DE19937438C2 - Kopplung Dünnschicht-Chromatographie und Massenspektrometrie (TLC/MS) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Kopplung der Dünnschichtchromatographie mit der Massenspektrometrie unter Ionisierung der separierten Analytsubstanzen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, die Dünnschichtchromatographie (TLC) direkt auf kontaktierbar elektrisch leitende Trägerplatten auszuführen, die sich nach besonderem Auftragen einer geeigneten Matrixlösung und Trocknung direkt als Probenträgerplatten in ein Massenspektrometer einsetzen lassen, so daß dort die chromatographisch aufgetrennten Analytsubstanzen, die sich in Matrixkriställchen an der Oberfläche befinden, auf der Dünnschicht ionisiert und dann massenspektrometrisch analysiert werden können. Die Erfindung erstreckt sich auf die Art und Form der Trägerplatten und auf das Auftragen der Matrixlösung auf die Trägerplatten für die MALDI-Analyse.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Kopplung der Dünnschichtchromatographie mit der Massen­ spektrometrie unter Ionisierung der separierten Analytsubstanzen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI).

Die Erfindung besteht darin, die Dünnschichtchromatographie (TLC) direkt auf kontaktierbar elektrisch leitenden Trägerplatten auszuführen, die sich nach besonderem Auftragen einer ge­ eigneten Matrixlösung und Trocknung direkt als Probenträgerplatten in ein Massenspektro­ meter einsetzen lassen, so daß dort die chromatographisch aufgetrennten Analytsubstanzen, die sich in Matrixkriställchen an der Oberfläche befinden, auf der Dünnschicht ionisiert und dann massenspektrometrisch analysiert werden können. Die Erfindung erstreckt sich auf die Art und Form der Trägerplatten und auf das Auftragen der Matrixlösung auf die Trägerplatten für die MALDI-Analyse.

Stand der Technik

Während sich die Gaschromatographie (GC) und die Flüssigchromatographie (HPLC) seit län­ gerer Zeit routinemäßig mit massenspektrometrischen Detektoren koppeln lassen und solche Gerätekopplungen (GC/MS, LC/MS) kommerziell von jeweils mehreren Anbietern mit großem Erfolg vertrieben werden, ist das für die Dünnschichtchromatographie (TLC = thin layer chro­ matography) nicht der Fall.

Die Dünnschichtchromatographie wird für viele analytische Aufgaben als schnelles und einfa­ ches Verfahren für Qualitätskontrollen, Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeiten, Verlauf von Synthesen, Trennung von Seltenerdmetallen, Dopingkontrollen im Sport, in klinischer Chemie und Diagnostik, für Rauschmittelkontrollen in der Kriminaltechnik, in der forensischen Chemie, für Rückstandsanalysen auf Pestizide und vielen anderen Gebieten eingesetzt. Sie ar­ beitet ähnlich wie die Flüssigchromatographie mit einer flüssigen und einer festen Phase, wobei die Strömung der flüssigen Phase allein durch die Kapillarwirkung der offenporig festen Phase, die sich in dünner Auftragung auf einer festen Trägerplatte befindet, bewirkt wird. Ähnlich wie bei der Flüssigchromatographie gibt es die beiden Arten der Adsorptions- und der Verteilung­ schromatographie. Die Handhabung ist einfach und preiswert.

Die Kenntnis der Dünnschichtchromatographie wird hier vorausgesetzt. Kleine Volumina von verschiedenen Lösungen mit den aufzutrennenden Substanzgemischen werden an einer Start­ linie punktförmig auf die poröse Dünnschicht aufgetragen. Der Rand der Trägerplatten unter­ halb der Startlinie wird dann in einem geschlossenen Gefäß in ein flüssiges Laufmittel einge­ taucht, wobei das kapillare Aufsteigen des Laufmittels in der porösen Dünnschicht die einzel­ nen Substanzen mitnimmt. Durch verschiedene Adsorptions- oder Verteilungskoeffizienten werden die Substanzen verschieden schnell transportiert und somit getrennt. Sie befinden sich nach Herausnehmen und Trocknen der Trägerplatten über die Platte punktförmig verteilt auf Bahnen, die jeweils im Startpunkt der Gemische beginnen und hinter der Fließmittelfront her­ laufen. Es können so zehn bis dreißig Gemische auf einer Trägerplatte gleichzeitig getrennt werden.

Für sehr komplizierte Gemische ist auch eine zweidimensionale Dünnschichtchromatographie bekannt. Sie besteht darin, eine Gemischprobe zunächst randnah in einer Richtung aufzutren­ nen. Nach dem Trocknen der Dünnschicht auf der Trägerplatte kann mit einem zweiten Lauf­ mittel mit anderen Verteilungskoeffizienten vertikal zur ersten Bahn eine zweite Auftrennung der bereits eindimensional vorgetrennten Substanzen vorgenommen werden.

Wenn es sich nicht um den eher seltenen Fall farbiger Substanzen handelt, sind die punktförmig verteilten Substanzen nicht mit dem Auge erkennbar. Im Fall durchweg fluoreszierender Sub­ stanzen kann man die Substanzen durch Anregung ihrer Fluoreszenz erkennen und vermessen. In anderen Verfahren werden die Substanzen nach dem Trocknen der Platten angefärbt. Auch kann ein fluoreszierender Untergrund für die Detektion ausgenutzt werden, da sich die Sub­ stanzen als Schwächung der Fluoreszenz zu erkennen geben. In keinem Fall jedoch - wie in allen chromatographischen Methoden mit lediglich intensitätsanzeigenden Detektoren - kann mit diesen Detektionsmethoden eine eindeutige Identifizierung der Substanzen vorgenommen werden. Obwohl es durch die Entwicklung hervorragend gleichmäßiger, dünner Schichten durchaus Verfahren mit hoher Trennleistung gibt (sogenannte HPTLC = high performance thin layer chromatography), bleibt die Detektion der Schwachpunkt der Dünnschichtchromatogra­ phie.

Sieht man von der massenspektrometrischen Untersuchung einzelner, meist abgekratzter Sub­ stanzflecke ab, so sind nur relativ wenige Versuche zu einem umfassenden massenspektrome­ trischen Nachweis der dünnschichtchromatographisch getrennten Substanzen unternommen worden. Die wohl beste und jüngste Arbeit auf diesem Gebiet stammt von J. T. Mehl, A. I. Gusev und D. M. Hercules "Coupling Protocol for Thin Layer Chromatography/Matrix­ assisted Laser Desorption Ionization" Chromatographia 46, 358 (1997). Die Autoren berichten über verschiedene Methoden der massenspektrometrischen Analyse in Flugzeitspektrometern, auch über eigene Versuche der direkten MALDI-Ionisierung von der TLC-Platte, der sie aller­ dings eine schlechte Empfindlichkeit und sowohl ein schlechtes Orts- wie auch schlechtes Mas­ senauflösungsvermögen bescheinigen. Sie haben daher zur Vermeidung dieser Nachteile eine aufwendige "zweite Generation" einer Kopplung TLC/MS entwickelt, die im Abdruck einer angefeuchteten TLC-Platte auf eine mit Matrix versehene MALDI-Probenträgerplatte ohne chromatographische Dünnschicht besteht. Diese Methode wird als eine weitaus befriedigendere Lösung des Problems dargestellt.

Die schlechte Ortsauflösung des ersteren Verfahrens muß auf nicht geklärte Weise von einem lateralen Transport der Analytsubstanzen während der MALDI-Präparation herrühren. Die schlechte Massenauflösung kann verschiedene Gründe haben, die von einer Aufladung der Dünnschicht bis zu einer schlechten Definition des ionenbeschleunigenden elektrischen Feldes durch die Unterlage der Dünnschichtplatte reichen können.

Aufgabe der Erfindung

Es sind Verfahren und Geräte für eine einfache und schnelle, möglichst automatisierbare, mas­ senspektrometrische qualitative oder quantitative Bestimmung von dünnschichtchromatogra­ phisch zu trennenden Analytsubstanzen zu finden.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Es ist die Grundidee der Erfindung, die Dünnschichtchromatographie direkt auf besonders prä­ parierten und konstruierten massenspektrometrischen Probenträgerplatten auszuführen, die unter der Dünnschicht kontaktierbar elektrisch leitend sind, sodann die örtlich getrennten Analytsubstanzen aus der Dünnschicht ohne wesentlichen lateralen Transport in eine dünne Matrixkristallschicht an der Oberfläche zu überführen, die Trägerplatten in das Massenspek­ trometer einzuführen und die Analytsubstanzen nach Ionisieren mit matrixunterstützter Laser­ desorption (MALDI) massenspektrometrisch qualitativ oder quantitativ direkt von der Dünn­ schicht-Trägerplatte herunter zu bestimmen.

Im Gegensatz zu der Beschreibung in dem oben zitierten Artikel können gut orts- und massen­ aufgelöste Spektren der Analytsubstanzen mit hoher Empfindlichkeit und reproduzierbarer Konzentrationsbestimmung gewonnen werden, wenn die Trägerplatten im Massenspektrome­ ter elektrisch ohne größere Übergangswiderstände auf das Beschleunigungspotential gebracht und beim Eluationsprozeß mit einer Matrixlösung bestimmte zusätzliche Bedingungen eingehalten werden. Die Spektren sind überraschend sauber, sie enthalten im allgemeinen nur die Analytionen und die Ionen der Matrixsubstanz.

Es können für die massenspektrometrische Bestimmung sowohl Flugzeit- wie auch die ver­ schiedenen Arten von Ionenfallenmassenspektrometern (Hochfrequenzionenfallenspektrometer oder Ionencyclotronresonanzmassenspektrometer) eingesetzt werden.

Die qualitative Bestimmung, das heißt, die Identifizierung der Substanzen, gelingt über Biblio­ theken, die sowohl die Massen wie auch die laufmittel- und schichtspezifischen R_f-Werte der Substanzen enthalten (R_f = Quotient aus Fließgeschwindigkeit der Substanz zu Fließgeschwin­ digkeit des Laufmittels in der Dünnschicht).

Für eine verbesserte Identifizierung unbekannter Substanzen können Fragmentierungsspektren erzeugt werden, beispielsweise Tochterionenspektren in Ionenfallenspektrometern oder die bekannten PSD-Spektren in Flugzeitmassenspektrometern (PSD = Post source decay). Diese Fragmentspektren von MALDI-Ionen ähneln (mit Einschränkungen) den Spektren, die durch Elektronenstoß aus den Substanzen erhalten werden; für Elektronenstoß gibt es Spektrenbi­ bliotheken mit Hundertausenden von Spektren. Studien über die Unterschiede in der Fragmen­ tierung protonierter Substanzen im Gegensatz zur Elektronenstoßfragmentierung werden ge­ genwärtig unternommen.

Kritisch ist der Transport der Analytsubstanzen aus der Dünnschicht in eine dabei zu bildende, hauchdünne Oberflächenschicht aus Matrixkriställchen hinein. Es ist dazu ein ausreichend sat­ tes, jedoch nicht übersattes Durchfeuchten der Dünnschicht mit einer dünnen Matrixlösung mit sofort anschließendem Trocknen notwendig. Der Trocknungsprozeß zieht die Matrixlösung kapillar an die Oberfläche, wobei die Substanzen gemäß ihres Verteilungskoeffizienten durch Lösung mitgenommen werden. Die Mitnahme ist überraschend gut quantitativ reproduzierbar. Die Analytsubstanzen werden in die sich an der Oberfläche bildenden, kaum sichtbaren Matrix­ kriställchen eingebaut oder in Korngrenzen eingelagert. Ein laterales Fließen der Matrixlösung in der Dünnschicht kann durch die unten angegeben Verfahren vermieden werden, so daß kein meßbarer Verlust an lateraler Auflösung des Dünnschichtchromatogramms oder eine Verfäl­ schung der R_f-Werte auftritt.

Für das Aufbringen der Matrixlösung hat sich sowohl ein Aufdrucken, beispielsweise mit einer lösungsbehafteten, elastischen Druckwalze oder mit einer entsprechenden Druckplatte, wie auch ein Aufsprühen eines sehr feinen Tröpfchennebels bewährt.

Für das Sprühen hat sich erwiesen, daß der Vorgang in möglichst kurzer Zeit abgeschlossen werden muß, daß die Tröpfchen der Matrixlösung sehr klein sein müssen (etwa zwischen ei­ nem Picoliter und einem Nanoliter Volumen), jedoch auf dem Wege von der Sprühspitze zur Trägerplatte nicht austrocknen dürfen, und daß die Dichte und Dauer des Tröpfchennebels so gewählt werden muß, daß eine durchgehende, satte Feuchte der Dünnschichtchromatographie- Schicht ohne überschießende Flüssigkeit erreicht wird. Das Aufsprühen wird daher zweckmäßigerweise automatisiert, wobei die Matrixlösung am besten von unten gegen die auf einen zweidimensional verfahrbaren Wagen aufgelegte Trägerplatte gesprüht wird.

Für das Drucken kann beipielsweise eine Druckplatte benutzt werden, die mit einem feinpori­ gen Schaumstoff überzogen ist, wobei der Schaumstoff die Matrixlösung enthält, aber dabei fast trocken ist. Erst durch verhältnismäßig starkes Andrücken der Druckplatte wird Matrixlö­ sung an die stark saugende Dünnschicht abgegeben, bei vorsichtigem Abheben der Druckplatte wird der Überstand an Matrixlösung sofort vom feinporigen Schaumstoff mit abhoben, so daß es nicht zu einem lateralen Fließen kommen kann. Auch das Aufdrucken wird zum Erhalt einer gleichmäßigen Druckschicht aus Matrixlösung am besten automatisch durchgeführt.

Die für das Verfahren benutzten TLC/MALDI-Trägerplatten haben zweckmäßigerweise die Größe von Mikrotiterplatten mit nutzbaren Oberflächen von 78 mal 108 Millimetern, da sie dann leicht gestapelt und von modernen Pipettierrobotern mit ihren Greifarmen aufgenommen und verarbeitet, und so auch dem Massenspektrometer zugeführt werden können. Es können auch besonders konstruierte Trägerplatten auf Rahmen so aufgesteckt werden, daß Träger­ platte und Rahmen zusammen die Außenform einer Mikrotiterplatte ergeben. Moderne Mas­ senspektrometer verarbeiten Probenträgerplatten in der Größe von Mikrotiterplatten, wobei zweidimensionale Präzisionsabtastungen der Oberfläche möglich sind. Die TLC/MALDI- Platten können mit einer durchgehenden Dünnschicht, aber auch mit einzelnen Dünnschicht­ bahnen versehen sein, wobei es günstig, die Stege zwischen den Bahnen mit hydrophober Oberfläche zu versehen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine metallische Dünnschicht-Trägerplatte (1) in der Form einer Mikrotiterplatte, mit einer rechteckig aufgebrachten Dünnschicht (2). Auf der Startlinie (3) sind Reste der auf­ gebrachten Analytsubstanzmischung erkennbar, die separierbaren Analytsubstanzen sind längs der (gestrichelt eingezeichneten) Bahnen (4) als Analytsubstanzpunkte (5) sichtbar. Die Kon­ taktierung kann um die Dünnschicht (2) herum erfolgen.

Fig. 2 zeigt eine Dünnschicht-Trägerplatte (6) aus Glas, die unter der Dünnschicht (2) eine leitende Schicht trägt, mit einem besonders aufgebrachten Kontaktstreifen (7). Die Träger­ platte (6) ist auf einen Rahmen (8) aufgesteckt, die zusammen mit der Trägerplatte (6) die Form einer Mikrotiterplatte ergibt.

Fig. 3 zeigt das Besprühen einer Dünnschicht (2) auf einer Trägerplatte (1), die auf dem Rah­ men (10) einer nicht gezeigten Bewegungseinheit liegt, mit einem Sprühnebel (12) aus winzi­ gen Tröpfchen. Der Sprühnebel (12) wird von einer Sprühspitze (11) gebildet, die aus einer in­ neren Kapillare (13) und einer äußeren Kapillare (15) besteht. Die innere Kapillare (13) führt die Matrixlösung (14) zu, die äußere Kapillare (15) ein Zerstäubergas (16). Die Sprühspitze (11) ist von zwei konzentrischen Zylindern (17, 18) umgeben, zwischen denen überschüssiger Sprühnebel (12) in Richtung einer Pumpe (19) abgesaugt wird.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine besonders günstige Ausführungsform des Verfahrens geht von Trägerplatten (1) in der Größe der Mikrotiterplatten aus, die mit einer TLC-Dünnschicht (2), beispielsweise aus Kie­ selgel 60 und Titanoxid in der Größe von 78 mal 108 Millimetern, versehen sind. Mikrotiter­ platten mit einem Gefäßfeld dieser Größe haben sich als Industriestandard durchgesetzt; alle in der Biochemie eingesetzten Pipettierroboter können Platten dieser Größe handhaben. Träger­ platten dieser Art sind aufeinanderschichtbar, ohne daß die Dünnschicht berührt oder beschä­ digt wird. Die Trägerplatten können beispielsweise aus Aluminium gefertigt sein. Die präzise Form der Trägerplatten (innerhalb der Toleranzwerte für die Standardgröße der Mikrotiter­ platten) ist durch die Aufnahmeeinrichtung des Massenspektrometers vorgegeben.

Eine Abart von Trägerplatten kann aus zwei oder drei Millimeter dicken Platten (6) mit der Dünnschicht bestehen, die erst mit einem Spannrahmen (8) zusammen die Abmessungen der Mikrotiterplatte ergeben. Diese auf die Spannrahmen (8) aufsteckbaren Dünnschichtplatten (6) können beispielsweise statt aus Aluminium auch aus Glas oder Keramik bestehen, wobei sie dann unter der Dünnschicht eine über eine Kontaktfläche (7) zugängliche, elektrisch leitende Schicht tragen müssen, die später im Massenspektrometer das Beschleunigungspotential der Ionen definiert.

Auf diesen Platten (1, 6) wird die Dünnschichtchromatographie wie gewohnt durchgeführt. Die Substanzgemische werden in Volumina von etwa je einem Mikroliter Lösung auf den Start­ punkten längs der Startlinie (3) aufgebracht, wobei wie gewöhnlich rechts und links der Proben auf der Dünnschicht eine freie Randzone von etwa 10 Millimetern bleibt, um Randstörungen zu vermeiden. Wird die Laufrichtung in Längsrichtung der Trägerplatte gewählt, so ergeben sich bei Abständen von je vier Millimetern zwischen den Proben insgesamt 14 Bahnen (4) mit je etwa 100 Millimetern Länge. Bei drei Millimetern Abstand ergeben sich 18 Bahnen. Die Länge der Bahnen entspricht mit etwa 100 Millimetern der kommerziell erhältlicher TLC-Platten.

Nach Belegung mit den Probengemischlösungen wird die Platte "entwickelt", indem sie auf­ recht stehend mit dem Fuß unterhalb der Startlinie in das Laufmittel gesetzt wird. Die "Ent­ wicklung" findet dabei in einem Gefäß statt, das eine gesättigte Dampfphase mit dem Laufmit­ tel bietet und Störungen durch Zugluft vermeidet. Je nach Laufmittel und Dicke und Art der Dünnschicht dauert die Entwicklung zwischen einer und sechzig Minuten. Die Trägerplatte wird entnommen, wenn die Laufmittelfront durch kapillares Fließen fast oder ganz den oberen Rand erreicht hat. Die Dünnschicht wird dann bei etwa 60 bis 80 Grad Celsius vorsichtig, aber schnell an staubfreier Luft oder einem Schutzgas getrocknet.

Die Substanzen (5) sind jetzt punktförmig auf linearen Bahnen (4) verteilt, die sich vom jewei­ ligen Startpunkt auf der Startlinie (3) zur letzten Laufmittelfront ziehen. Die Punkte (5) haben Durchmesser von größenordnungsmäßig etwa einem Millimeter.

Um sie durch MALDI ionisierbar zu machen, müssen die Analytsubstanzen (5) möglichst in eine Schicht aus Matrixkristallen eingebettet werden. Diese Schicht soll sich an der Oberfläche der Platte (1, 6) befinden. Das geschieht im Prinzip durch ein sattes Durchfeuchten der Dünn­ schicht (2) mit einer Matrixlösung und anschließendem Trocknen.

Die Matrixlösung, beipielsweise α-Cyano-Hydroxy-Zimtsäure in einem Gemisch aus Methanol und Wasser, oder auch Dihydroxybenzoesäure in Wasser, kann dabei einfach mit einer feuch­ ten Walze, die mit einer dünnen Schaumstoffschicht belegt ist, durch schnelles Abrollen aufge­ druckt werden. Dabei ist darauf zu achten, daß sich kein fließender Lösungsstau vor der Ab­ lauffläche der Walze bildet, trotzdem aber die Dünnschicht zur Gänze durchfeuchtet wird. Die vollständige und satte Durchfeuchtung ist entscheidend, überflüssige Matrixlösung an der Oberfläche muß dagegen von der Schaumstoffschicht sofort entfernt werden. Die Instandhal­ tung der Walze über längere Zeit macht dabei einige Schwierigkeiten, das Drucken ist aber bei großem Arbeitsanfall, also bei großem Probendurchsatz, sinnvoll. Statt der Walze können na­ türlich, wie oben beschrieben, auch Druckplatten benutzt werden, die für ein manuelles Auf­ bringen der Matrixlösung einfacher zu benutzen sind.

Relativ einfach zu kontrollieren ist ein Aufsprühen eines Tröpfchennebels (12) aus der Matrix­ lösung. Auch hier ist Vorsicht geboten. Die Tröpfchen müssen ungetrocknet, also noch feucht, die Oberfläche der Dünnschicht (2) erreichen und die Dünnschicht muß gerade bis zum sicht­ baren Glänzen der Oberfläche gänzlich durchfeuchtet werden, ohne jedoch einen sichtbaren Überstand an Lösung auf der Oberfläche zu erzeugen. Die Sprühstreifen müssen gleichmäßig aneinander gereiht werden, um eine gleichmäßig Durchfeuchtung der Dünnschicht ohne late­ rales Fließen der Lösung zu erreichen. Der nächste Sprühstreifen muß in möglichst kurzer Zeit folgen, um auch am Rand zwischen dem letzten Sprühstreifen und der trockenen Dünnschicht kein kapillares Fließen über mehr als eine Sekunde hinweg zuzulassen.

Wichtig ist insbesondere die Größe der Tröpfchen. Die Tröpfchen müssen etwa Durchmesser von 10 bis maximal 50 Mikrometer haben. Größere Tröpfchen, wie sie etwa durch Fixiersprit­ zen oder Parfümzerstäuber entstehen, sind nicht geeignet, da sie sofort ein laterales Fließen in der Dünnschicht vom Aufschlagpunkt der Tröpfchen weg bewirken und somit die Ortsauflö­ sung zerstören. Als Zerstäuber bewährt hat sich hingegen eine konzentrische Anordnung (11) zweier dünner Kapillaren (13, 15), wie sie auch für Elektrosprüh-Verfahren eingesetzt werden. Sowohl die Zufuhr von Luft oder Stickstoff (16) durch die äußere Kapillare (15), wie auch der Transport der Matrixlösung (14) durch die innere Kapillare (13) müssen gut gesteuert werden, beipielsweise durch eine Spritzenpumpe im Falle der Matrixlösung.

Elektrosprühen hingegen hat sich nicht bewährt, weil die An- oder Abreicherung der Tröpf­ chen mit Protonen durch den Elektrosprühprozeß extrem saure oder extrem basische Tröpf­ chen erzeugt, die empfindliche Substanzen chemisch verändern können. Zudem finden dabei in der Dünnschicht elektrolytische Prozesse statt, die Substanzen zersetzen können.

Beim Trocknen der Dünnschicht wird die Matrixlösung mit den gelösten Analytsubstanzen kapillar wegen Verarmung der Flüssigkeit an der Oberfläche an die Oberfläche gesaugt; hier kristallisiert die Matrixsubstanz aus und die Analytsubstanz kann in die Matrixkristalle einge­ baut werden. Die winzigen Matrixkristalle sind an der Oberfläche kaum sichtbar. Sie sind aber für den nachfolgenden MALDI-Prozeß ideal plaziert.

Die vollständige, reproduzierbar satte Durchfeuchtung der Dünnschicht mit Matrixlösung ge­ gebener Konzentration und das nachfolgende Trocknen mit seinem Transport der Analytsub­ stanzen an die Oberfläche und seinem Wachstum von feinsten Matrixkriställchen ist besonders für eine quantitative Auswertung der Spektren ganz entscheidend.

Nach dem Trocknen wird die Trägerplatte (1, 6), eventuell aufgespannt auf ihren Rahmen (8), durch eine Vakuumschleuse in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt. Die Trägerplatten werden über eine Kontaktfläche (7) auf der leitenden Unterlage neben der Dünn­ schicht auf das erforderliche elektrische Potential gebracht, das beispielsweise in Flugzeitspek­ trometern etwa 30 Kilovolt betägt. Bei Trägerplatten aus Aluminium sind besondere Maßnah­ men notwendig, um eine sichere, widerstandsarme Kontaktierung zu ermöglichen, beispiels­ weise durch Vernickelung oder Vergoldung einer Kontaktfläche. Bei Trägerplatten aus Glas oder Keramik sind leitende Schichten unter der Dünnschicht erforderlich, auch hier ist für gu­ ten Kontakt zu sorgen.

Die Ionenquelle ist dabei mit einer x-y-Bewegungseinheit versehen, die die Trägerplatte in Längs- und Querrichtung sehr präzise und reproduzierbar bewegen kann. Die zu analysierende Stelle wird dabei in den Fokuspunkt eines Pulslasers bewegt, woraufhin der Laserstrahl gepulst und eine kleine Menge Matrixsubstanz einschließlich der Analytmoleküle im Vakuum ver­ dampft wird. Der Fokus des Lasers ist für gewöhnlich auf einen Durchmesser von 100 bis 200 Mikrometer eingestellt. In der Verdampfungswolke werden einige der Matrixmoleküle auf­ grund der hohen Verdampfungstemperatur ionisiert sein, einige dieser Matrixionen werden in der Folgezeit mit Analytmolekülen zusammenstoßen und diese durch Protonenabgabe ionisie­ ren. Die hohe Verdampfungstemperatur verliert sich in kürzester Zeit durch den adiabatischen Ausdehnungsprozeß der Wolke in das umgebende Vakuum hinein. In einem Flugzeitmassen­ spektrometer, das hier als Beispiel dienen soll, werden die Ionen dann in der Ionenquelle durch die anliegenden Spannungen beschleunigt und in eine Flugstrecke eingeschossen. Die An­ kunftszeit an einem Detektor ergibt ihre Geschwindigkeit, woraus die Masse berechnet werden kann.

In der Regel werden durch eine Folge von Laserpulsen etwa 5 bis 50 einzelne Spektren aufge­ nommen, die addiert ein Summenspektrum ergeben, das ein besseres Signal-zu-Rauschverhält­ nis zeigt als die einzelnen Spektren. Für die Summenspektren ist es manchmal zweckmäßig, die Trägerplatte jeweils von Spektrum zu Spektrum um ein weniges zu verschieben, manchmal ist das aber auch nicht erforderlich.

Die MALDI-Spektren sind in der Regel sehr einfach, weil es praktisch keine mehrfach gelade­ nen Ionen und keine Fragmentionen gibt. Das Spektrum enthält somit meist nur die einfach geladenen Molekülionen der Analysubstanz, und die bekannten Ionen der Matrixsubstanz.

Aus dem Spektrum kann somit die Molekülmasse m der Analytsubstanz und dem aus bekann­ ten Ort auf der Trägerplatte ihr R_f berechnet werden; aus der Masse m und dem R_f bestimmt sich die Analytsubstanz. Die Quantität der Analytsubstanz kann - nach Kalibrierung - aus der Signalintensität bestimmt werden.

Sind die Bahnen (4) einigermaßen gerade, sind ferner für ein Summenspektrum etwa zwanzig Einzelspektren pro Punkt notwendig, und sollen etwa vier Summenspektren pro Millimeter Bahn aufgenommen werden, so können die Substanzen auf den 14 Bahnen bei 20 Laserschüs­ sen pro Sekunde und schneller Bewegung der Trägerplatte (0,25 Millimeter in etwa 0,2 Se­ kunden) vollautomatisch und mit hoher Ortsauflösung in etwa zwei Stunden vermessen wer­ den. Eine erste Identifizierung und eine Quantifizierung kann durch ein Datensystem in Echt­ zeit erfolgen. Bei automatischer Trägerplattenzuführung lassen sich so Analysen von 168 Ge­ mischen auf 12 Trägerplatten in 24 Stunden automatisch bewältigen.

Interessieren dagegen immer nur einzelne Bestandteile des Gemischs, beispielsweise nur eine einzige Analytsubstanz pro Bahn, die sich mit einer Genauigkeit von plus/minus einem Milli­ meter auf ihrer Bahn festlegen läßt, so lassen sich die 14 Einzelanalysen einer Trägerplatte in etwa drei Minuten durchführen. Es werden dann die Einschleusungszeiten der Trägerplatte, die etwa bei fünf Minuten liegen, zur zeitbestimmenden Größe. Immerhin lassen sich so - bei au­ tomatischer Zuführung der Trägerplatten - mehr als 2000 Einzelanalysen auf mehr als 150 Trägerplatten pro Tag durchführen.

Diese Art der Analysen setzt voraus, daß sich die Analytsubstanz aus der Masse m und dem Koeffizienten R_f genügend eindeutig bestimmen läßt. Meist liegen in einem Laboratorium in kurzer Zeit genügend Daten vor, die ein solches Arbeiten erlauben. Trifft man jedoch auf eine neue, bis dahin unbekannte Substanz, so ist die Aufnahme eines Tochterionenspektrums ange­ bracht.

Tochterionenspektren lassen sich sowohl in Flugzeit- wie auch in Ionenfallenspektrometern messen. In Flugzeitspektrometern lassen sich sowohl PSD- wie auch ISD-Spektren messen (PSD = post source decay; ISD = in source decay). Bei PSD zerfallen die in der Laserablati­ onswolke metastabil gewordenen Ionen nach ihrer Beschleunigung in der feldfreien Flugstrec­ ke. Die Fragnmentionen des metastabilen Zerfalls können wegen ihrer verschiedenen Masse und daher verschiedener Eindringtiefe in den Reflektor nach Reflektion gemessen werden. Im Gegensatz dazu erhöht man für ISD die Energie des Lasers, die Ionen zerfallen quasi spontan in der Ionenquelle. Die Fragmentionen können daher bereits anhand ihrer verschiedenen Flug­ geschwindigkeiten nach gleicher Beschleunigung im linearen Modus des Spektrometers gemessen werden. - In Ionenfallenmassenspektrometern erzeugt man die Fragmentionen in bekannter Weise durch Stöße in der Ionenfallenzelle selbst.

Die Tochterionenspektren ähneln in ihrer Zusammensetzung aus Fragmentionen den Spektren, die für dieselbe Substanz durch Elektronenstoß gewonnen werden, wenn auch die Intensitäts­ verhältnisse der Fragmentionen zueinander oft sehr verschieden sind. Für Elektronenstoßspek­ tren existieren Spektrenbibliotheken mit Hunderttausenden von Spektren. Viele Suchalgorith­ men für diese Bibliotheken sind so geschrieben, daß sie die relativen Intensitäten nur in sehr geringem Maße berücksichtigen, da auch die Elektronenstoßspektren verschiedener Geräte bereits starke Intensitätsunterschiede zeigen. Diese Suchprogramme können daher auch für die Substanzsuche anhand der MALDI-Fragmentionenspektren benutzt werden.

Für das Aufttragen der Matrixlösung benutzt man zweckmäßig einen Sprühautomaten mit Be­ wegungseinrichtung. Das Sprühen wird durch eine konzentrische Anordnung (11) zweier Ka­ pillaren (13, 15) ermöglicht, deren innere Kapillare (13) die Matrixlösung (14), und deren äu­ ßere Kapillare (15) die Sprühluft (16) oder den Sprühstickstoff zuführt. Solche Sprühspitzen (11) sind vom gasunterstützten Elektrosprühen her bekannt. Ein präziser Fluß der Matrixlö­ sung (14) kann durch eine Spritzenpumpe erreicht werden. Um jedes schädliche versehentliche Auftropfen der Matrixlösung auf die Dünnschicht zu vermeiden, weist die Sprühspitze zweck­ mäßigerweise nach oben und die Dünnschichtplatte (1) wird von der Bewegungseinrichtung über den Sprühstrahl (12) geführt. Die Sprühzone nahe der Dünnschicht kann wiederum mit einer konzentrischen Absaugvorrichtung aus zwei Zylindern (17, 18) für den überflüssigen Sprühnebel versehen sein, um eine definierte Begrenzung der Sprühstreifen zu erhalten. Der Sprühstreifen ist, bei einem Abstand der Sprühspitze von etwa 20 Millimetern, etwa 10 bis 15 Millimeter breit. - Durch die Automatisierung läßt sich ein sehr gleichmäßiger Auftrag in defi­ niert kurzer Zeit erreichen.

Die Trägerplatte mit zusammenhängender Dünnschicht läßt sich auch für die zweidimensionale Dünnschichtchromatographie verwenden. Das Abtasten der gesamten Fläche dauert allerdings lange: selbst wenn nur mit einer Auflösung von 0,5 Millimetern abgetaste wird, braucht die Abtastung einer Fläche von 70 mal 100 Millimetern allein etwa neun Stunden. Es ist also gut, flächenmäßige Beschränkungen einzuführen, wobei die üblichen Standarddetektionsmethoden bereits eine Hilfe in der Aufstellung dieser Beschränkungen sein können.

Für einen hohen Analysendurchsatz können die Bahnen auch enger gewählt werden. Insbeson­ dere läßt sich eine Beschichtung der Trägerplatte mit getrennten Dünnschichten für die einzel­ nen Bahnen erzeugen. Bei einem Millimeter Bahnbreite mit 0,5 Millimeter Stegen dazwischen lassen sich leicht über 40 Bahnen zu je 100 Millimeter Länge auf einer Trägerplatte in Größe einer Mikrotiterplatte verwirklichen. Die Vermeidung von Randeffekten auf jeder Bahn erfor­ dert allerdings besondere Maßnahmen in der Auswahl der Schichtmaterialien und der Präpara­ tion der Unterlage. Besonders günstig ist es, wenn die Stege zwischen den Bahnen hydrophob sind, da es dann dort nicht zu Resten der eingetrockneten Matrixlösung kommt. Diese wird vielmehr vollständig von den Dünnschichtbahnen aufgenommen.

Claims (12)

1. Verfahren für die massenspektrometrische Bestimmung von dünnschichtchromatographisch getrennten Analytsubstanzen mit Ionisierung ihrer Moleküle durch matrixunterstützte La­ serdesorption (MALDI), das aus folgenden Schritten besteht:

• 1. die Analytsubstanzen werden dünnschichtchromatographisch auf einer Trägerplatte ge­ trennt, deren Dünnschicht sich auf einer kontaktierbaren, elektrisch leitenden Unterlage befindet,
• 2. die Dünnschicht wird nach der chromatographischen Trennung der Analytsubstanzen getrocknet,
• 3. die Dünnschicht wird durch feinnebliges Besprühen oder Bedrucken der Oberfläche durchfeuchtet mit einem Lösungsmittel, in dem Matrixsubstanz für die matrixunterstützte Laserdesorption gelöst ist,
• 4. die Dünnschicht wird getrocknet, wobei sich auf der Oberfläche der Dünnschicht eine dünne Matrixkristallschicht bildet, in der ein Teil der Analytsubstanzen eingelagert ist,
• 5. die Trägerplatte wird in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt und die elektrisch leitende Unterlage der Dünnschicht wird mit dem Beschleunigungspotential für die Ionen verbunden, und
• 6. die in der Matrixkristallschicht enthaltenen Analytsubstanzen werden durch Laserbe­ schuß desorbiert und ionisiert und massenspektrometrisch nachgewiesen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Durchfeuchten der Dünn­ schicht mit der Matrixlösung durch Aufdrucken der Matrixlösung mit einer elastischen Druckwalze oder Druckplatte erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckwalze oder Druck­ platte mit einer dünnen Schaumstoffschicht bezogen ist, die die Matrixlösung enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Durchfeuchten der Dünn­ schicht mit der Matrixlösung durch gasgetriebenes, gleichmäßiges Aufsprühen einer Mat­ rixlösung in Form eines feinen Tröpfchennebels mit Tröpchen unter 50 Mikrometer Durchmesser erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte durch einen Bewegungsautomaten über eine senkrecht stehende Sprühspitze hinwegbewegt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur genaueren Identifizierung einer Substanz ein Tochterionenspektrum aufgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehen Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Flugzeitmassenspektrometer, ein Hochfrequenzionenfallenmassenspektrometer oder ein Ionencyclotronresonanzmassenspektrometer zur Bestimmung der Substanzen benutzt wird.

8. Dünnschicht-Trägerplatte zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie allein oder in Verbindung mit einem Halterahmen eine Größe hat, die den äußeren Umrissen einer Mikrotiterplatte entspricht.

9. Dünnschicht-Trägerplatte nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die chroma­ tographische Dünnschicht eine Fläche von etwa 78 mal 108 Millimetern bedeckt.

10. Dünnschicht-Trägerplatte nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter der chromatographischen Dünnschicht eine leitende Schicht besitzt, die am Rande neben der Dünnschicht kontaktierbar ist.

11. Dünnschicht-Trägerplatte nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Quer- oder Längsrichtung einzelne Dünnschichtbahnen trägt.

12. Dünnschicht-Trägerplatte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stege zwischen den Bahnen hydrophob sind.