NL9002696A - Werkwijze en kit voor het aantonen van microoerganismen. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en kit voor het aantonen van microorganismen

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en een kit voor het aantonen van microorganismen in een monster.

In klinische monsters (zoals urine, faeces, speeksel, sputum, serum, bloed, biopten, e.d.) of in voedingsmiddelen kunnen potentieel pathogene soorten bacteriën in geringe aantallen tussen grote aantallen van contaminerende andere soorten microorganismen aanwezig zijn. Voor het aantonen van deze potentieel pathogene bacteriën worden selectieve media gebruikt. Zo bestaat de klassieke methode voor het aantonen van Salmonella uit een kweken op Salmonella/Shiaella agar en verrijken in seleniet agar, gevolgd door een biochemische en serologische identificatie. Deze klassieke methode heeft belangrijke tekortkomingen, met name het feit dat hij veel tijd vraagt en arbeidsintensief is.

In het Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 wordt een variant van deze klassieke methode beschreven waarbij de te bepalen microorganismen eerst uit het monster worden geïsoleerd. Volgens deze variant wordt een biologisch medium waarin zich pathogene microorganismen met een specifieke antigene determinant bevinden, in contact gebracht met een magnetische gel waaraan tegen deze determinant gerichte antilichamen zijn gekoppeld. De magnetische partikels worden vervolgens met een magneetstaaf opgepikt en op een agar plaat geïnoculeerd waarbij een afdruk van ongeveer 1 cm doorsnede ontstaat. De agar plaat wordt geïncubeerd, zodat zich kolonies (even groot als de afdruk) kunnen vormen. Daarna kan bijv. een klassieke bacteriologische methode worden toegepast voor het identificeren van de bacteriën in de kolonie.

Inmiddels zijn ook bepalingsmethoden ontwikkeld waarbij met een enzyme immunoassay of een enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) gebruikmakend van polyklonale of monoklonale antilichamen de aanwezigheid van een bepaald type bacteriën, bijv. Salmonella, in klinische monsters of voedingsmiddelen wordt aangetoond. Dergelijke bepalingen nemen één a twee dagen minder in beslag, maar de te onderzoeken monsters moeten toch nog eerst in een groeimedium worden verrijkt voordat de feitelijke assay kan worden uitgevoerd. Daarnaast zijn aan de immunochemische detectie nog deze nadelen verbonden, dat verwante microorganismen moeilijk met antisera kunnen worden onderscheiden en dat een gevoeligheid van niet beter dan 106 cellen/ml kan worden gerealiseerd.

Ook in het hierboven genoemde Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 wordt een immunologische techniek voor het bepalen van de identiteit van de bacteriën beschreven. Hiertoe wordt op korte afstand van de kolonies een putje in de agar gemaakt dat met een specifiek antiserum wordt gevuld. De kolonies worden gelyseerd. Diffusie van antigeen uit de kolonie en antilichaam uit het met antiserum gevulde putje leidt tot een immuunprecipitaat dat vervolgens aangekleurd kan worden. Deze procedure beslaat ongeveer twee dagen.

Een alternatieve, nieuwe benadering voor de detectie van microorganismen wordt geboden door het gebruik van de moderne DNA technologie. Wat snelheid en gevoeligheid betreft lijkt amplificatie van DNA sequenties met de PCR (polymerase chain reaction) onder toepassing van primers die voor een bepaald microorganisme (een bepaald genus, species of stam) specifiek zijn een veelbelovende mogelijkheid. Een belangrijk nadeel van de PCR techniek is evenwel dat de amplificatie van de target DNA sequentie geremd wordt door grote hoeveelheden van contaminerend DNA.

Door Jansen et al., PNAS USA 87, 1990, 2867-2871, is een systeem voor het aantonen van het hepatitis A virus (HAV) beschreven waarin een 1.5 ml eppendorf buisje wordt bekleed (gecoat) met een monoklonaal antilichaam dat tegen het hepatitis A virus is gericht. Een faeces monster dat mogelijk het HAV bevat, wordt in het buisje gebracht en na een incubatie van een nacht wordt de suspensie weggewassen. Na toevoeging van een geschikte buffer volgt reverse transcriptie om het HAV RNA (HAV is een RNA virus) om te zetten in DNA dat vervolgens in een andere buffer aan een PCR wordt onderworpen.

Deze procedure duurt ongeveer 24 uur. Zijn voordeel schuilt in de combinatie van specificiteit van de antilichaam stap, gevoeligheid van de PCR en eenvoudige confirmatie van de specificiteit van de PCR produkten. Er zijn echter ook belangrijke nadelen aan deze methode verbonden, bijv. het feit dat hij niet gebruikt kan worden voor het aantonen van pathogene microorganismen zoals Salmonella bacteriën. Bij virale infecties doet zich, in tegenstelling tot bij bacteriële infecties, zelden of nooit het probleem voor van de aanwezigheid van nauwverwante soorten microorganismen. Opwerkingsprocedures voor bacteriëel gecontamineerde monsters teneinde ze geschikt te maken voor een PCR zijn nagenoeg niet beschikbaar.

Wel is er een aantal protocollen beschreven voor PCR op reincultures. De bacteriën worden gepelleteerd in een centrifuge, opgenomen in water en gedurende 10 min op 95°C verwarmd, waarna proteinase K wordt toegevoegd en gedurende 10 min bij 55°C wordt geïncubeerd. Het proteinase wordt in 15 min bij 95°C geïnactiveerd, waarna RNase wordt toegevoegd en de incubatie gedurende 15 min bij 37°C wordt voortgezet.

Pas dan wordt de PCR reactie uitgevoerd (Barry et al., Biotechnology 8, 1990, 233-236).

In sommige gevallen wordt zelfs uitgegaan van DNA dat na lysis en proteinase K behandeling eerst nog opgezuiverd wordt via fenol extracties en eventueel CsCl gradiënten (Bernet et al., J. Clin. Microbiol. 27, 1989, 2492-2496; Wilson et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, 1942-1946; Plikaytis et al., J. Clin. Microbiol. 28, 1990, 1913-1917).

Extractie van viraal DNA uit biopten, serum of bloed verloopt via protocollen die vergelijkbaar zijn met de bovenstaand beschreven methode, waarbij DNA zuivering plaats vindt via fenol extracties en CsCl gradiënten (zie Kaneko et al., PNAS USA 86, 1989, 312-316; Maitland et al., Brit. J. Cancer 59, 1989, 698-703).

In water waarin faecale besmetting (Enterobacteriaceae) kan hebben plaatsgevonden, is de monsteropwerking relatief eenvoudig omdat er weinig partikels en andere bacteriën aanwezig zijn. Twee centrifugatie stappen of een filtratie stap zijn dan ook voldoende. Uit de verkregen cellen wordt vervolgens DNA vrijgemaakt met behulp van lysis buffer. Aan de verkregen cellen wordt 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.13), 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatine, 0.05 mg/ml proteinase K, 20 mM dithiothreitol en 1.8 μΜ SDS toegevoegd. Na 15 sec vortexen wordt het mengsel gedurende 1 tot 1.5 uur bij 37°C geïncubeerd, vervolgens wordt de proteinase K geïnactiveerd door 5 min verwarmen tot 80°C. Hierna wordt de PCR uitgevoerd (zie Atlas en Bej, in "PCR protocols; a guide to methods and applications", Innis, Gelfand, Sninsky en White eds, Academie Press, San Diego, 399-406).

Voor de isolatie van bacteriën uit grondmonsters wordt gebruik gemaakt van een aantal blending en centrifugatie stappen, gevolgd door een lysis stap en DNA zuivering via onder andere een CsCl gradiënt (Steffan en Atlas, Appl. Environm. Microbiol. 54, 1988, 2185-2191).

De uitvinding verschaft nu een werkwijze en kit waarmee het, in tegenstelling tot alle eerder voorgestelde technieken, mogelijk is om op een snelle, specifieke en gevoelige wijze microorganismen zoals bacteriën, schimmels en gisten aan te tonen in verschillende soorten van monsters.

De uitvinding heeft in een eerste aspect betrekking op een werkwijze voor het aantonen van microorganismen in een monster, waarbij de te detecteren microorganismen uit het monster worden geïsoleerd met behulp van antilichamen met een specifieke affiniteit voor deze microorganismen en een vaste drager voor deze antilichamen, en vervolgens het DNA van de aldus geïsoleerde microorganismen wordt onderworpen aan een PCR waarin voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers worden gebruikt.

In een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op een kit voor het aantonen van microorganismen in een monster, omvattende antilichamen met een specifieke affiniteit voor de te detecteren microorganismen, welke antilichamen gebonden zijn aan een vaste drager voor deze antilichamen of voorzien zijn van een middel met behulp waarmee ze aan een eveneens tot de kit behorende vaste drager voor de antilichamen kunnen worden gebonden, alsmede een set van voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers voor een PCR.

De werkwijze volgens de uitvinding is met name geschikt voor het aantonen van microorganismen die bestaan uit bacteriën, schimmels of gisten van een bepaald genus, een bepaald species, of een bepaalde stam, waarbij de combinatie van het gebruik van antilichamen met een specifieke affiniteit voor de te detecteren microorganismen om juist deze microorganismen uit het monster te isoleren en het gebruik van een set van voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers voor een PCR om juist het DNA van deze microorganismen te amplificeren verzekert dat de methode bijv. bij bacteriën onderscheid kan maken tussen verschillende genera, of tussen verschillende soorten, of zelfs tussen verschillende stammen.

De uitvinding is niet beperkt tot werkwijzen voor het aantonen van pathogene bacteriën in klinische monsters (zoals urine, faeces, sputum, speeksel, serum, bloed, biopten, enz.) of voedingsmiddelen, maar omvat ook werkwijzen om bijv. de voor de bereiding van consumabele produkten zoals brood, bier, wijn, kaas, yoghurt, e.d. gebruikte gisten en/of schimmels te kunnen identificeren. Bij voorkeur wordt de uitvinding echter benut voor het aantonen van pathogene bacteriën, hetgeen met de bestaande technieken niet op een bevredigende wijze mogelijk is. Zo is de uitvinding bijzonder geschikt voor het aantonen van microorganismen die bestaan uit bacteriën van een van de genera Salmonella. Klebsiella of Listeria. Mede in verband met de voorkeur voor toepassing van de uitvinding ter bepaling van bacteriën zal in de verdere beschrijving van de uitvinding gemakshalve vaak gesproken worden over bacteriën, zonder dat daarmee beoogd wordt om de uitvinding in dit opzicht te beperken.

Voor een optimaal betrouwbaar resultaat is nodig dat de voor de isolatie van de beoogde microorganismen te gebruiken antilichamen (bij voorkeur monoklonale antilichamen) in staat zijn om met nog levende bacteriën te reageren, d.w.z. een specifieke affiniteit hebben voor en kunnen binden aan de nog levende bacteriën. Het zijn immers met name de nog levende bacteriën die DNA bevatten en de uiteindelijke detectie vindt bij de werkwijze volgens de uitvinding plaats aan de hand van het bacteriële DNA.

Volgens de uitvinding heeft het derhalve de voorkeur dat voor de isolatie van de aan te tonen microorganismen uit het monster monoklonale antilichamen worden gebruikt die opgewekt zijn tegen het levende microorganisme, d.w.z. dat het als bron voor de antilichamen fungerende proefdier (meestal een muis) met de levende bacteriën (althans bacteriën die deze toestand dicht benaderen) is geïmmuniseerd. In het geval van voor de muis niet-pathogene humane virussen zoals het HAV is dit geen al te groot probleem, maar in het geval van bijv. Salmonella bacteriën die ook voor de muis pathogeen zijn, lijkt zo'n immunisatie niet mogelijk.

Alle tot nog toe beschreven monoklonale antilichamen tegen Salmonella reageren alleen met dode bacteriën, hetgeen betekent dat het monster waarin de bacteriën zitten eerst opgekookt moet worden. Dit geldt algemeen voor alle momenteel ter beschikking staande immunologische assays voor de detectie van Salmonella. Koken van deze bacteriën heeft echter tot gevolg dat zij lyseren en hun DNA inhoud verliezen. Een PCR is dan natuurlijk niet meer mogelijk.

De bestaande immunisatie methodieken kunnen dus niet worden gebruikt indien men monoklonale antilichamen tegen nog levende pathogene bacteriën in handen wil krijgen. Daarvoor zijn twee duidelijke redenen aan te wijzen. Allereerst worden adjuvantia gebruikt om een immuunrespons te verkrijgen. Deze adjuvantia hebben echter als nadeel dat de natieve eiwitten van het organisme in het adjuvans denatureren waardoor vele epitopen vernietigd worden. Er worden op deze manier dan ook vooral monoklonale antilichamen verkregen die reageren met delen van de eiwitten die niet van struktuur veranderen na behandeling met of opname in een adjuvans (zie Luk et al., J.

Immunol. Meth. 129, 1990, 243-250; Mason Smith en Potter, J. Immunol. 114, 1975, 1847-1850; Feng et al., J. Gen. Microbiol. 136, 1990, 337-342).

Op de tweede plaats is immunisatie met natieve organismen in principe onmogelijk in gevallen dat het organisme pathogeen is voor het te immuniseren dier. Om dit probleem te omzeilen gebruikt men in de praktijk voor de immunisatie veelal eiwitten van het organisme in geïsoleerde vorm. De eiwitten wekken echter een zeer zwakke immuunrespons op, om welke reden de zorgvuldig geïsoleerde eiwitten meestal tegelijk met een adjuvans worden ingespoten (zie Sadallah et al., J. Infect. Dis. 161, 1990, 59-64). Door een gehele denaturatie van het organisme of de geïsoleerde eiwitten worden de antigenen veel immunogener. Door de behandelingen met adjuvantia of andere denaturatie methoden gaan echter veel conformatie epitopen verloren. Het aldus geprikkelde immuunsysteem zal daarom geen immuunrespons opleveren tegen dergelijke conformatie epitopen. Op levende bacteriën komen echter vooral conformatie epitopen voor omdat deze de voedselvoorziening en beweging van het organisme verzorgen.

Volgens de uitvinding zijn voor dit probleem meerdere oplossingen gevonden. Om toch een immuunrespons te verkrijgen tegen de natieve epitopen wordt volgens de uitvinding geïmmuniseerd met levende bacteriën of bacteriën die deze status zo dicht mogelijk benaderen. Volgens één methode worden de bacteriën samen met een antibioticum in het proefdier ingespoten en wel zodanig dat het bereikte bacteriostatische effect een expositie van de in zijn groei geremde maar nog wel levende bacterie aan het immuunsysteem toelaat. Volgens een tweede methode om een immuunrespons tegen levende bacteriën te verkrijgen wordt de bacteriestam behandeld met een lage concentratie formaline. Hierdoor wordt waarschijnlijk de opname van de bacteriën door fagocyten (pathogene bacteriën worden vaak door fagocyten opgenomen om vervolgens onzichtbaar voor het immuunsysteem intracellulair verder te leven) dermate belemmerd dat expositie aan cellen van het immuunsysteem kan plaatsvinden.

Het heeft dus volgens de uitvinding de voorkeur dat voor de bereiding van de monoklonale antilichamen gebruik is gemaakt van een immunisatie met het levende microorganisme in combinatie of na behandeling met (een groei van de bacterie remmende hoeveelheid) antibioticum of (een opname van de bacterie door fagocyten remmende hoeveelheid) formaldehyde.

Volgens de uitvinding moeten de voor de isolatie van de aan te tonen microorganismen gebruikte antilichamen aan een vaste drager gebonden zijn of worden (eventueel na de reactie met de in het monster aanwezige microorganismen indien de antilichamen en vaste drager op een geschikte wijze zodanig zijn gemodificeerd dat zo'n latere koppeling tot stand kan worden gebracht, bijv. via een biotine/avidine systeem, een hapteen/anti-hapteen systeem, enz.). Hoewel de aard van de vaste drager in principe niet aan bijzondere beperkingen onderhevig is en de vaste drager bijv. uit inerte deeltjes van metaal, kunststof of glas kan bestaan die door centrifugeren van de rest van het monster kunnen worden afgescheiden, heeft het volgens de uitvinding zeer de voorkeur dat magnetische deeltjes worden gebruikt die zeer gemakkelijk met behulp van een magnetische kracht uit het monster kunnen worden opgepikt. Vergeleken met het gebruik van de wand van een buisje als vaste drager voor de antilichamen is bij gebruik van deeltjes en vooral magnetische deeltjes dankzij het goede contact met het monster veel minder tijd nodig om een optimale binding van microorganisme en antilichaam te realiseren.

Het heeft dus volgens de uitvinding sterk de voorkeur dat als vaste drager voor de antilichamen, met behulp waarvan de aan te tonen microorganismen uit het monster worden geïsoleerd, magnetische deeltjes worden gebruikt. Liefst worden de aan te tonen microorganismen uit het monster geïsoleerd door aan het monster magnetische deeltjes toe te voegen waaraan monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen zijn gebonden en na incubatie de magnetische deeltjes met, indien aanwezig, daaraan gebonden de aan te tonen microorganismen af te scheiden. Het heeft verder de voorkeur dat hierbij magnetische deeltjes met daaraan gebonden monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen worden gebruikt die verkregen zijn door de monoklonale antilichamen te incuberen met magnetische deeltjes welke bekleed zijn met antilichamen met specifieke affiniteit voor de monoklonale antilichamen. Indien de monoklonale antilichamen bijv. van de muis afkomstige immunoglobulinen zijn, kunnen de magnetische deeltjes bekleed zijn met bijv. immunoglobulinen van de geit met specificiteit voor immunoglobulinen van de muis.

Bacteriën en andere microorganismen vertonen het verschijnsel van aspecifieke binding of hechting aan vaste oppervlakken. Dit vormt met name een groot probleem indien het te onderzoeken monster naast de aan te tonen microorganismen, zoals Salmonella, ook andere soorten bacteriën bevat. Dit probleem wordt nog verder vergroot indien er een klein aantal van de aan te tonen microorganismen naast een grote overmaat van andere microorganismen aanwezig is, bijv. één Salmonella bacterie op een miljoen Escherichia coli bacteriën. In dat geval zal de in het Amerikaanse octrooischrift 4,677,055 beschreven methode falen doordat de Salmonella1s volkomen overgroeid worden door de aan de deeltjes hechtende Escherichia coli bacteriën. De onderhavige uitvinding lost dit probleem volledig op door de PCR als detectie methode te gebruiken. Deze verzekert door een juiste keuze van de primers specificiteit en een hoge gevoeligheid. Om deze gewenste eigenschappen te bereiken is het echter wel raadzaam de PCR uit te voeren aan het uit de cellen vrijgemaakte en van de vaste drager gescheiden DNA dat verkregen wordt door de bacteriën te lyseren (bijv. door verwarming op 60-100°C) en na centrifugeren de supernatant voor de PCR te gebruiken. Het heeft dus volgens de uitvinding de voorkeur dat uit de aan de magnetische deeltjes gebonden microorganismen het DNA wordt geïsoleerd en in afwezigheid van de magnetische deeltjes aan een PCR wordt onderworpen. Voor het overige stelt de uitvinding weinig eisen aan de monsteropwerking voor de PCR; gebruik van lysis buffer, fenol extracties en CsCl gradiënten zijn niet nodig, ook niet wanneer de werkwijze gericht is op het aantonen van bijv. Enterobacteriaceae of Listeria.

De PCR condities zijn op zichzelf aan de deskundige bekend (zie bijv. het Amerikaanse octrooischrift 4,683,202), evenals de daarvoor bruikbare soorten van DNA polymerase, zoals het veel toegepaste Taq DNA polymerase. De keuze van de primers is echter specifiek voor de onderhavige werkwijze: door deze keuze kan worden verzekerd dat de werkwijze specifiek is voor een bepaald genus, een bepaald species of zelfs een bepaalde stam van een microorganisme. Het vinden van geschikte primers is echter niet altijd even gemakkelijk. Dit blijkt bijv. een probleem te zijn indien men specificiteit voor een bepaald genus van bacteriën wil verzekeren, bijv. voor het genus Salmonella, d.w.z. indien men wil dat met de werkwijze alle soorten en stammen behorende tot het genus Salmonella worden herkend terwijl tot andere genera behorende bacteriën niet worden herkend. Het is bekend dat rRNA sequenties een grote mate van overeenstemming vertonen binnen een bepaald genus en daarvan is voor hybridisatie experimenten reeds gebruik gemaakt (zie EP-A-0 357 306; EP-A-0 277 237; WO 88/03957). Door Chen et al., FEMS Microb. Lett. 57, 1989, 19-24 is het gebruik van rRNA primers beschreven, echter om bacteriën in het algemeen aan te tonen. Het gebruik van rRNA primers is een door de uitvinding omvatte mogelijkheid, maar is niet in alle gevallen geschikt. Met name bij Salmonella blijkt er nl. toch een nogal sterke sequentie variatie voor te komen in de rRNA sequenties. Een geschikt alternatief is gevonden in de sequentie van de "oorsprong van DNA replicatie" van het bacteriële chromosoom (oriC). Van een aantal Enterobacteriaceae is de sequentie van oriC bekend (Kornberg in "Supplement to DNA replication", Freeman and Co., San Francisco). Deze oriC sequentie bestaat uit gebieden die tussen de Enterobacteriaceae geconserveerd zijn en gedeelten die variabel zijn. Onbekend was echter dat deze variabele gedeelten binnen bijv. het genus Salmonella geconserveerd zijn en dus als basis kunnen dienen voor primers voor een genus-specifieke PCR.

De uitvinding omvat dus werkwijzen waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een rRNA sequentie. Deze benadering is in de praktijk bruikbaar gebleken voor bijv. bacteriën van het genus Listeria.

Tevens omvat de uitvinding werkwijzen waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een sequentie van de oorsprong van DNA replicatie.

Een concreet voorbeeld daarvan vormt een werkwijze waarbij bacteriën van het genus Salmonella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

In een concreet uitvoeringsvoorbeeld zal deze toepassing van de uitvinding nader worden toegelicht.

Een tweede voorbeeld wordt gevormd door een werkwijze waarbij bacteriën van het genus Klebsiella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2: 5'-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3 *

Proefondervindelijk is vastgesteld dat met deze primercombinatie en met Klebsiella-specifieke monoklonale antilichamen de werkwijze volgens de uitvinding selectief is voor bacteriën van het genus Klebsiellaf hetgeen een positieve uitslag betekent voor Klebsiella oxvtoca en Klebsiella pneumoniae en een negatieve uitslag betekent voor Escherichia coli. Citrobacter freundii. Serratia marcescens. Proteus mirabilis. Enterobacter cloacae en Enterobacter aeroqenes.

Niet elke primer combinatie is echter bruikbaar en werkzaam in de PCR. Zo is vastgesteld dat voor het aantonen van Klebsiella de op de oriC sequentie gebaseerde primer combinatie: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2·: 5'-AAGTATAACCGTTGCCTGA-3' onwerkzaam is.

In het hierna volgende voorbeeld is gebruik gemaakt van monoklonale antilichamen die aan levende Salmonella bacteriën kunnen binden. Hybridoma's die deze monoklonale antilichamen produceren, zijn op 28 november 1990 gedeponeerd bij het ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures), UK, onder de volgende nummers: ΜΑΒ 55-23-B7: ECACC 90112807 ΜΑΒ 70-2-2A: ECACC 90112808 ΜΑΒ 71-40-A1: ECACC 90112809

Voorbeeld PCR amplificatie

De PCR techniek werd gebruikt voor het amplificeren van een 160 bp lang gedeelte van de sequentie van de oorsprong van DNA replicatie. Daartoe werden primers gebruikt met een aan de oorsprong van replicatie van Salmonella typhimurium ontleende sequentie. Deze oligonucleotide primers werden gesynthetiseerd op een Pharmacia LKB Gene Assembler Plus Synthesizer onder toepassing van de fosforamidiet technologie. Na deprotectie en afsplitsing van de vaste drager werden de oligonucleotiden door chromatografie op NAP10 kolommen gezuiverd. De primers hadden de volgende sequenties: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

De specificiteit van de set primers werd in een PCR aan 27 Salmonella stammen en 19 andere Enterobacteriaceae (geen Salmonella) getest (zie tabel A). Het PCR reactiemengsel (eindvolume 100 μΐ) bestond uit 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2/ 0.001% (w/v) gelatine, 100 μΜ van elke dNTP, 0.5 μΜ van elke primer, 1.25 U Ampli-Taq polymerase (Cetus, Emeryville, CA, USA). De amplificatie werd uitgevoerd in 35 cycli op een Perkin-Elmer Thermocycle (Perkin-Elmer Instruments, Norwalk, CT, USA). Een cyclus bestond uit een denaturatie stap van 1 min bij 94°C, een primer annealing stap van 1 min bij 50°C en een extensie stap van 1 sec bij 72°C. Na amplificatie werd 15 ml van het monster aan electroforese op een 1.5% agarose gel onderworpen. Het DNA werd met ethidiumbromide gekleurd. Fragmenten die door knippen van lambda DNA met PstI waren verkregen, werden als lengtemerkers gebruikt (het lambda DNA en het restrictie endonuclease PstI waren, evenals de dNTPs, van Boehringer Mannheim, Duitsland afkomstig).

Na de amplificatie werd niet alleen bij de Salmonella tvphimurium stammen, maar bij alle geteste Salmonella bacteriën een DNA fragment met de verwachte grootte gevonden. Daarentegen trad geen amplificatie op bij de geteste andere Enterobacteriaceae zoals Shigella. Escherichia coli. Citrobacter en Pseudomonas. Hieruit werd afgeleid dat de gekozen set van primers Salmonella-specifiek is.

Gevoeligheid en specificiteit van de werkwijze

Een verdunningsreeks van Salmonella tvphimurium. welke variëerde van 5xl07 tot 5xl02 cellen/ml, werd (telkens 100 μΐ) in een werkwijze volgens de uitvinding getest. Als magnetic beads werden Magnisort M deeltjes (magnetisch chroomdioxide) van DuPont (Wilmington, DE, USA) gebruikt. Deze werden gecoat met immunoglobulinen van de geit die specifiek waren voor IgG en IgM van de muis. De binding van monoklonale antilichamen (van de subklasse IgM), gericht tegen Salmonella bacteriën, aan de magnetic beads geschiedde door supernatant van de hybridoma cultuur gedurende 5 min bij 35°C in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 1% gelatine (gPBS) met de gecoate magnetic beads te incuberen. De magnetische deeltjes werden met behulp van een magneet geïsoleerd, waarna de supernatant werd weggegooid.

De testmonsters werden in gPBS gesuspendeerd en aan de magnetische deeltjes toegevoegd. Na een incubatie van 15 min bij 35°C werden de magnetische deeltjes met behulp van een magneet geïsoleerd en drie keer met gPBS gewassen. Na de laatste wasstap werden de magnetische deeltjes in aqua bidest geresuspendeerd.

Bij een poging om de PCR direct aan de met de magnetische deeltjes geëxtraheerde bacteriën uit te voeren, bleek dat de amplificatie door de magnetische deeltjes werd geremd. Daarom werden de monsters gedurende 5 min bij 100°C geïncubeerd om de bacteriecellen te vernietigen en kortstondig gecentrifugeerd, waarna een fractie van de supernatant (met daarin bacteriëel DNA) aan de PCR werd onderworpen. De PCR (35 DNA amplificatie cycli) werd uitgevoerd op de hierboven beschreven wijze.

Als resultaat (niet getoond) werd gevonden dat met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding een hoeveelheid cellen van 103 kon worden gedetecteerd. Om de efficiency van de binding van de Salmonella bacteriën aan de met de monoklonale antilichamen gekoppelde magnetische deeltjes te bepalen, werd de supernatant die na de incubatie met de bacteriën was verkregen eveneens aan de PCR onderworpen. Er werd geen amplificatie van de target DNA sequentie gevonden, waaruit kan worden afgeleid dat de binding van de Salmonella bacteriën aan de monoklonale antilichamen op de magnetische deeltjes vrijwel compleet was.

Bij verdere experimenten bleek dat de werkwijze volgens de uitvinding ook in staat was om 103 Salmonella bacteriën aan te tonen in een monster waarin tevens 107 niet-Salmonella bacteriën (Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa.

Klebsiella oxytoca en Citrobacter freundii) aanwezig waren. In controle experimenten met Escherichia colir Pseudomonas aeruginosa. Klebsiella oxvtoca. Citrobacter freundii en gPBS werd geen detecteerbare amplificatie waargenomen.

TABEL A PCR amplificatie van Salmonella stammen en andere

Enterobacteriaceae stammen PCR Salmonella amplificatie serogroep

S. durazzo + A

S. clinical isolate Μ + A

S. paratyphi A-0 + A

S. typhimurium L + B

S. typhimurium 1724 + B

S. typhimurium 14H + B

S. bredeny + B

S. derby + B

S. heidelberg + B

S. brandenburg + B

S. clinical isolate 10.2 + B

S. saintpaul + B

S. paratyphi B + B

S. abortus equi + B

S. infantis + Cl S. newport + C2

S. belem + C

S. clinical isolate 859 + Cl

S. paratyphi C + C

S. panama + D

S. typhosa + D

S. enteriditis + D

S. shargani + E

S. give + E

S. pretoria + F

S. atlanta + G

S. worthington + G

Escherichia coli Escherichia coli 07K1 Klebsiella pneumonia 1.100 Klebsiella pneumonia 1.88 Klebsiella oxytoca Citrobacter freundii Citrobacter diversus Serratia liquefaciens Serratia marcescens Enterobacter agglomerans Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Morganella morganii Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Shigella flexneri Shigella dysenteriae Yersinia enterolitica

Claims (22)

1. Werkwijze voor het aantonen van mieroorganismen in een monster, waarbij de te detecteren microorganismen uit het monster worden geïsoleerd met behulp van antilichamen met een specifieke affiniteit voor deze microorganismen en een vaste drager voor deze antilichamen, en vervolgens het DNA van de aldus geïsoleerde microorganismen wordt onderworpen aan een PCR (polymerase chain reaction) waarin voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers worden gebruikt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de aan te tonen microorganismen bestaan uit bacteriën, schimmels of gisten van een bepaald genus, een bepaald species, of een bepaalde stam.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de aan te tonen microorganismen bestaan uit bacteriën van een van de genera Salmonella. Klebsiella of Listeria.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij voor de isolatie van de aan te tonen microorganismen uit het monster monoklonale antilichamen worden gebruikt die opgewekt zijn tegen het levende microorganisme.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij voor de bereiding van de monoklonale antilichamen gebruik is gemaakt van een immunisatie met het levende microorganisme in combinatie of na behandeling met (een groei van de bacterie remmende hoeveelheid) antibioticum of (een opname van de bacterie door fagocyten remmende hoeveelheid) formaldehyde.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij als vaste drager voor de antilichamen, met behulp waarvan de aan te tonen microorganismen uit het monster worden geïsoleerd, magnetische deeltjes worden gebruikt.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de aan te tonen microorganismen uit het monster worden geïsoleerd door aan het monster magnetische deeltjes toe te voegen waaraan monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen zijn gebonden en na incubatie de magnetische deeltjes met, indien aanwezig, daaraan gebonden de aan te tonen microorganismen af te scheiden.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij magnetische deeltjes met daaraan gebonden monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen worden gebruikt die verkregen zijn door de monoklonale antilichamen te incuberen met magnetische deeltjes welke bekleed zijn met antilichamen met specifieke affiniteit voor de monoklonale antilichamen.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij uit de aan de magnetische deeltjes gebonden microorganismen het DNA wordt geïsoleerd en in afwezigheid van de magnetische deeltjes aan een PCR wordt onderworpen.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een rRNA sequentie.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij in de PCR primers worden gebruikt die gebaseerd zijn op gedeeltes van een sequentie van de oorsprong van DNA replicatie.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij bacteriën van het genus Salmonella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

13. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij bacteriën van het genus Klebsiella worden aangetoond en in de PCR gebruik wordt gemaakt van de volgende oligonucleotide primers: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2: 51-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3'

14. Kit voor het aantonen van microorganismen in een monster, omvattende antilichamen met een specifieke affiniteit voor de te detecteren microorganismen, welke antilichamen gebonden zijn aan een vaste drager voor deze antilichamen of voorzien zijn van een middel met behulp waarmee ze aan een eveneens tot de kit behorende vaste drager voor de antilichamen kunnen worden gebonden, alsmede een set van voor de aan te tonen microorganismen specifieke primers voor een PCR (polymerase Chain reaction).

15. Kit volgens conclusie 14, omvattende monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen, opgewekt tegen het levende microorganisme.

16. Kit volgens conclusie 15, omvattende monoklonale antilichamen, bereid onder toepassing van een immunisatie met het levende microorganisme in combinatie of na behandeling met (een groei van de bacterie remmende hoeveelheid) antibioticum of (een opname van de bacterie door fagocyten remmende hoeveelheid) formaldehyde.

17. Kit volgens conclusie 14, omvattende magnetische deeltjes als de vaste drager voor de antilichamen.

18. Kit volgens conclusie 17, omvattende magnetische deeltjes met daaraan gebonden monoklonale antilichamen met specifieke affiniteit voor de aan te tonen microorganismen, verkregen door de monoklonale antilichamen te incuberen met magnetische deeltjes welke bekleed zijn met antilichamen met specifieke affiniteit voor de monoklonale antilichamen.

19. Kit volgens conclusie 14, omvattende een set primers voor de PCR, gebaseerd op gedeeltes van een rRNA sequentie.

20. Kit volgens conclusie 14, omvattende een set primers voor de PCR, gebaseerd op gedeeltes van een sequentie van de oorsprong van DNA replicatie. ►

21. Kit volgens conclusie 14 voor het aantonen van bacteriën van het genus Salmonella, omvattende de volgende oligonucleotide primers voor de PCR: primer 1: 5'-TTATTAGGATCGCGCCAGGC-3' primer 2: 5'-AAAGAATAACCGTTGTTCAC-3'

22. Kit volgens conclusie 14 voor het aantonen van bacteriën van het genus Klebsiella. omvattende de volgende oligonucleotide primers voor de PCR: primer 1: 5'-CTTGTCTTGTGGATAAGTCA-3' primer 2: 51-TCTTCTGTGGATAACTATGC-3'