DE10127045C2

DE10127045C2 - Verfahren zum Nachweis einer Substanz und Mikrotiterplatte

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Publication number: DE10127045C2
Application number: DE10127045A
Authority: DE
Inventors: Hans Kosak
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2001-06-02
Filing date: 2001-06-02
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2021-06-03
Also published as: AU2002314119A1; DE10127045A1; WO2002099417A3; US7276369B2; US20040248117A1; WO2002099417A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Ana lyten sowie eine dazu geeignete Mikrotiterplatte.

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Suche und des Nachweises von pharmakologischen Wirkstoffen. Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, z. B. in einer Mikrotiterplatte, eine Testsubstanz bzw. Substanz mit einer Vielzahl verschie dener potentieller Reaktionspartner in Kontakt zu bringen. Falls die Substanz eine Affinität zu einem potentiellen Reak tionspartner besitzt, kommt es zur Reaktion zwischen der Sub stanz und dem Reaktionspartner. Die Reaktion kann beispiels weise eine chemische Umsetzung oder eine Bindung sein. Die Reaktion wird anhand einer Veränderung der physikalischen Ei genschaften der Lösung nachgewiesen.

Zum Nachweis dienen Verfahren wie die Fluoreszenzpolarisati on, der Fluorenszenz-Resonanz-Energie-Transfer, die Fluorens zenz-Kollerations-Spektroskopie und radioaktive Markierungs verfahren. Die bekannten Nachweisverfahren sind aufwendig. Sie erfordern z. T. den Einsatz giftiger Substanzen.

Weiterhin sind nach dem Stand der Technik Verfahren bekannt, welche eine elektrophoretische Trennung einer Vielzahl von Substanzgemischen parallel ermöglichen. Es bietet z. B. die Firma Advanced Biotechnologies unter dem Kennzeichen "MIDGE" eine Vorrichtung an, mit der bis zu 100 DNA-Proben parallel elektrophoretisch getrennt werden können. Dazu wird jede DNA- Probe in eine Tasche eines Gels eingefühlt. Anschließend wird über das Gel ein elektrisches Feld angelegt, so daß die Proben in das Gel transportiert und dort aufgetrennt werden. Die Auswertung erfolgt über die Laufstrecke der Bestandteile der DNA-Probe im Gel. - Das bekannte Verfahren ist zeitaufwendig.

Aus der DE 199 52 160 A1 ist ein Verfahren zum Nachweis eines ersten Moleküls in einer Lösung bekannt, bei dem ein Farb stoff-gekoppeltes zweites Molekül an das erste Molekül binden kann. Die elektrische Nettoladung des zweiten Moleküls ist dabei dem Betrag nach kleiner als und von entgegengesetztem Vorzeichen wie die elektrische Nettoladung des ersten Mole küls. In der Lösung befindet sich eine Anode und eine Katho de, zwischen denen ein elektrisches Feld angelegt wird. Der Farbstoff wird, falls die elektrische Nettoladung des ersten Moleküls negativ ist, an der Anode und falls die elektrische Nettoladung des ersten Moleküls positiv ist, an der Kathode optisch nachgewiesen.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfah ren und eine Mikrotiterplatte angegeben werden, mit denen universell und ohne großen Aufwand gleichzeitig das Reakti onsverhalten einer Vielzahl von Substanzen untersucht werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 14 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 13 und 15 bis 33.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis ei nes Analyten mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Bereitstellen einer ein Nachweisreagenz enthaltenden Lö sung in einem Behälter,
b) Zugabe des Analyten zur Lösung,
c) Anlegen eines auf die Lösung wirkenden elektrischen Fel des mittels sich außerhalb des Behälters befindenden Elektro den, so daß sich die Konzentration eines für die Anwesenheit des Analyten spezifischen Stoffs in einem Bereich des Behäl ters ändert und
d) optisches Erfassen der Konzentrationsänderung.

Das vorgeschlagene Verfahren ist universell. Es läßt sich einfach durchführen. Der Einsatz gefährlicher oder giftiger Nachweisreagenzien ist nicht erforderlich. Es kann insbeson dere gleichzeitig die Wirkung einer großen Anzahl von Nachweisreagenzien auf einen Analyten untersucht werden. Das Nachweisreagenz ist spezifisch für den Analyten. Es reagiert oder bindet mit dem Analyten, so daß dessen elektrophoreti sche Beweglichkeit sich ändert. Besonders vorteilhaft ist, daß außer der Zugabe des Analyten in Schritt lit. b keine weitere Zugabe zu oder Entnahme aus dem Behälter erfolgt. Da durch werden Pipettierfehler vermieden, und es wird ein hoher Probendurchsatz ermöglicht.

Durch das Anlegen des elektrischen Feldes in Schritt lit. c mit Elektroden, die sich außerhalb des Behälters (B) befin den, können elektrolytische Reaktionen an den Elektroden ver mieden werden. Die Lösung kann nach dem Schritt lit. b inku biert werden. Zum optischen Erfassen der Konzentrationsände rung in Schritt lit. d ist keine Entnahme von Flüssigkeit aus dem Behälter notwendig. Die optische Erfassung erfolgt zweck mäßigerweise durch die Öffnung und/oder den Boden des Behäl ters.

Vorteilhafterweise ist der Stoff ein Nachweisreagenz, ein aus dem Nachweisreagenz und der Substanz gebildetes Reaktionspro dukt oder ein Kompetitor. Das Nachweisreagenz kann ferner ei nen Rezeptor, einen Kompetitor oder ein Vorprodukt des Reak tionsprodukts enthalten. Der Rezeptor ist zweckmäßigerweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Peptid, Protein, Nu kleinsäure, Zucker, Antikörper, Lektin, Avidin, Streptavidin, PNA oder LNA.

Der Stoff kann mit einer Fluorophor markiert sein. Es kann sich z. B. um ein Molecular Beacon handeln. Der Stoff kann an den und/oder im Boden des Behälters gebunden werden.

Zur optischen Erfassung der Konzentrationsänderung wird zu mindest der Bereich mit einem Lichtstrahl durchstrahlt und dessen durch den Stoff bewirkte Änderung gemessen. Bei dem Lichtstrahl kann es sich um einen Laserstrahl handeln. Es kann Durch- oder Auflicht genutzt werden. Bei der bewirkten Änderung des Lichtstrahls kann es sich um eine Intensitätsän derung, um eine Änderung der Polarisationsebene, um einen Streuwinkel oder dgl. handeln. Zweckmäßigerweise wird der Lichtstrahl so geführt, daß er im wesentlichen senkrecht aus dem Boden oder der Öffnung des Behälters ein oder austritt. Das vereinfacht die Messung. Das Verfahren ist somit für Standard-Mikrotiterplatten-Reader geeignet.

Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird das elektrische Feld gleichzeitig über einer Vielzahl von Behäl tern angelegt. Das optische Erfassen der Konzentrationsände rung in der Vielzahl der Behälter kann ebenfalls gleichzeitig erfolgen. Bei den Behältern handelt es sich zweckmäßigerweise um Behälter, die nach Art einer Mikrotiterplatte auf einem gemeinsamen Träger angeordnet sind.

Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist zur Durchführung des Verfahrens eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl an Behäl tern vorgesehen, welche zumindest abschnittsweise aus einem ionenleitenden Material gebildet sind. - Die Verwendung eines ionenleitenden Materials ermöglicht es, durch eine im elek trischen Feld hervorgerufene Wanderung von Ionen eine für den Analyten spezifische Konzentrationsänderung zu bewirken, wel che optisch erfaßbar ist.

Zweckmäßigerweise sind die Wände und/oder der Boden der Be hälter aus den ionenleitenden Material hergestellt. Der Boden kann aus einem elektrischen Isolator hergestellt sein. Er kann ferner für die Bindung eines Liganden, Rezeptors oder Substrats aktiviert sein. Es ist aber auch möglich, daß auf dem Boden ein Rezeptor oder Substrat immobilisiert ist. Nach einer weiteren Ausgestaltung können auf vorgegebenen Ab schnitten des Bodens unterschiedliche Rezeptoren immobili siert sein. Der Boden kann aus Glas, Quarz oder Kunststoff hergestellt sein.

Die Wände können aus einem porösem Material bestehen. Sie können für die Bindung eines Liganden aktiviert sein. Ferner ist es möglich, daß die Wände Hilfsstoffe, z. B. Quencher oder Protein- oder Nukleinsäure-bindende Stoffe enthalten.

Die Behälter können nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal einen im wesentlichen rechteckigen Querschnitt aufweisen. Da bei sind zwei Wände des Behälters parallel zu den Elektroden angeordnet. Das elektrische Feld ist bei einer solchen Anord nung homogen über das Volumen des Behälters ausgebildet.

Das ionenleitende Material kann aus einem Material herge stellt sein, das vorzugsweise aus der folgenden Gruppe ausge wählt ist: Agarose, Polyacrylamid, Zellulose, Papier, Pappe, poröses Silikat, Polystyrol, Polyvenylchlorid, Polycarbonat, Nylon, Polyethylen. Selbstverständlich sind auch andere Mate rialien mit ionenleitenden Eigenschaften geeignet. Die vorge nannten Materialien sind zweckmäßigerweise porös ausgebildet.

Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung sind die Be hälter in Form von Ausnehmungen in einer aus dem ionenleiten den Material hergestellten ersten Platte ausgebildet. Der be griff "Platte" ist hier weit zu interpretieren. Es kann sich dabei auch um eine Folie oder um eine auf einen Träger aufge brachte Schicht handeln. Die erste Platte kann auf einer, den Boden bildenden zweiten Platte aufgebracht sein, und die er ste Platte kann die Wände der Behälter aufweisen. Die Wände können z. B. durch die Innenwand von in der ersten Platte ge bildeten Durchbrüchen gebildet sein. Die zweite Platte kann z. B. aus Glas oder einem durchsichtigen Kunststoff herge stellt sein. Auf die erste Platte ist nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal eine hydrophobe Deckschicht aufge bracht. Das erleichtert das Befüllen der Behälter. Das hydro phobe Material kann aus einer Folie gebildet sein, die zweck mäßigerweise aus einem lichtundurchlässigen Material gebildet ist.

Das ionenleitende Material kann zwischen zwei Elektroden vor gesehen sein. Die Elektroden können getrennt von den Behäl tern vorgesehen sein. Die Elektroden können aus gängigem Ma terial, wie z. B. Silber, Gold, Platin, Kupfer, Aluminium oder elektrisch leitfähigem Kunststoff und dgl. hergestellt sein. Sie können z. B. an dem ionenleitenden Material angebracht oder damit über eine das ionenleitende Material durchdringen de wäßrige Lösung in ionenleitendem Kontakt sein.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Schnittansicht einer ersten Mikrotiterplatte,

Fig. 2 eine schematische Schnittansicht einer zweiten Mikrotiterplatte,

Fig. 3 eine schematische Schnittansicht einer dritten Mikrotiterplatte

Fig. 4 eine schematische Schnittansicht einer vierten Mikrotiterplatte,

Fig. 5 eine schematische Schnittansicht einer fünften Mikrotiterplatte,

Fig. 6 eine Draufsicht auf die Mikrotiterplatte gemäß Fig. 4,

Fig. 7a bis c eine erste Verfahrensvariante,

Fig. 7d bis f eine Modifikation der ersten Verfahrensvarian te,

Fig. 8a bis c eine zweite Verfahrensvariante,

Fig. 9a bis c eine dritte Verfahrensvariante,

Fig. 10a bis c eine vierte Verfahrensvariante,

Fig. 11a bis c eine fünfte Verfahrensvariante,

Fig. 12a bis c eine sechste Verfahrensvariante.

In Fig. 1 ist eine schematische Schnittansicht einer ersten besonders einfach aufgebauten Mikrotiterplatte gezeigt. Es handelt sich dabei um eine erste Platte 1, welche an ihrer einen Seite eine Vielzahl von Ausnehmungen 2 aufweist. Jede der Ausnehmungen 2 bildet einen Behälter B zur Aufnahme einer einen Analyten einhaltenden Lösung. Die erste Platte 1 kann z. B. aus einem Agarose- oder Polyacrylamid-Gel bestehen. Sol che Gele können z. B. in Form herkömmlicher Mikrotiterplatten gegossen werden. Es ist auch möglich, die erste Platte 1 aus ionenleitendem Material, wie Zellulose oder deren Derivaten herzustellen. Die Formgebung kann hier mittels Pressen erfol gen. Ferner kann die erste Platte 1 aus porösem Polystyrol, Polyvenylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polymethylmeta crylat, Polypropylen und dgl. hergestellt werden. In diesem Fall kann die Mikrotiterplatte nach dem Spritzgußverfahren hergestellt werden. Mit dem Bezugszeichen 3 sind an den Quer seiten der ersten Platte 1 angebrachte Elektroden bezeichnet. Die Elektroden 3 können aus dafür geeigneten Metallen, wie Platin, Gold, Silber, einem elektrisch leitfähigen Kunststoff und dgl. hergestellt sein.

Bei der in Fig. 2 gezeigten zweiten Mikrotiterplatte ist die aus ionenleitendem Material hergestellte erste Platte 1 auf einer zweiten Platte 4 aufgebracht. Die erste Platte 1 weist in diesem Fall ein Vielzahl von Durchbrüchen 5 auf. Die In nenwände der Durchbrüche 5 bilden die Wände der Behälter B. Deren Boden Bo wird durch die der ersten Platte 1 zugewandte Seite der zweiten Platte 4 gebildet. Die zweite Platte 4 kann z. B. aus Glas, Quarz oder Polystyrol hergestellt sein. Sie ist zweckmäßigerweise durchsichtig ausgebildet. Die zweite Mikrotiterplatte kann auf einfache Weise hergestellt werden, indem z. B. auf eine Glasplatte eine Agarose-Gel aufgegossen wird. Die Durchbrüche im Agarose-Gel können durch auf die Glasplatte zuvor aufgebrachte, geeignete Kunststoffkerne er zeugt werden, die nach dem Erstarren des Agarose- oder Poly acrylamid-Gels wieder entfernt werden.

Am Boden Bo können z. B. Nachweisstoffe, wie Peptite, Protei ne, Nukleinsäuren und dgl. immobilisiert sein. Es ist auch möglich, daß der Boden Bo durch dort vorhandene chemische Gruppen, wie Aldehyd-, Epoxid-, Aminogruppen oder Biotin ak tiviert ist. Der Boden Bo kann aber auch aus einem ionenlei tenden Material hergestellt sein.

Bei den in den Fig. 3 bis 5 gezeigten dritten, vierten und fünften Mikrotiterplatten ist auf der ersten Platte 1 jeweils eine hydrophobe Deckschicht 7 aufgebracht. Die hydrophobe Deckschicht 7 weist zweite Durchbrüche 8 auf, welche zu den ersten Durchbrüchen 5 korrespondieren. Bei der in Fig. 4 ge zeigten vierten Mikrotiterplatte weist die erste Plätte 1 we der erste Ausnehmungen 2 noch erste Durchbrüche 5 auf. Die erste Platte 1 bildet hier den Boden Bo der Behälter B. Bei dem in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiel sind erste Aus nehmungen 2 in der ersten Platte 1 vorgesehen, welche mit den zweiten Durchbrüchen 8 in der Deckschicht 7 korrespondieren. Die ersten Durchbrüche 5 korrespondieren mit den zweiten Aus nehmungen 6, so daß die Ausnehmungen 6 den unteren Teil, d. h. einen unteren Wandabschnitt und den Boden Bo, der Behälter B bilden.

In Fig. 6 ist der in den Fig. 3 bis 5 im Querschnitt gezeigte dreischichtige Aufbau der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte nochmals in Draufsicht gezeigt. Die Ausnehmungen 2 bzw. er sten 5 und zweiten Durchbrüche 8 können selbstverständlich auch rechteckig oder quadratisch ausgebildet sein.

In den Fig. 7 bis 12 ist ein Teilbereich des Behälters B ge zeigt. Der Behälter hat oben eine Öffnung Öf und ist begrenzt durch Wand W und Boden Bo. Die Wände W und/oder der Boden Bo bestehen aus einem ionendurchlässigen Material. Dieses Ma terial hat die Eigenschaft, bei Kontakt mit einem Elektroly ten und dem Anlegen einer Spannung, einen elektrophoretischen Ionenfluß in das Material zu erlauben. Mit M ist der Bereich des Behälters B bezeichnet, der bei einer optischen Messung erfaßt wird. Der Bereich M kann den Boden einschließen. Beim Bereich M kann es sich z. B. um einen mittigen Bereich des Be hälters B handeln.

Bei der in Fig. 7a bis c gezeigten ersten Verfahrensvariante ist an den Boden Bo ein Nachweisstoff N gebunden. Dabei kann es sich z. B. um ein Substrat für Proteasen oder andere lyti sche Proteine handeln. Der Nachweisstoff N kann z. B. mittels Fluorophors markiert sein. Ein Analyt ist mit dem Bezugszei chen A bezeichnet. Dabei kann es sich z. B. um eine Protease oder andere lytische Proteine handeln. Bei Zugabe des Analy ten A spaltet der Analyt den Nachweisstoff N und setzt da durch ein Fragment Fr frei. Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (Fig. 7c) wirkt eine elektrophoretische Kraft auf das Fragment Fr und das Fragment Fr wandert in oder an die Wand W des Behälters B. Die Konzentration des Fragments Fr in dem Behälter B nimmt ab. Das Fragment Fr trägt eine Markierung z. B. ein Fluorophor oder ist aufgrund anderer Eigenschaften optisch nachweisbar. Die Konzentration des Fragments kann an hand einer Fluoreszenzmessung im Bereich M bestimmt werden. In dieser Anordnung zeigt die Abnahme der Fluoreszenz, das Vorhandensein des nachzuweisenden Analyten A an.

In den Fig. 7d bis 7f ist eine homogene Verfahrensvariante des in Fig. 7a bis c beschriebenen Verfahrens dargestellt. In einem Behälter B befindet sich ein geladener und frei-beweg licher Nachweisstoff N. Der Nachweisstoff N ist geladen und kann z. B. mittels Fluorophors markiert sein. Bei dem Nach weisstoff kann es sich z. B. um ein Substrat für Proteasen oder andere lytische Proteine handeln. Ein Analyt A wird mit dem Nachweisstoff N in Kontakt gebracht. Dabei kann es sich z. B. um eine Protease oder andere lytische Proteine handeln. Bei Zugabe des Analyten A spaltet der Analyt A den Nachweis stoff N in zwei Fragmente Fr1 und Fr2. Fr1 ist ungeladen und ist optisch z. B. durch ein Fluorophor nachweisbar. Fr2 ist geladen. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes (Fig. 7f) wirkt eine elektrophoretische Kraft auf den Nachweisstoff N und das geladene Fragment Fr2. Nachweisstoff N und Fragment Fr2 wandern in oder an die Wand W des Behälters B. Das unge ladene Fragment Fr1 bleibt im Behälter B. Die Konzentration des Fragments Fr1 in dem Behälter ist ein Indikator für die Anwesenheit des Analyten A. Die Konzentration des Fragments Fr kann anhand einer optischen Messung z. B. einer Fluores zenzmessung im Bereich M bestimmt werden.

Bei der in Fig. 8a bis c gezeigten zweiten Verfahrensvariante ist ein Nachweisstoff N am Boden Bo des Behälters B gebunden. Dabei handelt es sich z. B. um einen Liganden, ein Antigen, einen Rezeptor, einen Antikörper oder eine Nukleinsäure. Ein Analyt A wird mit dem Nachweisstoff N in einer Lösung in Kon takt gebracht. Beim Analyten A kann es sich z. B. um einen Re zeptor, einen Antikörper, einen Liganden, ein Antigen oder eine komplementäre Nukleinsäure handeln. Der Analyt A bindet an den Nachweisstoff N. Der Analyt A ist z. B. mittels eines Fluorogens F markiert. Bei Anlegen eines elektrischen Felds wandert der Analyt A in die ionenleitende Wand W. Sofern der Nachweisstoff N spezifisch für den Analyten A ist, bindet ein Teil des Analyten A an den Nachweisstoff N. Die Bindung des Analyten A an den zweiten Nachweisstoff N ist mittels eines durch das Fluorophor F Fluoreszenzsignals nachweisbar.

Bei der in Fig. 9a bis c gezeigten dritten Verfahrensvariante verdrängt ein Analyt A einen Nachweisstoff N aus dessen Bin dung an einen definierten Bindungsort. Die Bindung des Analy ten A und die Bindung des Nachweisstoffs N ist jeweils spezi fisch. Bei dem Bindungsort kann es sich beispielsweise um ei nen am Boden Bo immobilisierten Antikörper oder eine immobi lisierte Nukleinsäure handeln. Bei dem Nachweisstoff N kann es sich um ein spezifisches Antigen oder eine komplementäre Nukleinsäure handeln. Durch die Verdrängung des Nachweisstoffs N durch den Analyten A ist der zuvor immobilisierte Nachweisstoff N freibeweglich. Der Nachweisstoff N ist gela den. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wird der Nach weisstoff N in oder an die ionendurchlässige Wand W bewegt. Die Konzentration des Nachweisstoffs N wird durch eine opti sche Messung im Bereich M ermittelt. Die in diesem Fall beob achtbare Abnahme eines zuvor vorhandenen Fluoreszenzsignals ist spezifisch für das Vorliegen des Analyten A in der Lö sung.

Bei der in Fig. 10a bis c gezeigten vierten Verfahrensvarian te befindet sich ein Analyt A und ein geladener und frei beweglicher Nachweisstoff N in dem Behälter B. Der Analyt A ist z. B. mittels eines Fluorophors markiert. Bei Zugabe des Analyten A kommt es zu einer für den Analyten A spezifischen Bindung mit dem Nachweisstoff N. Durch Anlegen eines elektri schen Felds wird der geladene Nachweisstoff N und der daran gebundene Analyt A in oder an die ionendurchlässige Wand W außerhalb des Bereichs M bewegt. Die Abnahme der Konzentrati on des fluoreszierenden Analyten A im Behälter B kann fluori metrisch im Bereich M nachgewiesen werden.

Bei der in Fig. 11a bis c gezeigten fünften Verfahrensvarian te befindet sich ein positiv geladener Analyt A und ein nega tiv geladener Nachweisstoff N in der Lösung. Der Analyt A ist z. B. mittels eines Fluorophors markiert. Bei Zugabe des Ana lyten A kommt es zu einer für den Analyten A spezifischen Bindung mit dem Nachweisstoff N. Durch die Bindung des Analy ten A an den Nachweisstoff N wird die Gesamtladung des Kom plexes null. Bei einem Anlegen eines elektrischen Felds eF bleibt der ungeladene Komplex aus Nachweisstoff N und dem daran gebundene Analyten A im Behälter B. Ungebundener Analyt A wird in oder an die ionendurchlässige Wand W bewegt. Die verringerte Abnahme der Konzentration des fluoreszierenden Analyten A im Behälter B im Vergleich zu einer Probe ohne Nachweisstoff N kann fluorimetrisch im Bereich M nachgewiesen werden. Die verringerte Abnahme zeigt die Anwesenheit des Analyten A an.

Bei der in Fig. 12a bis c gezeigten sechsten Verfahrensvari ante ist der Boden Bo der Behälters B ionendurchlässig. Wei terhin ist ein erster Nachweisstoff N in dem Boden Bo gebun den. Der Boden Bo kann z. B. aus aktivierter Agarose oder Po lyacrylamid bestehen, an das Antikörper oder Nukleinsäuren als Nachweisstoff N gebunden wurden. Ein geladener Analyt A wird in den Behälter B eingeführt. Der Analyt A kann z. B. mittels Fluorophors markiert sein. Der Analyt A kommt durch Diffusion oder durch das Anlegen eines elektrischen Felds eF in Kontakt mit dem Nachweisstoff N. Durch den Kontakt kommt es zu einer spezifischen Bindung zwischen Analyt A und Nach weisstoff N. Durch das Anlegen eines elektrischen Felds eF wird ungebundener Analyt A aus den Bereich M, der bei einer optischen Messung erfaßt wird, herausbewegt. Bei einer opti schen Messung des Bereichs M wird nur der gebundene Analyt A erfaßt. Die Fluoreszenz im Bereich M ist ein Indikator für die Anwesenheit des nachzuweisenden Analyten A.

Fig. 13 zeigt eine fluorimetrische Auswertung unter Verwen dung einer erfindungsgemäßen aus Polyacrylamid hergestellten Mikrotiterplatte. Zur Auswertung ist ein Mikrotiterplatten- Fluoreszenzreader verwendet worden. In sämtlichen Proben 1 bis 12 ist immobilisiertes Oligonukleotid A vorhanden gewe sen. Die Proben 1 bis 4 sind mit TAMRA-markiertem Oligonu kleotid, welches zum immobilisierten Oligonukleotid A komple mentär ist, in Kontakt. Die Proben Ziff. 5 bis 8 sind mit TAMRA-markiertem Oligonukleotid K, welches nicht komplementär zu dem Oligonukleotid A ist, in Kontakt. Die Proben Ziff. 9 bis 12 haben lediglich Puffer enthalten. Die Fluoreszenz ist hier in willkürlichen Einheiten wiedergegeben.

Fig. 14 zeigt die Ergebnisse einer fluorimetrischen Auswer tung unter Verwendung einer aus Agarose hergestellten erfin dungsgemäßen Mikrotiterplatte. In sämtlichen Proben ist TAMRA-markiertes Oligonukleotid A' vorhanden gewesen. Die Proben Ziff. 1 bis 4 sind mit RecA-Protein in Kontakt. Die Proben Ziff. 9 bis 12 haben nur Puffer enthalten. Die Fluo reszenz ist in willkürlichen Einheiten wiedergegeben.

Durch das Anlegen eines elektrischen Felds kann der Nachweis erheblich schneller durchgeführt werden. Die Fluoreszenz kann sofort in dem vorgegebenen Bereich des Behälters erfaßt wer den. Bei dem Bereich kann es sich um einen zentralen Bereich des Behälters, um einen Bereich in der Nähe einer Wand oder um den Boden des Behälters handeln.

Beispiele 1. Herstellung einer trägergestützten, ionenleitfähigen Mi krotiterplatte auf Polyacrylamid-Basis mit Nachweisstoffen

Eine Kassette bestehend aus zwei Glasplatten und 1 mm Teflon- Spacern mit dem Innenvolumen 1 mm × 80 mm × 120 mm wurde auf den Innenseiten der Glasplatten mit jeweils einem Kunststoff träger (Gelbond PAG Film, Pharmacia-Amersham) versehen, die zur kovalenten Kopplung an Acrylamid geeignet sind. Ein Kunststoffträger war mit Reihen und Spalten von quadratischen Aussparungen versehen, die jeweils 2 mm × 2 mm groß waren und einen Abstand von jeweils 9 mm hatten. Die Aussparungen wur den mit Hilfe eine Schneideblotters (Graphtec) hergestellt.

Es wurde eine Lösung von In 20% Acrylamid mit einem Monomer zu Crosslinker Verhältnis von 29 : 1 in 1 × TBE Puffer herge stellt. Als Nachweisstoff wurden Acrydite-Oligonukleotide A (Sequenz 5'-Acrydite-TAA CAC AAC TGG TGT GCT CCT GGA-3', Eu rogentec, Belgien) in einer Konzentration von 10 µM vor der Polymerisation zugesetzt. Zum Start der Polymerisation wurde 70 µl 10% (w/v) frischem Ammoniumpersulfat und 20 µl TEMED zugefügt und die Lösung in die Kassette gegossen. Nach einer Stunde wurden die Glasplatten entfernt und die Mikrotiter platte mit dem Kunststoffträger, der die Aussparung trug, nach oben in eine Flachbett-Elektrophoresekammer gelegt. Zur Entfernung ungebundener geladener Bestandteile wurde die Mi krotiterplatte in 1 × TBE eine Stunde mit 100 V einer Elektro phorese unterzogen.

2. Durchführung eines DNA-Hybridisierungstests mit der Mikro titerplatte auf Polyacrylamid-Basis

In die Aussparung der Mikrotiterplatte wurden je 2 µl Proben lösung in 1 × TBE-Puffer gegeben. Jeweils vier Probenlösungen enthielten:

a) 10 pMol Oligonukleotid A' (r'-TAMRA- GAG CTA GGA CCT CTT CTG TCC AGG AGC ACA CCA GTT GTG TTA-3', hergestellt von Tib- Molbiol, Berlin) mit der komplementären Sequenz des Acrydite- Oligonukleotide A.
b) 10 pMol Oligonukleotid K der Sequenz (5'-TAMRA- TAG GGT CAA TGC CAC CCT TTT AAC CTA TCC GGA TTT ACG-3', hergestellt von TibMolbiol, Berlin) und
c) kein Oligonukleotid Oligonukleotid A' und K waren am 5' Ende mit einem Fluorophor (TAMRA) markiert. Die Mikrotiterplatten wurden an den Elek troden zugewandten Seiten mit TBE-Puffer in Kontakt gebracht und die Mikrotiterplatte bei 50 V 10 Minuten einer Elektro phorese unterzogen.

3. Fluorimetrische Auswertung des DNA-Hybridisierungstests

Die Mikrotiterplatte wurde in einem Mikrotiterplattenreader (Lambda 320, MWG-Biotech) eingesetzt und die Fluoreszenz der Aussparung gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 540 mm und einer Emission von 590 nm im Auflichtmodus be stimmt. Die Fluoreszenz in den Proben mit Oligonukleotid A' war im Vergleich zu der Fluoreszenz der Proben mit Oligonu kleotid B und der reinen TBE-Probe deutlich erhöht. Die er höhte Fluoreszenz der Probe mit Oligonukleotid A' zeigt die spezifische Bindung des Oligonukleotid A' an das Acrydite- Oligonukleotid A an.

4. Herstellung einer trägergestützten, ionenleitfähigen Mi krotiterplatte auf Agarose-Basis

In eine Kammer, bestehend aus einer Glasplatte mit dicht um schlossenen Rändern der Dimension 80 mm × 40 mm wurden im Ab stand von 9 mm zwei Kämme mit je vier Formkerne aus Teflon 1 mm über den Boden eingehangen. Die Kantenlänge der quadrati schen Formkerne betrug jeweils 2 mm × 2 mm. Der Abstand der Formkerne betrug 9 mm. Eine 2% Agarose-Suspension in TBE- Puffer wurde in einer Mikrowelle bis zur vollständigen Quel lung der Agarose erhitzt und ca. 12 ml der Suspension in die Kammer gegossen. Nach Erstarrung der Agarose wurden die Form kerne entfernt. Mittels der Formkerne ist eine Anordnung von 2 × 4 Aussparungen mit einer quadratischen Öffnung von 2 mm × 2 mm und einer Tiefe von ca. 3 mm in der hergestellten Mikro titerplatte erzeugt worden. Auf die erstarrte Agarose wurde eine lichtundurchlässige Kunststoffolie mit Aussparungen ge legt, so daß die Aussparung der Folie mit den Aussparungen in der Agarose zur Deckung kamen.

5. Durchführung eine DNA-Protein-Bindungstests mit der Mikro titerplatte auf Agarose-Basis

In die acht Aussparungen der Mikrotiterplatte wurden jeweils 8 µl einer Lösung aus TBE, 10 mM MgCl₂ und, als Nachweis stoff, 1 mM Aussparungsformer (unklar, bitte erläutern!) ge füllt. Aussparungsformer war zur Markierung mit einem Fluoro phor (TAMRA) am 5' Ende versehen. In vier Aussparungen wurde als Probe jeweils 4 µl RecA-Protein (Roche) einer Konzentra tion von 100 µg/µl in RecA-Puffer (10 mM TrisCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, pH 8) zugefügt. In die verbliebenen vier Aussparun gen wurde das gleich Volumen RecA-Puffer ohne RecA-Protein als Negativ-Kontrolle eingeführt. Die Mikrotiterplatte wurde bei 37°C 30 min inkubiert und anschließend 10 min einer Elektrophorese bei 50 V ausgesetzt.

6. Fluorimetrische Auswertung des Protein-DNA-Bindungstests

Die Mikrotiterplatte wurde in einen Mikrotiterplattenreader (Lambda 320, MWG-Biotech) eingesetzt und die Fluoreszenz im Bereich der Aussparung gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 540 mm und einer Emission von 590 nm im Auflichtmodus bestimmt. Die Fluoreszenz in den Proben mit Re cA-Protein war im Vergleich zu der Fluoreszenz der Proben oh ne RecA-Protein deutlich erhöht. Die erhöhte Fluoreszenz der Probe mit RecA-Protein zeigt die Veränderung der elektropho retischen Beweglichkeit von Bindung von Oligonukleotid K aufgrund der Bindung von RecA-Protein an das Oligonukleotid K an.

Bezugszeichenliste

1

erste Platte

2

erste Ausnehmung

3

Elektrode

4

zweite Platte

5

erster Durchbruch

6

zweite Ausnehmung

7

hydrophobe Deckschicht

8

zweiter Durchbruch
B Behälter
Bo Boden
A Analyt
N Nachweisstoff
eF elektrisches Feld
M Bereich des Behälters, dessen optische Ände rung erfaßt wird
W Wand

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines Analyten (A) in einer Flüs sigkeit mit folgenden Schritten:

a) Bereitstellen einer ein Nachweisreagenz (N) enthaltenden Lösung in einem Behälter (B),
b) Zugabe des Analyten (A) zur Lösung,
c) Anlegen eines auf die Lösung wirkenden elektrischen Fel des (eF) mittels sich außerhalb des Behälters (B) befindenden Elektroden, so daß sich eine Konzentration eines für die An wesenheit des Analyten (A) spezifischen Stoffs in einem Be reich (M) des Behälters (B) ändert und
d) optisches Erfassen der Konzentrationsänderung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung nach dem Schritt lit. b inkubiert wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Behälter (B), insbesondere dessen Wand (W) oder dessen Boden (Bo), zumindest abschnittsweise aus einem ionenleiten den Material bestehen und durch das Anlegen des elektrischen Feldes (eF) in Schritt lit. c eine Wanderung von Ionen in dem Material bewirkt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das optische Erfassen der Konzentrationsänderung durch die Öffnung (Öf) und/oder den Boden (Bo) des Behälters (B) er folgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stoff das Nachweisreagenz (N), ein aus dem Nachweisrea genz (N) und dem Analyten (A) gebildetes Reaktionsprodukt oder ein Kompetitor ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nachweisreagenz (N) einen Rezeptor, einen Kompetitor oder ein Vorprodukt des Reaktionsprodukts enthält.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Rezeptor aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Peptid, Protein, Nukleinsäure, Zucker, Antikörper, Lektin, Avidin, Streptavidin, PNA oder LNA.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stoff mit einem Fluorophor markiert ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stoff an den und/oder im Boden (Bo) des Behälters (B) ge bunden wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur optischen Erfassung der Konzentrationsänderung zumindest der Bereich (M) mit einem Lichtstrahl durchstrahlt und dessen durch den Stoff bewirkte Änderung gemessen wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Lichtstrahl so geführt wird, daß er im wesentlichen senk recht aus dem Boden (Bo) oder der Öffnung (Öf) des Behäl ters (B) ein- oder austritt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektrische Feld (eF) gleichzeitig über einer Vielzahl hintereinander angeordneten Behältern (B) gleichzeitig ange legt wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das optische Erfassen der Konzentrationsänderung in der Viel zahl der Behälter (B) gleichzeitig erfolgt.

14. Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Behältern (B) zur Aufnahme einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter (B) zumindest abschnittsweise aus einem ionen leitenden Material gebildet sind.

15. Mikrotiterplatte nach Anspruch 14, wobei die Wände (W) und/oder der Boden (Bo) der Behälter (B) aus dem ionenleiten den Material hergestellt sind.

16. Mikrotiterplatte nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Bo den (B) aus einem elektrischen Isolator hergestellt ist.

17. Mikrotiterplatte nach Anspruch 14 bis 16, wobei der Bo den (B) für die Bindung eines Liganden, Rezeptors oder Sub strats aktiviert ist.

18. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wo bei auf dem Boden (B) ein Rezeptor oder ein Substrat immobi lisiert ist.

19. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wo bei auf vorgegebenen Abschnitten des Bodens (Bo) unterschied liche Rezeptoren immobilisiert sind.

20. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wo bei der Boden (Bo) aus Glas, Quarz oder Kunststoff herge stellt ist.

21. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wo bei der Boden (Bo) aus einem transparenten oder undurchsich tigen Material hergestellt ist.

22. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wo bei die Wände (W) der Behälter (B) aus einem porösen Material hergestellt sind.

23. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wo bei die Wände (W) für die Bindung eines Liganden aktiviert sind.

24. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 23, wo bei das ionenleitende Material ein Material ist, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Agarose, Polyacrylamid, Zel lulose, Papier, Pappe, poröses Silikat, Polystyrol, Po lyvinylchlorid, Polycarbonat, Nylon, Polyethylen.

25. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 24, wo bei die Behälter (B) einen im wesentlichen rechteckigen Quer schnitt aufweisen.

26. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 25, wo bei die Behälter (B) in Form von Ausnehmungen (2, 5) in einer aus dem ionenleitenden Material hergestellten ersten Platte (1) ausgebildet sind.

27. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 26, wo bei die erste Platte (1) auf einer den Boden (Bo) bildenden zweiten Platte (4) aufgebracht ist, und die erste Platte (1) die Wände der Behälter (B) aufweist.

28. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 27, wo bei auf der ersten Platte (1) eine hydrophobe Deckschicht (7) aufgebracht ist.

29. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 28, wo bei die hydrophobe Deckschicht (7) aus einer Folie gebildet ist.

30. Mikrotiterplatte nach Anspruch 29, wobei die Folie aus einem lichtundurchlässigem Material gebildet ist.

31. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 30, wo bei das ionenleitende Material zwischen zwei Elektroden (3) vorgesehen ist.

32. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 30, wo bei die Elektroden (3) parallel zu zwei einander gegenüber liegenden Wänden (W) des Behälters (B) angeordnet sind.

33. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 14 bis 32, wo bei die Elektroden aus Silber, Gold, Platin, Kupfer, Alumini um oder elektrisch leitfähigem Kunststoff hergestellt sind.