DE10136472A1 - Vorrichtung und Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen - Google Patents

Vorrichtung und Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen. Die Erfindung ist insbesondere für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella geeignet. Mit der Erfindung soll eine Nachweismöglichkeit für lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen geschaffen werden, bei der der Zeit- und Kostenaufwand, bei gleichzeitig guter Nachweisgenauigkeit, verringert werden kann. Zur Lösung dieser Aufgabe werden magnetisierbare Partikel verwendet, an deren Oberfläche für mindestens einen Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind. Die magnetisierbaren Partikel werden in das Probenvolumen zu einer lokalen Konzentration mit Hilfe eines Permanent- oder Elektromagneten gegeben und für den Nachweis mindestens ein Sensor zur Bestimmung von sich stoffwechselabhängig veränderbaren Stoffkonzentrationen oder der Bildung von Stoffwechselprodukten in den Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen verwendet.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen, die insbesondere für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella geeignet ist. Es sollen außerdem stoffwechselaktive Zellkomponenten nachgewiesen werden können.
  • Solche Nachweisverfahren werden bisher nach § 35 LMBG der Bundesrepublik Deutschland bzw. ISO 6579 durchgeführt, wobei für die dabei durchzuführende Voranreicherung, selektive Anreicherung, Isolierung und Identifizierung ein Zeitraum von mehreren Tagen erforderlich ist und ein solches Vorgehen von sehr qualifiziertem Fachpersonal durchgeführt werden muss. Insbesondere diese lange Zeitdauer ist für viele Anwendungsbereiche, beispielsweise der Lebensmitteltechnik oder im Pharmaziebereich eigentlich nicht vertretbar.
  • Neben den hohen Kosten für die erforderliche Labortechnik müssen Fehler bei einigen Nachweisverfahren in Kauf genommen werden, da eine sichere Trennung in lebende bzw. tote Mikroorganismen oder Zellen nicht ohne weiteres erfolgen kann und demzufolge auch das unkritische Vorhandensein toter Mikroorganismen oder Zellen zu Fehlentscheidungen führt.
  • Es ist daher Aufgabe der Erfindung eine Nachweismöglichkeit für lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen zu schaffen, bei der der erforderliche Zeit- und Kostenaufwand, bei guter Nachweisgenauigkeit verringert werden kann.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 und einem Verfahren, mit den Merkmalen des Anspruchs 16 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung können mit den in den untergeordneten Ansprüchen enthaltenen Merkmalen erreicht werden. Ein vorteilhafte Verwendung ist mit dem Anspruch 27 gegeben.
  • Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen werden in ein Probenvolumen, das beispielsweise eine bestimmte Menge (Masse oder Volumen) einer Probe in einem geeigneten Medium, beispielsweise einer Nährflüssigkeit sein kann, magnetisierbare Partikel an deren Oberfläche für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, zugegeben.
  • Die in dem jeweiligen Probenvolumen enthaltenen magnetisierbaren Partikel sollten beispielsweise durch rühren mit den gegebenenfalls im Probenvolumen enthaltenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen in Kontakt gebracht werden und diese mit Hilfe der entsprechend ausgewählten Bindungsmoleküle an die magnetisierbaren Partikel gebunden.
  • Mit einem Permanentmagneten oder Elektromagneten können dann die magnetisierbaren Partikel aus dem Probenvolumen am Permanentmagneten oder Elektromagneten lokal konzentriert werden.
  • Im Nachgang zu dieser lokalen Konzentration kann dann mit mindestens einem geeigneten Sensor die Stoffwechselaktivität der gegebenenfalls vorhandenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen nachgewiesen werden. Hierzu wird mindestens ein Sensor ausgewählt, mit dem eine sich stoffwechselabhängig veränderbare Stoffkonzentration bestimmt werden kann.
  • Es können an sich bekannte magnetisierbare Partikel, die überwiegend aus einem Polymer, z. B. Polystyrol und zusätzlich zur Sicherung der magnetisierbaren Eigenschaften Magnetit mit einem Anteil zwischen 20 und 70% enthalten, verwendet werden. Neben diesen superparamagnetischen Stoffen können auch Partikel mit ferromagnetischen Eigenschaften eingesetzt werden.
  • Je nach gewünschtem Nachweis können als spezifische Bindungsmoleküle, z. B. mono- oder polyklonale Antikörper, DNA- oder RNA-Fragmente, Biotin, Avidin und andere, die in der Immunotechnik bekannt sind, eingesetzt werden.
  • So können bei einem Nachweis eine Art spezifischer Bindungsmoleküle aber auch zwei oder mehrere solcher Arten gleichzeitig eingesetzt werden.
  • Mit Hilfe eines Permanentmagneten oder Elektromagneten können die magnetisierbaren Partikel und demzufolge auch an die mit Hilfe der spezifischen Bindungsmoleküle, gegebenenfalls in der Probe vorhandene Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen mittels der elektromagnetischen oder magnetischen Kräfte lokal konzentriert werden.
  • Für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen soll mit mindestens einem geeigneten Sensor die Stoffwechselaktivität durch Messung einer sich stoffwechselabhängig veränderbaren Stoffkonzentration in unmittelbarer Nähe der lokal konzentrierten magentisierbaren Partikel durchgeführt werden. Hierzu ist es vorteilhaft, eine sensitive bzw. permeable Membran eines Sensors so anzuordnen und auszubilden, dass diese Membran zwischen den verwendeten Permanentmagneten oder Elektromagneten und der Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert sind, angeordnet ist.
  • Der eigentliche Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen kann auch außerhalb des Probenvolumens durchgeführt werden. Hierzu kann das die magnetisierbaren Partikel und gegebenenfalls Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen enthaltene flüssige Probenvolumen aus einem Gefäß oder Behälter über einen Kanal abgelassen und am Permanentmagneten oder Elektromagneten vorbei geführt werden, wobei die lokale Konzentration beim Vorbeiströmen des flüssigen Probenvolumens am Permanentmagneten oder Elektromagneten erreicht werden kann.
  • Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Permanentmagneten oder Elektromagneten im Nachgang zur lokalen Konzentration der magnetisierbaren Partikel aus dem Probenvolumen zu entfernen und die für den Nachweis erforderlichen Messungen außerhalb in einem gesonderten Gefäß oder Behältnis durchzuführen.
  • Ganz besonders vorteilhaft ist es, während der Messungen der Stoffwechselaktivitäten eine Spüllösung zuzuführen. Eine solche Spüllösung sollte mindestens einen für den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen oder Zellen erforderlich Stoff und gegebenenfalls auch zusätzlich Sauerstoff enthalten. Geeignete Stoffe sind beispielsweise Pepton, Glucose, Hefe- oder Malzextrakt, die jeweils allein oder als Mischung in einer Spüllösung enthalten sein können. Die Spüllösung sollte möglichst unmittelbar auf die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel zumindest jedoch in deren Nähe gerichtet werden. Für den Nachweis von Salmonellen kann in der Spüllösung auch ein für diese Zellen selektives Medium, mit dem andere Zellen unterdrückt werden, enthalten sein.
  • Für die lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel, an die gegebenenfalls lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen gebunden sind, sollte die Fläche nicht größer als 10 mm2 sein, wobei dies über eine entsprechende Auswahl und Gestaltung des verwendeten Permanentmagneten oder Elektromagneten erreicht werden kann. Günstig sind kleinere Flächen im Bereich < 0,5 mm2.
  • Für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen, bei dem überprüft wird, ob diese stoffwechselaktiv sind, können unterschiedliche Sensoren allein oder in Kombination eingesetzt werden.
  • So kann beispielsweise die Sauerstoff- und die CO2- Konzentration bestimmt werden. Es kann aber auch der Glucose-Verbrauch oder ein Lactatsensor eingesetzt werden. Unter Umständen besteht aber auch die Möglichkeit den sich entsprechend verändernden pH-Wert zu bestimmen.
  • Besonders geeignet sind sauerstoffsensitive Sensoren, bei denen in einer Membran ein fluoreszierender Stoff enthalten ist, dessen Fluoreszenzintensität sich in Abhängigkeit der Sauerstoffkonzentration verändert. Solche Sensoren, auch als Optoden bezeichnet, sind aus dem Stand der Technik bekannt und z. B. in DE 198 31 770.0 mit einer speziellen Ausführung einer solchen Membran beschrieben.
  • Die Membranen dieser Sensoren werden für eine Fluoreszenzanregung und dabei der üblicherweise verwendeten Ruthenium-Komplexe mit entsprechendem Licht bestrahlt und Fluoreszenz angeregt. Die Fluoreszenzintensität verringert sich mit steigender Sauerstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe einer solchen Membran. Mittels der mit einem geeigneten optischen Sensor erfassten Fluoreszenzintensität kann auf die Sauerstoffkonzentration geschlossen werden.
  • Häufig wird das Anregungs- und das eigentliche Fluoreszenzlicht über Lichtleitfasern auf die Membran und den optischen Detektor gerichtet, wobei eine solche Lichtführung auch über eine einzige Lichtleitfaser möglich ist.
  • Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann mindestens eine Lichtleitfaser unter der Membran, also zwischen Membran und Permanentmagneten bzw. Elektromagneten angeordnet werden, wobei Lichtein- und -austrittsöffnung(en) unterhalb der Membran auf der gegenüberliegenden Seite, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert sind, angeordnet sind.
  • Vorteilhaft kann eine Membran in der Wand eines das Probenvolumen enthaltenden Gefäßes eingefasst sein und so einen Teil der Gefäßwand darstellen. Für den Nachweis der lebenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen wird die lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel mit einer Bewegung eines Permanentmagneten oder Elektromagneten in Richtung auf die Außenseite der Membran durchgeführt und der Permanent- oder Elektromagnet dort gehalten wird. Dabei trennt die Membran das gegebenenfalls kritische Probenvolumen und den Magneten, so dass eine Kontamination des Permanentmagneten oder Elektromagneten verhindert werden kann.
  • Das Gefäß kann dann so ausgebildet sein, dass eine Zufuhr für Spüllösung angeschlossen werden kann und außerdem mindestens eine Lichtleitfaser über die Fluoreszenzanregungslicht in die entsprechend sensitive Membran gerichtet und das angeregte Fluoreszenzlicht zu einem optischen Detektor geführt werden kann, ebenfalls von außen angesetzt werden. Dies trifft auch auf gegebenenfalls zusätzlich verwendete Spiegel oder Linsen zu.
  • Mit einer solchen Ausbildung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, die für den Nachweis genutzten Gefäße nach einmaliger Nutzung ohne Gefahr für die Umwelt mit entsprechenden Mitteln zu entsorgen und demzufolge für jeden einzelnen Nachweis ein neues Gefäß zu verwenden.
  • Da der Magnet bzw. ein Elektromagnet in der Regel eine ebene Fläche bildet, in denen gegebenenfalls auch eine Nut ausgebildet sein kann, in die eine Lichtleitfaser eingeführt ist, und diese Fläche von der sensitiven Membran überdeckt ist, ist es vorteilhaft, die Lichtein- und Lichtaustrittsflächen der Lichtleitfaser(n) als schräg geneigte Flächen auszubilden, um das aus der Lichtleitfaser austretende Anregungslicht auf die sensitive Membran zu richten und von dort das Fluoreszenzlicht in eine Lichtleitfaser einkoppeln zu können. Das Licht kann aber auch mittels eines Spiegels und falls erforderlich einer fokussierenden Linse für jede Lichtleitfaser auf eine solche sensitive Membran gerichtet bzw. von dort emittiertes Fluoreszenzlicht in eine Lichtleitfaser eingekoppelt werden.
  • Es besteht aber auch die Möglichkeit, auf einer solchen sauerstoffsensitiven Membran eine zweite Oxidoreduktasemembran anzuordnen, wie dies beispielsweise in DE 199 03 506 A1 beschrieben ist. Mit einer solchen Ausbildung kann indirekt über durch den Stoffwechsel von Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen entstehende Produkte, die außerhalb der Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen mit einer Oxidoreduktasemembran enzymatisch unter Sauerstoffverbrauch umgewandelt werden, mit der sauerstoffsensitiven Membran der Nachweis erfolgen.
  • Eine sich stoffwechselabhängig ändernde Sauerstoffkonzentration kann aber auch amperometrisch bestimmt werden. In diesem Fall kann anstelle der einen fluoreszierenden Stoff enthaltenden Membran eine sauerstoffpermeable Membran verwendet werden, die die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel und eine zwei Elektroden und einen Elektrolyten enthaltende Einheit trennt und bei der sich der zwischen den Elektroden über den Elektrolyten fließende elektrische Strom in Abhängigkeit des durch die sauerstoffpermeable Membran gelangenden Sauerstoffes verändert.
  • Für den Nachweis können magnetisierbare Partikel mit maximalem Durchmesser von 5000 µm, bevorzugt im Bereich zwischen 2 und 3 µm eingesetzt werden. Im definierten Probenvolumen sollten Konzentrationen von magnetisierbaren Partikeln im Bereich zwischen 0,1 µg/ml bis maximal 100 mg/ml, bevorzugt bis zu 10 mg/ml eingehalten werden.
  • Zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit ist es vorteilhaft, mit der bereits vorab erwähnten Spüllösung zusätzliche magnetisierbare Partikel oder diese in anderer Form zuzuführen, die frei von Bindungsmolekülen sind. Diese bindungsmolekülfreien magnetisierbaren Partikel lagern sich auf den vorab lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikeln ab, an denen gegebenenfalls Mikroorganismen oder Zellen gebunden sind und bilden eine Diffusionssperre für den sich in seiner Konzentration stoffwechselabhängig ändernden Stoff (beispielsweise Sauerstoff), wobei die Durchmesser dieser magnetisierbaren Partikel funktionsbedingt angepasst werden können. So können hierfür auch Durchmesserfraktionen solcher magnetisierbaren Partikel mit unterschiedlichen Durchmessern ohne weiteres sinnvoll sein.
  • An die magnetisierbaren Partikel können spezifische Antikörper und für die bevorzugt genannte Verwendung der Erfindung können an die magnetisierbaren Partikel mono- oder polyklonale Salmonella Antikörper für den Nachweis von Zellen der Gattung Salmonella gebunden werden. Mit der erfindungsgemäßen Lösung können solche Zellen sicher und in wesentlich kürzerer Zeit nachgewiesen werden. Dabei wirkt sich besonders günstig die sehr schnell fortschreitende Zellteilung und demzufolge die relativ schnelle Erhöhung der Anzahl von stoffwechselaktiven Salmonellen aus.
  • Da auch andere Einflüsse eine sich verändernde Konzentration des entsprechend detektierten Stoffes hervorrufen können, wie dies beispielsweise das Eindiffundieren von Sauerstoff sein kann, ist es vorteilhaft, jeweils eine Referenzmessung mit einem gleichen Sensor unter vom Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen unbeeinflussten Bedingungen durchzuführen und die bei der Referenzmessung gewonnen Messwerte mit den eigentlichen Messwerten zu vergleichen bzw. zu verrechnen.
  • Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen aus einem Probenvolumen mehrfach durchzuführen. Hierfür kann eine Resuspendierung der lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel vorgenommen werden und mit diesen magnetisierbaren Partikeln aus dem Probenvolumen, durch erneute Anbindung von Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen der Vorgang wiederholt wird.
  • In einer anderen möglichen Alternative besteht aber auch die Möglichkeit, aus dem Probenvolumen im Nachgang zu einer ersten lokalen Konzentration magnetisierbarer Partikel, durch Zugabe weiterer magnetisierbarer Partikel an die spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, eine weitere lokale Konzentration und anschließende Messung durchzuführen.
  • In einer weiteren Alternative kann der Nachweis aber auch so geführt werden, dass von gegebenenfalls in einem Probenvolumen enthaltenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen ein Stoff aufgenommen wird, der in den Zellen enzymatisch aufgespalten und dadurch polar wird. Dieser Stoff, als ein im Inneren von Zellen gebildetes Stoffwechselprodukt, kann dann mit elektromagnetischen Wellen angeregt werden, so dass angeregtes Fluoreszenzlicht optisch detektiert werden kann. Da eine entsprechende enzymatische Aufspaltung lediglich von stoffwechselaktiven, also lebenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen durchgeführt werden kann, ist auch dieses Vorgehen für den Nachweis geeignet.
  • In anderer Form können aber auch entsprechend geeignete Stoffe, bei denen Fluoreszenz angeregt werden kann, auf der Oberfläche der magnetisierbaren Partikel fixiert werden, und nach Bestrahlung mit entsprechend für Fluoreszenzanregung geeigneten elektromagnetischen Wellen das Fluoreszenzlicht mit einem optischen Sensor erfasst und gegebenenfalls als Referenzsignal genutzt werden.
  • Selbstverständlich erfolgt die Messung von Fluoreszenzlicht in jedem Falle entsprechend wellenlängenselektiv, wofür beispielsweise geeignete Filter einsetzbar sind.
  • Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.
  • Dabei zeigt:
  • Fig. 1 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in zwei Ansichten in schematischer Form.
  • In der Fig. 1 sind in schematischer Form zwei Ansichten eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Wobei bei diesem Beispiel die sich stoffwechselabhängig verändernde Sauerstoffkonzentration gemessen wird.
  • In einem Gefäß 1 ist ein Probenvolumen 2 enthalten. In das Probenvolumen 2 wurden magnetisierbare Partikel an die spezifische Bindungsmoleküle für die nachzuweisenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen, beispielsweise Salmonella-Antikörper gebunden.
  • Das Probenvolumen 2 wurde dann verrührt, was in nicht dargestellter Form durch einfache Hin- und Herbewegung oder Drehung um eine Achse des Gefäßes 1 erfolgen kann.
  • In der Wandung des Gefäßes 1 ist eine sauerstoffsensitive Membran 4 eingefasst. Das Einfassen kann durch Einkleben, Verschweißen mit der Gefäßwand oder durch entsprechend abgedichtete Klemmverbindungen erfolgen. In der sauerstoffsensitiven Membran 4 ist ein geeigneter fluoreszierender Stoff, beispielsweise ein für diesen Einsatzzweck bekannter Ruthenium-Komplex enthalten. Eine Seite der sauerstoffsensitiven Membran 4 steht dabei mit dem Probenvolumen 2 in Kontakt.
  • Nach einer bestimmten vorgebbaren Zeit und ordentlichem Vermischen der magnetisierbaren Partikel im Probenvolumen 2 wird eine lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel an der sauerstoffsensitiven Membran 4 durch entsprechende Bewegung des Permanentmagneten 3, wie dies mit dem Doppelpfeil angedeutet ist, durchgeführt und der Permanentmagnet 3 berührt dabei die außenliegende Seite der sauerstoffsensitiven Membran 4 oder wird in einem kleinem Abstand zur Membran 4 gehalten.
  • Durch die magnetischen Kräfte werden die magnetisierbaren Partikel an der entgegengesetzt zum Permanentmagneten 3 angeordneten Fläche der sauerstoffsensitiven Membran 4 lokal konzentriert.
  • Sind an die magnetisierbaren Partikel lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen (z. B. Salmonella) gebunden, wird durch den Stoffwechsel Sauerstoff verbraucht. Dieser Sauerstoffverbrauch erhöht sich sukzessive durch die Erhöhung der zellteilungsbedingten Anzahl der Zellen und durch Messung der sich entsprechend verändernden Sauerstoffkonzentration kann der Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen durchgeführt werden.
  • Für einen solchen Nachweis wird monochromatisches Licht einer nicht dargestellten Lichtquelle durch die Lichtleitfaser 6 auf die sauerstoffsensitive Membran 4 gerichtet, wobei hierfür verschiedene Alternativen im allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt worden sind. Mit diesem Anregungslicht wird Fluoreszenzlicht in der sauerstoffsensitiven Membran 4 angeregt und die Intensität dieses Fluoreszenzlichtes verändert sich in Abhängigkeit der Sauerstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe der sauerstoffsensitiven Membran 4, also dort, wo die magnetisierbaren Partikel mit den gegebenenfalls daran gebundenen lebenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen lokal konzentriert worden sind.
  • Das Fluoreszenlicht kann durch die eine Lichtleitfaser 6 aber auch durch eine zusätzliche Lichtleitfaser (nicht dargestellt) auf einen optischen Sensor gerichtet werden. Die mit diesem optischen Sensor gemessenen Fluoreszenzintensitäten können dann auf unterschiedlichste Art und Weise ausgewertet werden, um auf die jeweilige sich gegebenenfalls infolge des Stoffwechsels der Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen verändernden Sauerstoffkonzentration zu schließen. So kann die sich ändernde Fluoreszenzintensität unmittelbar hierfür genutzt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit die sich in Abhängigkeit der momentanen Sauerstoffkonzentration verändernde Phasenverschiebung bei freguenzmodeliertem Anregungslicht zwischen dem für die Fluoreszenzanregung genutzten Licht und dem Fluoreszenzlicht oder das Abklingverhalten des Fluoreszenzlichtes bei beispielsweise einer gepulsten Fluoreszenzanregung auszunutzen.
  • Vor oder während der Messungen kann über eine Zuführleitung 5 Spüllösung unmittelbar zu den lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikeln an der sauerstoffsenistiven Membran 4 herangeführt werden, wobei eine Spüllösung, wie sie im allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt worden ist, eingesetzt werden kann. Die Messung der Sauerstoffkonzentration kann kontinuierlich, aber auch in mehr oder weniger großen Zeitabständen durchgeführt werden. Zur Vermeidung von Kontaminationen kann in der Zuführleitung 5 ein Membranfilter 7 vorgesehen werden.
  • Für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella ist ein Zeitraum zwischen 3 und 8 h ausreichend, um eine sichere Nachweisgenauigkeit zu gewährleisten, was eine erhebliche Verkürzung gegenüber den herkömmlichen Nachweisverfahren ist.
  • Der Nachweis sollte unter klimatisierten Bedingungen erfolgen. Hierfür kann eine entsprechende Vorrichtung in einem herkömmlichen Brutschrank angeordnet werden oder ein entsprechend temperierbares Gefäß 1 eingesetzt werden.

Claims (27)

1. Vorrichtung für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen (2), in dem magnetisierbare Partikel, an deren Oberfläche für mindestens einen Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, enthalten sind,
einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten zur lokalen Konzentration und Halten der magnetisierbaren Partikel und
mindestens einem Sensor zur Bestimmung von sich stoffwechselabhängig veränderbaren Stoffkonzentrationen oder der Bildung von Stoffwechselprodukten in Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten und der Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel und gegebenenfalls nachzuweisende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen gehalten sind, mindestens eine Membran (4) eines Sensors angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Spüllösungszuführung (5) für die Zufuhr einer Spüllösung vorhanden ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert gehalten sind, kleiner als 10 mm2 ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor ein Sauerstoff-, CO2-, Glucose-, Laktatsensor und/oder optischer Sensor ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (4) eines Sensors in eine Wandung eines das Probenvolumen (2) enthaltenden Gefäßes (1) eingefasst ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Sauerstoffsensor eine einen sauerstoffsensitiven, fluoreszierenden Stoff enthaltende Membran (4) aufweist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Lichtleitfaser (6) zur Membran (4) des Sensors geführt ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Membran (4) des Sauerstoffsensors eine Oxidoreduktasemembran angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein amperometrisch messender Sauerstoffsensor vorhanden ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass an die magnetisierbaren Partikel Antikörper gebunden sind.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass an die magnetisierbaren Partikel Salmonella-Antikörper gebunden sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisierbaren Partikel einen maximalen Durchmesser von 5000 µm aufweisen.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Konzentration der magnetisierbaren Partikel im Probenvolumen (2) kleiner als 100 mg/ml eingehalten ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass in der Spüllösung zusätzliche, bindungsmolekülfreie magnetisierbare Partikel enthalten sind.
16. Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen, bei dem
magnetisierbare Partikel an die für mindestens einen Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, zugegeben und verrührt werden,
die magnetisierbaren Partikel dann mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten lokal konzentriert und gehalten sowie
mit mindestens einem Sensor (4), mit dem sich eine infolge lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen stoffwechselabhängig verändernde Stoffkonzentration über ein vorgebbares Zeitintervall gemessen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffkonzentration gemessen wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass Spüllösung vor oder während der Messung zugeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sauerstoff und mindestens einen für den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen erforderlichen Stoff enthaltende Spüllösung verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Spüllösung zusätzliche magnetisierbare Partikel zugeführt werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mit mindestens einem zweiten Sensor eine vom Stoffwechsel der Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen unbeeinflusste Referenzmessung durchgeführt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel resuspensiert, mit dem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten erneut lokal konzentriert und die Messung der sich stoffwechselabhängig verändernden Stoffkonzentration erneut durchgeführt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer ersten lokalen Konzentration magnetisierbarer Partikel mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten aus dem Probenvolumen (2) weitere magnetisierbare Partikel an die spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, dem Probenvolumen zugegeben, verrührt und mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten lokal konzentriert und mit mindestens einem Sensor eine sich stoffwechselabhängig ändernde Stoffkonzentration gemessen wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung im Anschluss an die lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel außerhalb des Probenvolumens durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Magnet (3) oder Elektromagnet zur lokalen Konzentration magnetisierbarer Partikel von außen an eine in eine Gefäßwand eines das Probenvolumen (2) enthaltenden Gefäßes (1) eingefasste Membran (4) geführt und dort gehalten wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem optischen Sensor Fluoreszenzlicht eines auf der Oberfläche von magnetisierbaren Partikeln fixierten fluoreszierten Stoffes oder eines von Zellen aufgenommenen durch enzymmatische Aufspaltung polarisierten fluoreszierenden Stoffes detektiert wird.
27. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella.
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