブリッド化プローブが記載されている。このフラグメントは、6800のクローン を含有する S．typhimurium LT2 DNAのライブラリーをEcoRI/HindIIIエフラグ メントのショット-ガンクローニングにより調製することで産生された。上記2.3 kbフラグメント中の主要フラグメントの配列（シークエンス）は、図１に示さ れている（SEQ I.D．NO．1）。このものは、部分消化を採用したSau3Aでの2.3 k bフラグメントのエンドヌクレアーゼ制限産物で ある。これの特定領域は、Salmonella菌種の同定に使用されるプライマーおよび プローブを提供する。 本発明は、Salmonella tyPhimurium LT2からの上記ゲノムＤＮＡの特定フラグ メント（または同じ塩基配列を有した対応する核酸フラグメント、例えばＲＮＡ 、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等）を、ＰＣＲおよび他の増幅システムにおけるプラ イマーとして使用すること、特にサルモネラ菌種において高度に保存されるゲノ ムの領域に対応する特定フラグメントを使用することに基づいている。このこと は、サルモネラ菌からの標的核酸配列を選択的に増幅し、従って検出するのを可 能にする。保存領域に対応するフラグメントは、サルモネラ菌種の検出および同 定に有用である一方、保存性の低い領域からのフラグメントは、s．typhimurium を含む血清グループＢからの感染、あるいは S．typhimuriumそれ自体の同定に 有用であり、全く独特なフラグメントは、S．typhimurium LT2を同定するために 使用できる。これらフラグメントはハイブリッド化プローブとしても使用できる 。これらフラグメントに対応するＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドはまた、以 下に説明するように使用することができる。 最近、核酸に基づく検出方法が急増しており、これら方法は標的生物からのＤ ＮＡまたはＲＮＡの検出に利用可能である。有用な概論は、M.J.Wolcott の論 文J．Food Protection 54，（5），pp．387-401，1991に見出される。典型的な 技術としては、ハイブリッド化プローブによる固相捕獲、ＰＣＲ、Q-ベータ-レ プリカーゼ増幅、および自己維持配列複製（Self Sustained Sequence Replicat ion，3SR）が挙げられる。 本発明によれば、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型のＤＮＡまたはＲ ＮＡと選択的にハイブリッド化する、図１に示す配列（SEQ I．D．NO.1）の１本 鎖ＤＮＡ、およびそれと相補的なＤＮＡ配列、およびその類似体およびフラグメ ントが提供される。 上記で１本鎖ＤＮＡに関して用いた“相補的”なる用語は、問題のＤＮＡ配列 とマッチした塩基を有するＤＮＡ配列であって、オリエンテーションとは無関係 に前記配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含する。 上記で１本鎖ＤＮＡに関して用いた“類似体”なる用語は、対応するＲＮＡの みならず、化学的に修飾された形態の核酸、および変化した骨格鎖、例えばＰＮ Ａを有する分子（この骨格のリボース単位は他の単位、例えばアミノ酸またはペ プチドで置換されているが、塩基配列が保持されており、かつその分子は該ＤＮ Ａと同様にハイブリダイゼーションする）を包含する。 上記のように、前記ＤＮＡ配列の特定の領域は、高度に保存される。図２には 塩基1247〜1689の配列が示されており、多数のサルモネラ菌血清型で観察される 変異体が示されている。ST11（塩基1655〜1679）、ST14（塩基1367〜1390）およ びST15（塩基1251〜1274）と称する領域が完全に保存され、従って実質的に全て のサルモネラ菌血清型からのＤＮＡとハイブリダイゼーション可能であると信じ られることが認められる。 図１の配列（SEQ I.D．NO．1）の下記フラグメントが調査された。 更に三つのフラグメントが調査された。 ST5およびST8は、自然配列における図１の配列（SEQ I.D．NO．1）の端部延長 （flanking）領域からのものである。 ハイブリッド化は、勿論、種々の緊縮条件下で行うことができ、最大の選択性 のためには高緊縮条件、例えば65℃のハイブリッド化温度および６ｘ SSCの緩衝 強度が好適である。しかしながら、有用な情報が、より低い緊縮条件、例えば48 〜65℃の範囲のハイブリッド化温度および／または１〜４ SSCの範囲の緩衝強 度において得ることができる。ハイブリダイゼーションについて試験する際には 、実際のハイブリッド化段階を低緊縮条件下で、例えば45℃で行ない、次いでよ り高い緊縮緩衝液で洗浄することが好ましい場合がある。従って、ここで用いら れる‘高緊縮条件下でハイブリダイゼーションする’なる用語は、高緊縮洗浄条 件下でのハイブリッド化の保持を包含する。 高緊縮条件下でハイブリッド化する配列の最小塩基数は、約15である。保存さ れた領域ST11は36個の塩基を、ST14は26個の塩基を、ST15は30個の塩基を有する ことが分かる。従って、一般的に標的サルモネラ菌ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイ ブリッド化によるサルモネラ菌の同定において、増幅プライマーまたはハイブリ ッド化プローブの何れかとして使用するためには、ST11、ST14またはST15からの 少なくとも15個の連続塩基配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドを用いることが できる。最も信頼しうるハイブリッド化のためには、少なくとも20個の前記塩基 の配列が好ましい。このような保存配列は、他の結合ＤＮＡ（保存性が低いか、 または全くハイブリッド化しないものであってよい）を有しうることが認められ る。以下に論じるように、DIANA検出システムに使用するためには、ハイブリッ ド化配列は、有利には、例えばＤＮＡ結合タンパク質またはビオチン／ストレプ トアビジン等のような特異的結合パートナーを介して固体支持体と結合可能な、 非ハイブリッド化ＤＮＡ配列を担持することができる。 S．typhimuriumを含む一般的血清グループからのＤＮＡまたはＲＮＡとのハイ ブリダイゼーションに使用するためには、そのグループ内でのみ保存される配列 を含む本発明に係るオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。これ らフラグメントとしては、前記の配列ST22が挙げられる。 特に S．typhimuriumの同定に使用するためには、S．typhimurium菌株（スト レイン）に特異的な本発明に係るオリゴヌクレオチドフラグメント配列を用いる ことが可能である。 S．typhimurium LT2に特異的な本発明に係るオリゴヌクレオチド配列のフラグ メントは、この特別なストレインの検出に使用することができる。 大部分の場合に、検出しようとする標的ＤＮＡは２本鎖であること、およびこ れら鎖の何れか一方とのハイブリダイゼーションを同定のために使用しうること が認められる。従って、ハイブリッド化プローブとして使用するためには、図１ （SEQ I.D．NO．1）に由来する特定のオリゴヌクレオチドフラグメント、および その相補体の両者を用いることができる。 しかしながら、増幅に基づく検出方法は、より強力で高感度の同定手段を提供 し、この場合、オリゴヌクレオチドはプライマーとして機能する。このプライマ ーは、その３'-末端からの鎖延長を開始させる機能のみを有するので、増幅しよ うとする標的ＤＮＡ配列の一方の鎖の３'-端部とハイブリッド化させることが必 要であり；オリゴヌクレオチドがサルモネラ菌ＤＮＡのコード化鎖のフラグメン トである場合、これが標的サルモネラ菌ＤＮＡの相補的鎖とハイブリッド化する か、あるいはその逆である。 従って、本発明のもう一つの観点によれば、本発明に係る少なくとも一つの核 酸分子を、ＤＮＡに基づく検出システムにおけるプローブまたはプライマーとし て使用することを特徴とする、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型の検出 方法が提供される。 本発明により用いられる主な増幅技術は、ＰＣＲである。この場合、古典的Ｐ ＣＲでは、標的ＤＮＡの相対する鎖とハイブリッド化する二つのプライマーが必 要である。この要求を満たすように、本発明に係るオリゴヌクレオチドの対を選 択することが可能である。即ち、例えば、オリゴヌクレオチドST14およびST15は 、S．typhimurium ＤＮＡのコード化鎖から誘導され、標的ＤＮＡの相補的鎖と ハイブリッド化する一方で、ST11がこのコード化鎖とハイブリッド化する。従っ て、典型的なＰＣＲプライマー対はST14/ST11またはST15/ST11 からなることができる。後者の組み合わせは特に効果的であることが証明された 。 しかしながら、単一の特異的プライマーを用いて、標準配列またはテイルを標 的ＤＮＡに連結して、標準ＰＣＲプライマーのためのハイブリッド化部位を供給 することによって、ＰＣＲ検出を行うことも可能である。これは、標的２本鎖Ｄ ＮＡを既知の部位で制限し、こうして生成された付着性部位に標準配列を連結す ることにより達成することができる。このことは、保存配列の何れか一方の側に 好都合に配置された制限部位が存在するならば、標的２本鎖ＤＮＡがこのような 部位の一つにおいて開裂され、かつ標準配列と連結されうることを意味している 。これに次いで鎖を分離して、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによっ て、保存配列の何れかのオリエンテーションから増幅可能な形態のコード化鎖、 または相補的鎖を提供することができ、これら鎖の各々は、その３’端部から制 限部位で連結された配列に向かう鎖延長の開始に役立つ。このようなＰＣＲシス テムの一つは、いわゆるベクトレット（Vectorette）システムであり、この場合 、標準ＤＮＡとミスマッチした短い配列を有する設計されたオリゴヌクレオチド が、選択された制限部位で連結される。連結配列の後で選択された特異的プライ マーの１本鎖を延長した後、ミスマッチ配列に対応するプライマーは反対方向の 延長を開始するのに用いることができ、後続サイクルにおけるＰＣＲプライマー として用いることができる。 従って、好ましい配列ST11、ST14およびST15、またはそれらのフラグメントは 、図２に示す配列を有していてもよく、あるいはこれらと相補的であってもよい 。実際に、ST14およびST15と反対の意味で延長を指導するオリゴヌクレオチドST 11は、図２に示されたものと相補的な形態にある。 自己維持配列複製（Self-Sustained Sequence Peplication、3SR）方法におい て、標的ＲＮＡまたは１本鎖ＤＮＡを増幅する逆トランスクリプターゼの作用を 可能にするポリメラーゼ結合部位を担持するプローブ／プライマーが用いられる 。従って、この方法に使用するためには、本発明に係るＤＮＡオリゴヌクレオチ ドは、３'-末端にポリメラーゼ結合配列を担持している。従って、T7-ＲＮＡポ リメラーゼプロモーターのＤＮＡ配列は、標的特異的プライマーの一方または両 方に結合した翻訳開始のための配列に連結させることができる。このような配列 の 例は、 翻訳開始T7プロモーターである（Guatelli et al.，1990，Proc．Natl．Acad．s ci．USA，87，1874-1878）。 Q-ベータレプリカーゼ増幅システムにおいて、固定化プローブは、標的ＤＮＡ の一方の鎖を捕獲し、次いで、ＲＮＡ-指導性-ＲＮＡポリメラーゼ（通常は、Q- ベータレプリカーゼ）のためのMDV-1として知られている三次構造を鋳型領域と して担持するＲＮＡプローブでのハイブリッド化を生じさせる。捕獲プローブは ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従ってこの機能のためには、本発明に係る固定化Ｄ ＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントを使用できる。加えて、本発 明に係るＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３'-端部にMDV-1構造を有していてもよ い。 リガーゼ増幅反応（LAR）では、例えばT4リガーゼを用いた連結によって、鎖 分離後に、更なるハイブリッド化および連結のための鋳型として機能可能なより 長い配列が生成するように、二つのオリゴヌクレオチドプローブを、標的核酸上 の隣接位置とハイブリッド化させる。従って、ＬＡＲプローブとして、保存配列 、例えばST11、ST14またはST15の一つから、二つの隣接オリゴヌクレオチド配列 を用いることができ（一般的サルモネラ菌検出を提供するため）、あるいは本発 明に係る他のオリゴヌクレオチドを用いて、より特異的なサルモネラ菌検出、例 えばS．typhimurium検出を提供することができる。 ＤＩＡＮＡ診断システムにおいて、ＰＣＲは、第一サイクルシリーズにおける 標的核酸を増幅するための第一プライマー対である巣籠もり（nested）プライマ ーと、第二サイクルシリーズにおいて第一プライマー対の間でハイブリッド化す る第二プライマー対とを用いて行われる。第二サイクルに用いられる内部プライ マーは、それぞれ、増幅されたＤＮＡおよび標識の捕獲を可能にする結合手段、 または認識を可能にする標識の結合手段を有する。固定化手段は、例えばビオチ ンまたはジゴキシゲニンのようなハプテンであってよいが、シグナル結合手段は 、異なるハプテン、あるいは好ましい態様では、適切な標識を担うＤＮＡ結合タ ン パク質と結合可能な５'-非ハイブリッド化ＤＮＡ配列を含むことができる。固定 化手段はまた、５'-非ハイブリッド化ＤＮＡ配列を介して結合していてもよい。 従って、この目的のためには、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、固定化のた めの手段を担持する５'-非ハイブリッド化ＤＮＡ配列、あるいは固体支持体に結 合されており、そして／または標識、例えば酵素、蛍光物質または放射性核種と 結合可能な標識を担持する５'-非ハイブリッド化ＤＮＡ配列を有していてもよい 。 固定化のための固体支持体としては、固定化手段のための結合パートナー、例 えばストレプトアビジン（ビオチンに対して）または抗-ハプテン抗体（他のハ プテンに対して）を担持したマイクロタイターウェル、ディップスティック、繊 維および粒子が挙げられる。磁性粒子、例えばDynal A/S，Oslo，Norwayが市販 する超常磁性の単分散粒子固体が特に有利である。 本発明に係るオリゴヌクレオチドに基づくハイブリッド化プローブは、有益に は、標的核酸を捕獲するか、またはそれをシグナルで標識することができる。従 って、このようなプローブは、ＤＩＡＮＡシステムについて前記した第二プライ マー対の一方と本質的に同一である。 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、従来の機械シンセサイザー、例えばCycl one DNAシンセサイザー（Biosearch Inc.）を用いた公知技術で合成することが できる。 本発明はまた、少なくとも一つの本発明に係るオリゴヌクレオチドを含むサル モネラ菌検出用キットにまで拡張される。このようなキットは、次のような付加 的成分をも含む。 （a）ＰＣＲのためには、ポリメラーゼ、および本発明に係る少なくとも一つ の他のオリゴヌクレオチドプライマー；これらオリゴヌクレオチドの両方は、Ｄ ＮＡに基づくと共に、標的ＤＮＡの相対する鎖とハイブリッド化する； （b）ＤＩＡＮＡのためには、ポリメラーゼ、および固定化手段および標識手 段を備えた本発明に係るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー； （c）３ＳＲのためには、逆転写酵素、および本発明に係るもう一つのＤＮＡ オリゴヌクレオチドプライマー、両方のオリゴヌクレオチドにはポリメラーゼ結 合部位が備えられている； （d）ＬＡＲのためには、リガーゼ、および図１の配列（SEQ I.D．NO．1）の 最初に隣接する本発明に係るもう一つのオリゴヌクレオチドプライマー； （e）Q-ベータレプリカーゼ増幅のためには、ＲＮＡ由来のＲＮＡポリメラー ゼ、および５'-MDV-1構造またはそのフラグメントを有するＲＮＡプローブ、こ の捕獲オリゴヌクレオチドは固定化されているか、または固定化可能である。 上記の全てのキットにおいて、ヌクレオチド塩基は、通常は適切な緩衝液と共 に供給される。 以下の実施例は説明のためのみ挙げるもので、次の図面が参照される。 図３は、実施例２において、プローブとして、またはシークエンシング反応に 使用したオリゴヌクレオチドのＤＮＡ-フラグメントJE0402-1（Olsen et al.， （1991），上記）上の位置を示す。番号はAabo et al.，1993（Aabo，S.，Rosse n，L.，Rasmussen，O.F.，Sφrensen，P.D.，and Olsen，J.E．（1993），Molec ular and Cellular Probes 7, 171-178）に従った。 図４は、Sal．typhimurium特異的オリゴヌクレオチドプローブである実施例２ で用いたST 22の領域におけるSalmonella菌株（ストレイン）の配列を示す。Sal ．typhimurium 由来のＤＮＡ-フラグメントJE0402-1の配列は、参考として示され ている。Sal．typhimuriumに特異的な塩基には下線が付されている。JE0402-1配 列とは異なる塩基のみが、他の株において示されている。Ａ：アデニン、Ｃ：シ トシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン。試験した菌株数：１：同一配列を有する三 つ；２：同一配列を有する二つ；３：一つ；４：同一配列を有する三つ；５：同 一配列を有する三つ；６：１個の塩基が異なる二つの株；７：同一配列を有する 二つの株。実施例１ ：サルモネラ菌（Salmonella）の検出のためのハイブリッド形成ドット ブロットおよびPCRアッセイにおけるオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー の使用ストレインおよび培地 ： この研究において、146のサルモネラ菌ストレイン（表２）と、86のサルモネ ラ菌ではない腸内細菌（Enterobacteriaceae）ストレイン（表３）とが用いられ た。細胞はLura Bertaniブイヨン（25）中で、37℃にて成長させた。PCRにおい て、プローブフラグメントがクローン化されたネズミチフス菌（S.Typhimurium ）LT2ストレインを、陽性コントロールとして用い、大腸菌（E.coli）ストレイ ンJM103およびHB101を陰性コントロールとして用いた。オリゴヌクレオチドの合成、標識およびハイブリッド形成 ： オリゴヌクレオチドは、サイクロンDNA合成装置（Cyclone DNA Synthesizer， Biosearch Inc．Millipore，Tastrup，Denmark）で、製造者の指示にしたがって 製造し、ガンマ³²P-dATP（Amersham，Aylesbury，England）により、末端トラン スフェラーゼ（Boehringer Mannheim，Kvistagaard，Denmark）を用いて末端標 識した。プライマーの感度および特異性は、標識されたオリゴヌクレオチドを、 Datta et al．（Datta，A.R.，Wentz，B.A.およびHill，W.E．（1987），Detect ion of Hemolytic Listeria monocytogenes by using DNA colony hybridisatio n，Applied and Environmental Microbiology 53，2256-2259）によって説明さ れるように溶菌したほぼ10⁸個のバクテリア細胞が含まれたドットブロットに対 して、6xSSC（1xSSC=0.15M NaCl，0.015 クエン酸Na，pH7.0）中で、50℃にて ハイブリッド形成させることでテストした。ハイブリッド形成後の洗浄は、6xSS C中で、温度55℃、59℃、61℃および65℃にて行なった。供給元（Amersham）の 指示に従って、各洗浄の間に、オートラジオグラムを現像した。DNA-シークエンシング ： 図１に示される2.3 kbサルモネラ菌特異性DNAフラグメントが（SEQ I.D．NO． 1）、プライマー選択の基礎を形成した。PCRプライマーとしてプライマーST3お よびST4を用い、シークエンシングプライマーとしてプライマーST6およびST9を 用いて（図１、SEQ I．D．NO．1）、Gyllensten（Gyllensten，U．（1989），Di rect sequencing of in vitro amplified DNA．In PCR Technology．Principles and applications for DNA amplification．（Erlich，H.A.編），PP 45-60，N ew York，Stockton Press）に説明されるように、非対称PCRを行な った後に、19の異なる血清変種（serovars）における対応する領域のシークエン シングを行なった。PCRアッセイ ： サルモネラ菌の純粋培養物からの粗製DNA抽出物を、Rossen et al．（Rossen ，L.，Holmstrφm，K.，Olsen，J.E.，およびRasmussen，O.F．（1991），A rap id polymerase chain reaction（PCR）-based assey for the identification o f Listeria monocytogenes in food samples，International Journal of Food Microbiology 14，145-152）にしたがって、94℃にてアルカリ溶菌した。５μ １の溶液を、50mM KCl，2.5mM MgCl₂，10mM Tris，HCl pH8.3，200μMの各dNTP ，１μMの各プライマー，0.02%ゼラチン（Difco，Detroit，USA），0.5%Tween 2 0および2.5単位Tag-ポリメラーゼ（Promega，Madison，USA）の混合物100μｌを 含む試験管に移した。PCR反応混合物を、100μｌのパラフィン油で上塗りした。 30サイクルのPCRを、以下の条件を用いて行なった：94℃で１分間の変性、57℃ で１分間のアニーリングおよび72℃で２分間の延長。最終サイクルでの延長工程 は、１０分間であった。PCR生産物は、標準的方法を用いたアガロースゲル電気 泳動によって可視化した。結果 ： ８つのオリゴヌクレオチドシークエンス（ST1〜ST8）（図１、SEQ I.D．N0.1 ）を、シークエンスから選択し、それらがサルモネラ属バクテリアと非サルモネ ラ属バクテリアとを識別する能力を、15のサルモネラ菌ストレインおよび15の非 サルモネラ菌ストレインの純粋培養物を用いたドットブロットに対するハイブリ ッド形成によってテストした。ハイブリッド形成は、低緊縮（low stringency） で行なった。高緊縮条件は、温度を上昇させた４回の連続的洗浄によって得られ た。表１から分かるように、プライマーST3、ST4、ST5およびST7は、擬陽性反応 を示さなかったが、これらオリゴヌクレオチドで、洗浄温度65℃の高緊縮におい て１〜４の擬陰性の結果を得た。これは、2.3kbフラグメントの幾つかの血清変 種間シークエンス変異（interserovar sequence heterogeneity）を示す。保存されたシークエンスを局在化させるために、フラ グメントの２つの領域を、亜種Ｉ〜ＩＶに属する19の異なるサルモネラ菌血清変 種においてシークエンシングした。血清変種を、図２に示した。２つの領域の位 置は、サイズが約220bpおよび160 bpであり、図１（SEQ I.D．NO．1）に示した 。19の血清変種は、図２からわかるように、平均16.5塩基の変異（4.2%）を示し たが、この血清変種の全ては、26、30および36塩基対の３つの保存されたサブリ ージョン（subregion）を、各々共有していた。各々のサブリージョンから、１ つを推定PCRプライマーとして選択した。ST11（25塩基）に対して反対配向（opp osite orientation）について、プライマーST14およびST15（各々24塩基）を選 択した（図２）。 オリゴヌクレオチドST11、ST14およびST15を、75サルモネラ菌ストレインおよ び腸内細菌に属する非サルモネラ菌ストレインに対する上述のハイブリッド形成 によって評価した。ST11およびST15の各々は、全ての緊縮レベルで３つの擬似陽 性反応を示したが、ST14 は、最も低い緊縮温度で５つの疑似陽性を示し、全て の緊縮温度で６つの擬似陰性反応を示した。ドットブロットハイブリッド化アッ セイで擬似反応を示したストレインを、PCRアッセイでテストした。ST11、ST14 またはST15のいずれかについて擬似陰性ハイブリッド化の結果が得られた６つの サルモネラ菌ストレインの内、PCRプライマーセットST11/ST15は、１つだけ、即 ちS．arizona亜種工IIIaだけに擬似陰性PCR反応を与えた。プライマーセットST1 1/ST14は、２つ、即ちS．arizona亜種IIIaおよびS．Blockleyに擬似陰性反応を 示すことが分かった。これら２つのプライマーセットにつき、擬似陽性反応は認 められなかった。 プライマーセットST11/ST15は、429塩基対のPCR生産物を与えた。これらのプ ライマーを、バクテリア純粋培養物中で、サルモネラ菌同定能力について評価し た。表２から分かるように、146のサルモネラ菌ストレインの内の114（118血清 変種の内の116）が正確に同定されたが、亜種IIIaに属する２つのストレインは 、擬似陰性であった。表３に挙げられた86の非サルモネラ菌ストレインからは、 PCR生産物は生成されなかった。 実施例２：サルモネラ菌検出のためのコロニーハイブリダイゼーションアッセイ におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用バクテリアストレイン この研究で用いられたバクテリアストレインは、サルモ ネラ菌の141ストレインと、腸内細菌の他の19の属を含んでいた。サルモネラ菌 血清型の数、サルモネラ菌属亜種による分布、および腸内細菌の種類についての 詳細は、結果の部分（表４および５）から知ることができる。オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドプローブシークエンスは、表６から知 ることができる。DNAフラグメント、JEO4O2-1（Olsen et al．1991，supra）上 のオリゴヌクレオチドの位置は、図３に示されている。オリゴヌクレオチドは、 DNA-tecnology（Aarhus，Denmark）から購入した。ハイブリッド形成のプローブ として用いるために、オリゴヌクレオチドを、Dig-11-dUTP（Boehringer，Mannh eim）で、Thomas et al．（1991）（Thomas，A.，Smith，H.R.，Willshaw，G.A ．& Rowe，B．（1991），Molecular and cellular Probes 5, 129-135）に説明 されるように3'末端標識した。コロニーハイブリダイゼーション Dig-11-dUTP標識プローブを用いたコロニー ハイブリダイゼーションを、Thomas et al．（1991，supra）に説明されるよう に行なった。各々のオリゴヌクレオチドで用いたハイブリッド形成温度は、表６ から知ることができる。ハイブリダイゼーションの後処理を、２ｘ10分間室温に て、および１ｘ５分間ハイブリッド形成温度にて、Aabo et al．（1992）（Aabo ，S.，Thomas，A.，Hall，M.L.M.，Smith，H.R.およびOlsen，J.E．（1992），A PMIS 100，623-628）に説明されるように行なった。DNA-シークエンシング DNA-シークエンシングを、常磁性ビーズ（M280，Strept avidin被覆、Dynal，Oslo）、およびビーズ供給元によって勧められたPCR およ び免疫磁気捕獲プロトコル（immunomagnetic capture protocol）を用いて、二 重鎖PCR-生産物から単離した一重鎖DNAについて、シークエナーゼ2.0シークエン シングキット（USB，Amersham，Copenhagen）を用いて行なった。増幅を始動さ せるために用いたオリゴヌクレオチドおよびシークエンシングプラ イマーを、表６に示した。結果 ：属特異性オリゴヌクレオチド ５つのオリゴヌクレオチドを合成し、非サルモネラ菌バクテリアに対して交差 ハイブリッド形成しないサルモネラ菌のストレインを検出するそれらの能力を解 析した。最初に、19ストレインのバクテリアを、オリゴヌクレオチドプローブに 対してハイブリッド形成させ、表７から分かるように、プローブ、ST4、が全て のサルモネラ菌ストレインで検出された。一方、残りのオリゴヌクレオチドプロ ーブは、各々３つのストレインの内の１つを検出しなかった。しかしながら、大 腸菌（Escherichia coli）に含まれる３つのストレインと反応するオリゴヌクレ オチドはなかった。 ２つのオリゴヌクレオチドプローブST4およびST15を選択して更に解析した。 しかしながら、両方のオリゴヌクレオチドを同一のDNA鎖（これは、「サンドイ ッチハイブリッダイゼーションアッセイ」（このアッセイ様式についての詳細は 、Wolcot,M.J．（1992），Clinical Microbiology Reviews 5, 370-386を参照 ）に要求される）にハイブリッド形成させるために、オリゴヌクレオチドST15の 相補的シークエンス、ST15revを、サルモネラ菌バクテリアおよび非サルモネラ 菌バクテリアの大コレクション（表４）に対するこのハイブリッド形成に用いた 。同じ理由から、ハイブリッド形成温度を、両方のオリゴヌクレオチドプローブ のために、55℃になるように選んだ。表７で解析されたストレインは、この解析 にも含まれていた。 オリゴヌクレオチドST4は、解析された93のサルモネラ菌ストレインの全てを 検出し、ST15revは、一つを除いて全てを検出した。ST15revによって検出されな かったストレインは、サルモネラ菌亜種ｖに属し、最初のスクリーニングによっ てST15で検出されなかったのと同一のストレインであった（表７）。テストされ た28の非サルモネラ菌ストレインからは、信号は検出されなかったが、Edwardsi ella tarda の１つのストレインからはプローブST4で信号が認められた。ネズミチフス菌（Sal．typhimurium）特異性オリゴヌクレオチド PCR-プライマーの研究において、Aabo et al．（1993，supra）は、オリゴヌ クレオチド、ST1（この論文において解析されたのと同一のフラグメントから推 論された）は、解析された15ストレインのサルモネラ菌の内、ネズミチフス菌の みを検出したことを注目している。ST1付近の114塩基対領域のDNAシークエンス は、サルモネラ菌の７つの血清型の１６ストレインにおいて解析された。このア ラインメント（図４）の結果に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ、ST22、 を合成し、ネズミチフス菌のストレインを検出するその能力を解析した。表５か ら分かるように、このプローブは、94ストレインの他のサルモネラ菌血清型の内 、解析されたこの血清型の47ストレインに特異的であり、かつ26の非サルモネラ 菌ストレインに特異的であった。概要 オリゴヌクレオチド、ST15rev、は、サルモネラ属に特異的であり、Sal.亜属b ongori のメンバーを除く、解析された全ての血清型を同定する。17の血清型のみ がSal．bongoriに属し、最近、イソ酵素プロフィールのクラスター分析に基づい て、これはサルモネラ菌とは種として異なることが示唆された（Reeves，M.W.， Evins，G.M.，Heiba，A.A.，Plikaytis，B.D．およびFarmer III，J.J．（1989 ），Journal of Clinical Microbiology 27，313-320）。主に低い罹患率により 、この亜属のメンバーを検出しないことは、サルモネラ菌検出におけるこの特別 なプローブの使用を駄目にするものではないだろう。 オリゴヌクレオチド、ST4（解析されたサルモネラ菌の全てのメンバーを検出 したが、Edw．tardaの１つのストレインと交差ハイブリッド形成した）もまた同 定された。交差ハイブリッド形成により、これは属特異的プローブとしてはさほ ど有用ではない。幸運なことに、DNA-フラグメントJE0402-1の配置は、サンドイ ッチハイブリダイゼーションアッセイを、捕獲プローブとしてのプローブ−ST15 revと、プローブST15revによって捕獲された全てのストレインにハイブリッド形 成する、標識レポータプローブとしてのプローブ-ST4と、で構成でき るようになっている。Edw．tardaに対する交差ハイブリッド形成は、このアッセ イ方式では臨界的ではない。なぜならば、このバクテリアからのDNAは、ST15rev によって捕獲されないからである。 オリゴヌクレオチドプローブ、ST22、は、ネズミチフス菌に特異的であり、シ ークエンシングされた５つの他の血清型とは、５つの塩基位置において異なるこ とがわかった。 他の重要なサルモネラ菌血清型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、同 様のアプローチを他のDNAフラグメントの解析に用いることで同定でき、次いで オリゴヌクレオチドを使用した血清型決定は、少なくとも最も共通して単離され た血清型において、行ない得ることが予想される。 実施例３：標準的培養技術と比較した、PCRを引いた挽肉におけるサルモネラ菌 の検出 牛挽肉の48のサンプルおよび豚挽肉の48のサンプルを、リン酸塩緩衝ペプトン （Anon，Nordic Method Committee on Food，No．71，4 ed.，1991）中で、一夜 、37℃にて前増菌（pre-enrich）した。この前増菌した培養物を、平行して行な われたPCRアッセイおよび標準的培養法の両方に用いた。培養法のために、１ml の前増菌培養物を９mlのテトラチオネートブイヨン（Anon，Nordic Method Comm ittee on Food，No．71，3 ed.，1985）に移し、0.1mlの前増菌ブイヨンを、9.9 mlのRappaport-Vassi1iadis medium（RV）（Oxoid CM669）に移した。両方の培 養物を、41.5℃で20〜22時間インキュベートした。各々の培養物の白金匙量を、 BGA（CM395）およびNBGL寒天（Poisson 1992）に画線し、37℃にて22〜24時間イ ンキュベートした。サルモネラ菌と推察されるコロニーは、標準的プロトコル（ Anon．1991，supra）にしたがって生化学的に特性を明らかにした。PCRアッセイ のために、１mlの前増菌培養物を９mlのテトラチオネートブイヨン（ Anon，1985，supra）に移し、0.1mlを、9.9 mlのRV（Merck 7700）に移し、41.5 ℃で７時間培養した。その後、選択培地によるTaq-ポリメラーゼ阻害を除くため に、選択後工程を行なった。１mlのテトラチオネート培養物と、0.05mlのRVとを 、各々９mlおよび9.95mlのLuria-Bertani（LB）ブイヨンに移し、37℃で14〜16 時間インキュベートした。LB培養物５μｌ中の細胞を、溶菌緩衝液（0.05M NaOH ，0.25 %SDS）中、94℃で15分間溶菌し、溶菌物５μｌを、100μｌの50mM KCl、 10mM Tris，pH8.3、2.5mM MgCl₂、200μMの各dNTP、１μMの各プライマー、ST11 5'AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA3'およびST155'GTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG3'、0.5 % Tween 20、および0.02%ゼラチン、および2.5単位のTaq-ポリメラーゼ（Promeg a）を含むPCR試験管に加えた。このバイアルを、100μｌのパラフィン油で覆っ た。PCRサイクル条件は、94℃で１分間、57℃で１分間および70℃で２分間を３ ０サイクルであった。最後のサイクルでは、伸長工程を10分間に延長した。検出 は、1.5%アガロースゲル中でのアガロースゲル電気泳動の後に、エチジウムブロ ミド（2mg/l）染色し、水中で脱染色し、次いでPolaroid Land Cameraを用いて2 54 UV光下で写真撮影することで行った。PCR生産物を、2.3kbフラグメント（Ols en et al.，1991，supra）を用いてサザンブロットハイブリダイゼーションによ って確かめ、これからプライマーを、プローブとして推定した。プローブを、Aa bo et al．（1992，supra）に説明されるように、ジゴキシゲニン（Boehringer ）で標識した。用いた２つの選択的培地の内、少なくとも１つが陽性の結果を与 えた場合には、サンプルがPCRまたは培養の何れかで陽性であると考えた。 ７つのPCR陽性豚サンプルの内、たった４つが培養によって陽性であり、41のP CR陰性豚サンプルの内、１つが培養によって陽性であった。５つのPCR陽性牛サ ンプルの内、１つが培養によって陽性であったが、43の全てのPCR陰性牛サンプ ルが、培養で陰性であることが分かった。両方の肉のタイプの結果を融合したも のが、表８にまとめて示されている。合計７つのPCRの結果が、培養法の結果と 比較した場合に、擬似陽性として特徴づけられた。LB培養物からの繰り返し培養 を、直接にBGA/NBGL寒天上で、あるいはRV（Merck 7700）培養後に行なった場合 に、サルモネラ菌は、７つのLB培養物から６つ単離された。これに基づけば、 96の豚肉および牛肉サンプルのプールされた結果に基づいて計算した場合、PCR 法の感度は92%であり、特異性は99%であると推定された。PCRを直接に前増菌培 養物について行なった場合、12のサルモネラ菌陽性サンプルの内のたった１つが 検出された。標準的培養方法の感度は、サルモネラ菌の存在が確かめられた12の サンプルに基づいて50%であり、特異性は、84の陰性サンプルに基づいて100%で あると推定された。 この研究で用いられたサルモネラ菌特異性PCRアッセイは、前増菌培養物中の サルモネラ菌の同定について、標準的培養方法より高感度であることが分かった 。標準的培養方法の感度は、50%程度の低さであることが分かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オルセン，ジョーン，エルメルダール デンマーク ディーケー―3500 ヴァエロ ロス，エルメクローゲン ４ (72)発明者 アーボ，ソーレン デンマーク ディーケー―4320 レイレ, トッケルプ，トッケルプベイ 11 (72)発明者 ロッセン，ローン デンマーク ディーケー ― 4000 ロス キルデ，ヒンメレフ，エンゴルンパーケン 56 (72)発明者 ラスムッセン，オレ，エフ. デンマーク，ディーケー ― 2760 マー ロエフ，カエルロッデン 127

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 核酸分子が、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型のＤＮＡまたはＲ ＮＡと選択的にハイブリッド化する、下記の配列： を含む１本鎖ＤＮＡ、およびそれと相補的なＤＮＡ配列、およびその類似体およ びフラグメントであることを特徴とする、サルモネラ菌（Salmonella）種の検出 および同定のための核酸分子。 ２． ＤＮＡに基づく検出システムにおけるプローブまたはプライマーとして使 用するための請求項１に記載の核酸分子。 ３． 核酸分子が、下記の配列： およびそれと相補的なＤＮＡ配列、およびその類似体およびフラグメントの少 なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子。 ４． 核酸分子が、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型のＤＮＡまたはＲ ＮＡと選択的にハイブリッド化する、下記の配列： およびそれと相補的なＤＮＡ配列、およびその類似体およびフラグメントの少 なくとも一つを含むことを特徴とする核酸分子。 ５． 核酸分子が、更に、固体支持体の標識および／または結合のためのハイブ リッド化領域または非ハイブリッド化領域を含むことを特徴とする、請求項１〜 ４の何れか一項に記載の核酸分子。 ６． 請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸分子の一つまたはそれ以上を、Ｄ ＮＡに基づく検出システムにおけるプローブまたはプライマーとして使用するこ とを特徴とする、一つまたはそれ以上のサルモネラ菌血清型の検出方法。 ７． ＤＮＡ検出システムが、ポリメラーゼ鎖延長反応（PCR）、自己-維持配列 複製（3SR）、Q-ベータレプリカーゼ増幅システム、リガーゼ増幅反応（LAR）お よび機能的に類似の変異体からなる群から選択された増幅システムを採用するこ とを特徴とする、請求項６に記載の方法。 ８． 増幅システムがＰＣＲであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。 ９． 少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、これらのプラ イマーが標的ＤＮＡの相対する鎖と相補的であることを特徴とする、請求項８に 記載の方法。 10． プライマーが、ST11/ST14対およびST11/ST15対からなる群から選択され、 各対のプライマーが標的ＤＮＡの相対する鎖と相補的であることを特徴とする、 請求項９に記載の方法。 11． 巣籠もりプライマーを使用することを特徴とする、請求項８〜10の何れか 一項に記載の方法。 12． 請求項３で定義したST15、あるいはその相補的配列またはそのＤＮＡ類 似体もしくはフラグメントをプローブとして使用することを特徴とする、請求項 ６に記載の方法。 13． Salmonella Typhimurium を検出することを特徴とする、請求項６に記載 の方法。 14． 請求項３で定義した核酸分子ST22、あるいはそれと相補的なＤＮＡ配列ま たはその類似体もしくはフラグメントを使用することを特徴とする、請求項13に 記載の方法。 15． 少なくとも下記の成分： a）ポリメラーゼ b）請求項２に記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプライマー を含む、ＰＣＲ技術を用いたサルモネラ菌種検出に使用されるキット。 16． 少なくとも下記の成分： a）ポリメラーゼ b）固定化用手段または標識用手段を備えた請求項２に記載の少なくとも二つ のオリゴヌクレオチドプライマー を含む、ＤＩＡＮＡ技術を用いたサルモネラ菌種検出に使用されるキット。 17． 少なくとも下記の成分： a）逆転写酵素 b）請求項２に記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプライマー（両方 のプライマーはポリメラーゼ結合部位を有する） を含む、３ＳＲ技術を用いたサルモネラ菌種検出に使用されるキット。 18． 少なくとも下記の成分： a）リガーゼ b）請求項２に記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプライマー（これ らオリゴヌクレオチドは請求項１の配列に隣接する） を含む、ＬＡＲ技術を用いたサルモネラ菌種検出に使用されるキット。 19． 少なくとも下記の成分： a）ＲＮＡ指導性ＲＮＡポリメラーゼ b）5'-MDV-1構造またはそのフラグメントを有するＲＮＡプローブ c）請求項２に記載の少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（この プライマーは固定化されているか、または固定化可能である） を含む、ＬＡＲ技術を用いたサルモネラ菌種検出に使用されるキット。