DE19834070A1 - Ionisierung hochmolekularer Substanzen durch Laserdesorption aus flüssigen Matrices - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die fragment- und adduktarme Ionisierung hochmolekularer Analytmoleküle, inbesondere großer Biopolymere, durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) aus flüssigen Matrixes für die massenspektrometrische Untersuchung der entstehenden Ionen, insbesondere für deren Molekulargewichtsbestimmung. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, als Matrixsubstanzen Flüssigkeiten mit extrem niedrigen Dampfdrucken aus der Gruppe der mindestens dreiwertigen Alkohole mit mindestens einer Etherbindung (Ether-Polyole oder Polyether-Polyole) zu benutzen. Diese können durch Infrarot-Laser direkt zur Energieaufnahme und Ionisation benutzt werden (IR-MALDI), durch Auflösen absorbierender Substanzen für andere Wellenbereiche können aber auch andere Laser, beispielsweise übliche UV-Laser, verwendet werden.

Description

Die Erfindung betrifft die fragment- und adduktarme Ionisierung hochmolekularer Analytmo­ leküle, insbesondere großer Biopolymere, durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) aus flüssigen Matrices für die massenspektrometrische Untersuchung der entstehenden Ionen, insbesondere für deren Molekulargewichtsbestimmung.

Die Erfindung besteht darin, als Matrixsubstanzen Flüssigkeiten mit extrem niedrigen Dampf­ drucken aus der Gruppe der mindestens dreiwertigen Alkohole mit mindestens einer Etherbin­ dung (Ether-Polyole oder Polyether-Polyole) zu benutzen. Diese können durch Infrarot-Laser direkt zur Energieaufnahme und Ionisation benutzt werden (IR-MALDI), durch Auflösen ab­ sorbierender Substanzen für andere Wellenbereiche können aber auch andere Laser, beispiels­ weise übliche UV-Laser, verwendet werden.

Stand der Technik

Für die massenspektrometrische Molekulargewichtsbestimmung von Biomolekülen oder ande­ ren Hochpolymeren hat sich die Ionisierung durch matrixunterstützte Desorption mit Hilfe ei­ nes gepulsten UV-Lasers (MALDI) trotz einiger Nachteile als ein Standardverfahren etabliert. Auch für die Strukturbestimmung wird MALDI eingesetzt, dann in der Regel mit gewünschter Fragmentierung der Molekülionen durch besondere Maßnahmen.

Üblicherweise werden dabei Laser verwendet, die im ultravioletten Strahlenbereich arbeiten und Lichtstrahlen kurzer Dauer von einigen Nanosekunden abgeben, beispielsweise einfache und preiswerte Stickstofflaser mit 337 Nanometer Wellenlänge und zwei bis drei Nanosekun­ den Lichtpulslänge. Die pulsförmige Erzeugung der Ionen legt es nahe, für die Analyse Flug­ zeitmassenspektrometer (TOF-MS = time-of-flight mass spectrometer) zu verwenden, es wer­ den aber auch mit Erfolg ionenspeichernde Massenspektrometer, wie Ionenzyklotron-Reso­ nanzspektrometer (FT-ICR = Fourier-transform ion cyclotron resonance) oder Hochfrequenz- Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometer, eingesetzt.

Unter Biomolekülen sollen hier besonders die Oligonukleotide (also das Genmaterial in seinen verschiedenen Ausformungen wie DNA oder RNA), sowie Proteine und Polysaccharide (also die wesentlichen Bausteine der lebenden Welt) verstanden werden, einschließlich ihrer beson­ deren Analoge und Konjugate, wie beispielsweise Glycoproteine oder Lipoproteine. Andere Hochpolymere sind insbesonders die künstlich hergestellten Polymere. Im folgenden werden diese Bio- und Kunstpolymere, deren Moleküle untersucht werden sollen, auch einfach "Analyt" genannt.

Die Auswahl der Matrixsubstanz für MALDI hängt von der Art der Analytmoleküle ab; es sind inzwischen mehrere hundert verschiedene Matrixsubstanzen bekannt geworden, die jeweils für bestimmte Gruppen von Analytmolekülen geeignet sind. Die Matrixsubstanz hat insbesondere folgende Aufgaben: 1) die Probensubstanz in fein verteilter, sehr verdünnter Form an den Pro­ benträger anzubinden, 2) die Energie der Laserstrahlung absorptiv aufzunehmen, 3) die Ana­ lytmoleküle durch Bildung einer Dampfwolke vereinzelt in die Gasphase zu blasen und 4) einen Teil der Analytmoleküle unter Protonierung oder Deprotonierung zu ionisieren. Dabei dürfen sich weder die Analytmoleküle zu wesentlichen Teilen zersetzen, noch dürfen sich in größerem Maße Matrix- oder andere Moleküle an die Analytionen anlagern, weil in beiden Fällen die Bestimmung des korrekten Molekulargewichts nicht mehr möglich ist.

Generell hat es sich als günstig erwiesen, als Matrixsubstanzen im Normalzustand kristallin vorliegende, aromatische Säuren zu benutzen, und im Verhältnis wenige Analytmoleküle in die Matrixkriställchen einzubauen oder zumindest in den Grenzflächen zwischen den Kriställchen einzulagern. Die Biomoleküle sind in aller Regel zumindest schwach wasserlöslich, so daß be­ vorzugt, aber nicht zwingend, wasserlösliche Matrixsubstanzen verwendet werden. Es hat sich als Faustregel herausgestellt, daß die Auswahl von Matrixsubstanzen immer schwieriger wird, je höher das Molekulargewicht der Biosubstanzen ist. Entweder nimmt die Fragmentierung der großen Moleküle in so starkem Maße zu, daß Molekülionen nicht mehr zu finden sind, oder aber es bilden sich Addukte mit Matrix- oder anderen Molekülen, so daß Bestimmungen des Molekulargewichts kaum noch möglich sind. In vielen Fällen führt eine Mischung von Ad­ duktbildung und Abspaltung kleinerer Fragmente dazu, daß das massenspektrometrische Signal ein breiter Berg wird, der eine präzise Massenbestimmung nicht mehr zuläßt.

Bei der Suche nach immer neuen, für bestimmte Substanzklassen günstigeren Matrixsubstan­ zen ist beinahe in Vergessenheit geraten, daß die erste MALDI-artige Ionisierung hochmoleku­ larer Substanzen in einer flüssigen Glycerin-Matrix beobachtet wurde, der zur Absorption von UV-Laserstrahlen ein feines Metallpulver beigegeben war (K. Tanaka et al., Rapid Comm. in Mass Spectrom., 2, 151, 1988). Im weiteren Verlauf der MALDI-Entwicklung wurde Glycerin wegen seiner unten geschilderten Nachteile nur gelegentlich als Matrix verwendet, insbesonde­ re aber auch deshalb, weil sich Glycerin nicht direkt durch die üblichen UV-Laser anregen ließ. Dieser Nachteil konnte aber prinzipiell durch eine Arbeitsgruppe ausgeräumt werden, indem sie im Glycerin UV-Absorbentien löste und so die flüssige Mischmatrix an die üblichen UV-Laser angepaßte, wenn auch dabei aus unbekannten Gründen nicht alle Absorbentien gute Resultate zeigten, manche starke UV-Absorbentien verhinderten geradezu eine Ionisierung (D. S. Cor­ nett et al., "Liquid Mixtures for Matrix-Assisted Laser Desorption", Anal. Chem. 65, 2608, 1993).

In einer neuesten Arbeit wurde für die Ionisierung ein Infrarot-Laser benutzt, dessen Strahlung direkt eine der Streckschwingungen des Glycerins anzuregen vermochte (S. Berkenkamp, F. Kirpekar und F. Hillenkamp, "Infrared MALDI Mass Spectrometry of Large Nucleic Acids", Science 281, 2212, 1998). Insbesondere regt die Strahlung eines Erbium-YAG-Lasers mit 2,94 Mikrometer Wellenlänge die Streckschwingungen der OH-Gruppen an. Dabei hat sich gezeigt, daß diese Kombination von Glycerin und Infrarot-Strahlung mit extrem energiearmen Photo­ nen zu einer hervorragend empfindlichen, fragmentarmen Ionisierung von Molekülen außeror­ dentlich hohen Molekulargewichts befähigt ist. Der für die Absorption der Strahlung günstigste Erbium-YAG-Infrarot-Laser ist zwar noch relativ teuer und technisch noch nicht besonders zuverlässig, es ist jedoch zu erwarten, daß diese Art von Lasern eine ähnliche Entwicklung zu leistungsfähigen Geräten durchläuft wie die verwandten Neodym-YAG-Laser.

Glycerin eignet sich für diese Art der Ionisierung überhaupt nur, weil es einen relativ niedrigen Dampfdruck besitzt. Selbst im Vakuum verdampft ein kleines Tröpfchen von etwa einem Mi­ kroliter recht langsam, es braucht etwa eine halbe Stunde, um völlig aufzutrocknen. Diese Zeit läßt sich für eine MALDI-Analyse einiger Proben auf einer Trägerplatte nutzen.

Glycerin diente bereits vor ein bis zwei Jahrzehnten als flüssiges Medium für die Ionisierung von gelösten Substanzen durch Beschuß mit schnellen Neutralteilchen (fast atom bombard­ ment, "FAB"). Auch mit dieser Methode wurden hochempfindlich sehr fragment- und addukt­ arme Spektren von Molekülen relativ hohen Molekulargewichts erhalten.

Über den Grund der ähnlich hohen Ionisierungswirkung des Glycerins in diesen doch sehr ver­ schiedenartigen Ionisierungsmethoden kann bisher nur spekuliert werden. So scheint es mög­ lich, daß große Moleküle, die sich praktisch immer gemischt aus hydrophoben und hydrophilen Gruppen (amphiphile Substanzen) zusammensetzen, sich bevorzugt mit ihrer mehr hydropho­ ben Seite an der Oberfläche aufhalten, und nur mit ihrer hydrophilen Seite in die sehr polare Lösung ragen. Dieser Effekt mag zu einer starken Erhöhung der Konzentration dieser Hochpo­ lymere an der Oberfläche führen. Andererseits kann möglicherweise Glycerin (1,2,3-Propan­ triol) als dreiwertiger Alkohol besonders leicht andere Substanzen durch Protonenabgabe aus einer der Alkoholgruppen ionisieren. Auch Schockwellenausbreitungen in der Flüssigkeit mit Abschütteln von Oberflächenmolekülen sind diskutiert worden. Es ist auch bekannt, daß das sehr polare Wasser als Matrix verwendet werden kann, dabei bedarf es aber einer extremen Kühlung der Trägerplatten im Vakuum, um sofortiges Verdunsten zu vermeiden.

Die Ionisierung mittelst Glycerins bietet neben einigen Vorteilen aber auch schwerwiegende Nachteile.

Vorteile: Neben der hohen Empfindlichkeit für sehr große Moleküle, der relativen Fragment- und Adduktarmut steht besonders die gleichmäßige Ionisierungsausbeute über die ganze Tropfenoberfläche hinweg auf der Liste der Vorteile. Da keine visuelle Kontrolle des Be­ schußortes mehr notwendig ist, wird ein automatisiertes Verfahren ermöglicht, anders als es bisher bei den MALDI-Verfahren mit Tröpfcheneintrocknung zu festen Matrices der Fall war. Als Vorteil ist auch zu zählen, daß sich die Proben relativ leicht präparieren lassen; auf ein Tröpfchen Glycerin kann einfach ein Tröpfchen mit wäßriger Analytlösung aufgebracht wer­ den. Die Präparation sehr einfach kann in Pipettierautomaten erfolgen. Das Wasser verdampft (zumindest zu großen Teilen) beim Einbringen ins Vakuum des Massenspektrometers.

Nachteile: Auf der Liste der Nachteile stehen besonders die relativ kurzzeitige Verwendbarkeit und die starke Belastung des Vakuumsystems; sowohl wegen dieser Belastung des Vakuums wie auch wegen der Kurzfristigkeit lassen sich mit dieser Methode leider nicht Hunderte von Proben auf einem Probenträger analysieren. Schon bei zehn Proben auf einem Träger tritt eine spürbare Belastung des Vakuumsystems und damit auch der Spektrengüte auf, die durch den schlechten Druck im Spektrometer beeinflußt wird. Das steht einem immer stärker werdenden Verlangen nach hohem Probendurchsatz entgegen, für die nicht nur zehn, sondern eher tausend Proben auf einem Probenträger verlangt werden. Diesem Nachteil kann dabei durch eine starke Kühlung der Probenträgerplatte außerhalb des Vakuums, in der Probenträgerschleuse und im Vakuum begegnet werden, jedoch ist eine solche Kühlung schwierig (die Trägerplatte befindet sich im Massenspektrometer auf einem Potential von 30 kV) und in kommerziellen Massen­ spektrometern nicht vorhanden.

Für diesen hohen Probendurchsatz der Analyse ist natürlich nicht nur eine Automatisierbarkeit der MALDI-Ionisierung, sondern aller Analysenschritte einschließlich der Vorbereitung der Proben unbedingt notwendig. Diese ist aber, wie oben schon angedeutet, bei der Verwendung von Glycerin als Matrixsubstanz in idealer Weise gegeben, in der Regel besser als bei Verwen­ dung fester Matrixsubstanzen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein hochempfindliches und automatisierbares Verfahren für die pulsartige und schonende Ionsierung sehr großer Moleküle ohne wesentliche Fragment- oder Adduktbildung zu finden, das es erlaubt, viele Proben gleichzeitig (möglichst mehr als tausend) auf einen Probenträger aufbringen und ohne wesentliche Belastung des Vakuumsy­ stems analysieren zu können.

Erfindungsgedanke

Die Erfindung besteht darin, für MALDI flüssige Matrices aus mehrwertigen (mindestens drei­ wertigen) Alkoholen zu verwenden, die jedoch gegenüber dem bisher verwendeten Glycerin durch Verlängerung der Kohlenstoffketten und den Einbau von mindestens einer Etherbindung einen wesentlich niedrigeren Dampfdruck besitzen. Diglycerin, Triglycerin und Polyglycerin (Trivialnamen, Bezugsquelle: Solvay Alkali GmbH, Düsseldorf) gehören zu dieser Gruppe von Flüssigkeiten. Dabei kann durch die Verwendung von Infrarot-Lasern eine direkte Anregung der Matrixmoleküle erfolgen, es kann aber durch Auflösen von Absorbentien für Licht anderer Wellenlängen auch eine Anpassung an andere Laserarten erfolgen.

Es hat sich in Experimenten erwiesen, daß ein hoher Anteil an OH-Gruppen (Hydroxygruppen) für die Funktion als MALDI-Matrixsubstanz wesentlich ist. Der hohe Anteil an diesen alkoho­ lischen OH-Gruppen trägt einerseits (neben der Kettenverlängeung an sich) zur Erniedrigung des Dampfdrucks bei, er erscheint aber auch für die Energieaufnahme, für die Konzentrierung von Analytmolekülen an der Oberfläche und für die Ionisierung wichtig zu sein. Im Falle von Erbium-YAG-Lasern dienen diese Hydroxygnippen insbesondere auch zur direkten Aufnahme der Energie aus der Laserstrahlung.

Nun sind vierwertige Alkohole normaler Kohlenwasserstoffe (einfachste Zucker) bereits fest, daher läßt sich der Grundgedanke der Erfindung, hydroxygruppenreiche Flüssigkeiten mit ex­ trem niedrigem Dampfdruck zu benutzen, nicht mit normalen Kohlenwasserstoff-Alkoholen realisieren. Der Einbau etherischer Bindungen in die Kohlenstoffketten vermag aber auch höhe­ re Alkohole flüssig zu erhalten, so daß sich durch Ether-Polyole, oder durch Polyether-Polyole, Matrixflüssigkeiten der erfindungsgemäßen Art verifizieren lassen.

Zu diesen Verbindungen gehören insbesondere das vierwertige Diglycerin (Trivialname) mit dem Aufbau HOH₂C-HOHC-H₂C-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, oder das fünfwertige Triglycerin HOH₂C-HOHC-H₂C-O-CH₂-CHOH-H₂C-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, das zwei Ether-Bindungen aufweist. Der Aufbau ähnelt den sogenannten Polyethylenglykolen, die wegen ihres extrem niedrigen Dampfdrucks als Ultrahochvakuum-Pumpenöle gebraucht werden, jedoch trotz rela­ tiv langer Kettenlängen nur zweiwertige, endständige Alkohole darstellen und sich in Experi­ menten als wenig geeignet für den vorliegenden Zweck erwiesen haben.

Diglycerin, Triglycerin und höhere Polyglycerine, auch solche unsymmetrischer Art (wie zum Beispiel durch eine Etherbindung verbundenes Glykol-Glycerin), sollen hier vereinfachend un­ ter der Bezeichnung Polyglycerine zusammengefaßt werden.

Die Polyglycerine sind mit Wasser mischbar und können praktisch alle Analytmoleküle lösen, die ja nur in extrem niedrigen Konzentrationen eingebracht werden. Die Löslichkeit für viele Substanzen, beispielsweise für einige günstige UV-Absorbentien, nimmt allerdings mit höhe­ rem Polymerisierungssgrad stark ab. Durch die Mischbarkeit mit Wasser läßt sich ein Verfah­ ren anwenden, bei dem die Polyglycerine zunächst auf die Trägerplatten aufgebracht werden, worauf dann einfach die wäßrigen Analytlösungen aufpipettiert werden. Die Polyglycerine ha­ ben eine zähe, ölige Konsistenz, in höherem Polymerisierungsgrad honigähnlich. Anders als Öle benetzen sie jedoch wegen ihrer starken Polarität sehr leicht hydrophile Oberflächen; sie lassen sich daher in einfacher Weise mit Vielnadelköpfen auf MALDI-Trägerplatten aufstempeln.

Der Dampfdruck ist bereits beim Diglycerin so niedrig, daß sich beispielsweise 96 oder 384 Proben aufbringen lassen, ohne daß das Vakuum des Massenspektrometers wesentlich gestört wird. Selbst das Aufbringen von 1536 kleinflächigen Proben ist möglich. Diese Anzahlen ent­ sprechen den Anzahlen der Reaktionsgefäße in den gebräuchlichen Mikrotiterplatten für die parallele Aufbereitung von Proben in der Biochemie.

Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, wenn die Trägerplatten bereits mit einem hydropho­ ben Grundmuster versehen sind, das hydrophile Ankerbereiche für die Polyglycerine trägt. Die Ankerbereiche sollen so groß sein, daß die Polyglycerine sehr flache Tröpfchen bilden. Vorteil­ haft sind beispielsweise Tröpfchen von etwa einem Millimeter Durchmesser und etwa 0,2 bis 0,4 Millimeter Höhe. Ein solches Grundmuster der Trägerplatte mit hydrophoben Randberei­ chen für die Tröpfchen verhindert, daß die aufpipettierten Wassertröpfchen mit den Analytmo­ lekülen von den Polyglycerinen auf benachbarte Bereiche der Trägerplatte abfließen, bevor sie gelöst werden können. Es bleiben die Probenflecke und damit auch die Abdampfrate der Poly­ glycerine sehr klein. Auf eine Trägerplatte von 78 mal 114 Millimeter (Größe von Mikrotiter­ platten) lassen sich so leicht 1536 Probenflecke aufbringen.

Schon bei Diglycerin, mehr noch bei Triglycerin, wird so der Druck im Massenspektrometer kaum noch beeinflußt, selbst wenn große Zahlen von kleinflächigen Proben auf einen Proben­ träger aufgebracht werden. Bei Diglycerin sind die Tröpfchen selbst bei ganztägigem Aufent­ halt im Vakuum nur kaum wahrnehmbar geschrumpft. Es lassen sich also Untersuchungszeiten von gut einem Tag realisieren. Das erlaubt bei 1536 Proben Analysenzeiten von etwa einer Minute für die einzelne Probe, weit mehr als erforderlich.

Das Wasser aus der wäßrigen Lösung der Analytmoleküle wird zweckmäßigerweise vor dem Einbringen der Trägerplatten in das Vakuum der Ionenquelle des Massenspektrometers aus den Probenflecken ausgedampft. Dieses Ausdampfen des Wassers sollte sorgfältig vorgenom­ men werden, da Reste von Wasser beim Laserbeschuß zum gelegentlichen Zerspratzen der Tröpfchen führen. Das Ausdampfen kann durch verminderten Druck geschehen und sollte durch vorsichtiges Erhitzen der Trägerplatte auf Temperaturen von 80 bis 150 Grad Celsius (abhängig von der Art der Analytmoleküle) unterstützt werden. So kann das Ausdampfen in der Vakuumschleuse des Massenspektrometers vorgenommen werden, es erscheint jedoch wegen der längeren Dauer des Ausdampfvorgangs eine besondere Vakuumkammer für diesen Zweck günstiger.

Flüssige Matrices der erfindungsgemäßen Art mit extrem niedrigen Dampfdrucken können aber vorteilhaft auch noch in ganz anderen Applikationen ausgenutzt werden. So ist es möglich, diese Matrixflüssigkeiten auf Blotmenbranen aufzubringen, die in bekannter Weise durch Blot­ ten mit elektrophoretisch zweidimensional getrennten Eiweißen aus PAGE-Platten (PAGE = Polyacrylgel-Elektrophorese) beladen sind. Die an den porösen Oberflächenstrukturen der Blotmembranen adsorbierten Eiweißmoleküle werden zum Teil durch die Matrixflüssigkeiten gelöst und durch Diffusion an deren Oberfläche gebracht. Dabei kann durch Steuerung der Viskosität über Temperatur und Wassergehalt erreicht werden, daß dabei die räumliche Tren­ nung der Eiweiße möglicht wenig gestört wird. Durch Ausdampfen des Wassers und Einfrieren der Matrixflüssigkeit kann eine Lagerfähigkeit erreicht werden. Die Analyse erfolgt hochemp­ findlich durch MALDI-Ionisierung entweder direkt von der auf eine Trägerplatte aufgespann­ ten Blotmembran, oder durch einfaches Übertragen (Abdrücken, Überstempeln) der Matrix­ flüssigkeit auf eine besondere Trägerplatte, und jeweils durch zweidimensionale Rasteranalyse durch eine entsprechende Bewegung der Trägerplatte.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt die Struktur von Diglycerin, einer bevorzugten Matrixflüssigkeit.

Fig. 2 zeigt das Aufstempeln von Matrixflüssigkeitströpfchen (3) mit einem einfachen Stem­ pelkopf (1), der viele metallische Stempelnadeln (2) exakt gleicher Länge trägt, auf hydrophile Bereiche mit hydrophoben Randbezirken auf der Oberfläche (4) der Trägerplatte (5).

Fig. 3 gibt die parallele Aufgabe einzelner Proben (15) auf die Matrixflecken (16) der Trä­ gerplatte (18) durch eine Vielfachpipette (10) wieder. Die Vielfachpipette besitzt eine Parallel­ führung (11) in einem Pipettenkörper (12), und eine große Anzahl von Einzelpipetten (14) mit Kolben (13). Die Oberfläche (17) der Trägerplatte (18) hat hydophile Anker und hydrophobe Begrenzungsbezirke für die Matrixflecken, die ein Ausbreiten von Matrixflüssigkeit und Pro­ benlösung verhindern.

Fig. 4a und 4b zeigen Spektren von Lysozym (Molekulargewicht 14 306,2 atomare Mas­ seneinheiten), gewonnen mit Glycerin (links, 4a) und mit Diglycerin (rechts, 4b). Durch relativ hohe Konzentrationen der Analytmoleküle kommt es zur Bildung von Dimeren, Trimeren, Tetrameren, Pentameren und Hexameren, die die extrem schonende Ionisierung in beiden Ma­ trixflüssigkeiten demonstrieren. Wie schon durch Cornett et al. gezeigt, kann man durch Rück­ nahme der Konzentration extrem scharfe Peaks der Monomere erzeugen, ohne daß Oligomere sichtbar sind.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine sehr günstige Ausformung des Verfahrens ist bereits durch die Verwendung von Diglyce­ rin (Struktur in Fig. 1) statt des bisher verwendeten Glycerins als Matrixflüssigkeit gegeben. Die analytischen Eigenschaften im MALDI-Prozeß sind sehr ähnlich, wie aus Fig. 4a und 4b hervorgeht. Das Diglycerin ist ein vierwertiger Alkohol mit einer Ether-Bindung, hat eine leicht ölige Konsistenz, ist mit Wasser mischbar und ergibt unter Beschuß eines Erbium-YAG- Lasers ähnlich gute Massenspektren wie Glycerin. Die Energiedichte im Laserfokus muß ein wenig höher als bei Glycerin gewählt werden, entsprechend dem höheren Siedepunkt des Diglycerins. Die Beeinflussung des Vakuums durch das Diglycerin ist aber entscheidend besser: dadurch können weitaus mehr Probentröpfchen aufgetragen und längere Analysenzeiten durchgehalten werden. Tröpfchen aus Diglycerin nehmen selbst bei einem Tag Aufenthalt im Vakuum kaum merklich ab.

Durch Auflösen von UV-Absorbentien in den flüssigen Matrixsubstanzen ist es möglich, auch die bisher üblichen UV-Laser, beispielsweise die üblichen Stickstofflaser mit 337 Nanometer Wellenlänge und 3 Nanosekunden Pulsbreite weiter zu benutzen. Mit diesen Lasern sind prak­ tisch alle bisher kommerziell erhältlichen MALDI-Massenspektrometer ausgestattet. Als UV- Absorbentien können beispielsweise die bisher für UV-Laser benutzten Matrixsubstanzen, wie beispielsweise a-Cyano-4-Dehydrozimtsäure, benutzt werden. Da aber die Absorbentien nicht mehr die Ionisierung übernehmen müssen, können auch ganz andersartige UV-Absorbentien verwendet werden. Auch die Anpassung an Laser mit sichtbarem Licht ist möglich.

Auch die Verwendung des Triglycerins ist möglich, hier ist aber die Konsistenz bereits deutlich zäher und auch die Löslichkeit für UV-Absorbentien ist deutlich geringer. Es können aber die Polyglycerine durch weitere chemische Gruppen, beispielsweise durch eine Teilnitrierung, in ihrem Dampfdruck weiter gesenkt werden, ohne daß unter Normalbedingungen feste Substan­ zen entstehen. Eine Teilnitrierung kann durch Verpuffungsunterstützung auch für den MALDI- Prozeß günstig wirken. Auch andere chemische Gruppen können sich günstig auf den MALDI- Prozeß auswirken. Es können dabei beispielsweise chemische Gruppen eingebaut werden, die direkt eine Absorption des verwendeten Laserlichts ermöglichen.

Die Viskosität nimmt bei höheren Temperaturen drastisch ab. So gilt für Di- und Triglycerin, daß die Viskosität bei Erwärmung auf 100°C um etwa 2,5 Zehnerpotenzen abnimmt.

Di- oder Triglycerin (und ähnliche Verbindungen) lassen sich durch ihre ölige Viskosität und ihre Benetzungsfähigkeit für hydrophile Oberflächen sehr leicht und zuverlässig mit Vielkopf- Nadelstempeln auf die MALDI-Trägerplatten übertragen (siehe Fig. 2). So kann man auf eine Metallplatte der Größe 78 mal 128 Millimeter (Größe der Biochemie häufig verwendeten Mi­ krotiterplatten) leicht 1536 flache Tröpfchen von etwa einem Millimeter Durchmesser auf­ stempeln. Die Zentren der Tröpfchen haben dann einen Abstand von 2,25 Millimetern vonein­ ander, das entspricht einem der Sub-Rastermaße von Mikrotiterplatten (der Abstand des Grundrasters der Mikrotiterplatten beträgt 9 Millimeter).

Die 1536 Tröpfchen können mit einem 96-fachen Nadelkopf in 16 Schritten, mit einem 384- fachen Nadelkopf in 4 Schritten, oder auch mit einem 1536-fachen Nadelkopf in nur einem Schritt aufgetragen werden. Die Nadelköpfe mit Nadeln von etwa 0,8 Millimetern Durchmes­ ser lassen sich relativ einfach herstellen und ergeben Reckgrößen von etwa einem Millimeter Durchmesser. Metallnadeln beispielsweise aus Edelstahl haben eine mäßige Hydrophilie und nehmen daher jeweils beim Abheben aus dem Vorratsbehälter mit Polyglycerin einen flachen Tropfen auf, der nicht abtropft und sich sehr gut überstempeln läßt. Der Kopf kann zum Be­ stempeln einer größeren Anzahl von Trägerplatten verwendet werden, da die Tröpfchen an Luft praktisch überhaupt nicht verdunsten und sich die Platten so über längere Zeit lagern las­ sen.

Die wäßrigen Analytlösungen können dann mit kommerziell erhältlichen Pipettierautomaten aus Mikrotiterplatten entnommen und auf die Polyglycerintröpfchen aufpipettiert werden. Sie vermischen sich dort diffusiv mit dem Polyglycerin.

Damit die Analytlösungen nicht von dem Polyglycerintröpfchen abgleiten und auf die Träger­ platte abfließen, bevor eine Lösung stattfindet, ist es zweckmäßig, die Umgebung der Träger­ platte um die Polyglycerintröpfchen herum sehr hydrophob zu machen. Die Polyglycerintröpf­ chen können dabei auf hydrophilen Ankerflecken aufsitzen. Sie nehmen dabei präzise die Form und vorbekannte Stelle des hydrophilen Ankerflecks ein, günstig für ein automatisches MALDI- Verfahren, das auf diese Weise nicht erst die Flecken suchen muß. Diese hydophobe Struktu­ rierung der Trägerplatte ist auch wichtig, um die Probenflecken klein und damit die Abdamp­ fung extrem gering zu halten.

Die Polyglycerine reagieren wegen ihrer starken Polarität durch die vielen OH-Gruppen genau so auf hydrophile und hydrophobe Oberflächen wie das ebenfalls stark polare Wasser.

Die Oberflächen bisher verwendeter metallischer Probenträger sind in der Regel von Natur aus leicht hydrophil, ein Probentröpfchen fließt normalerweise so weit auseinander, bis ein durch die Hydrophilie bestimmter, flacher Anstellwinkel erreicht ist. Die Hydrophilität wird durch die Hydroxygruppen erzeugt, die sich unter der Einwirkung von feuchter Luft auf jedem Metall (selbst auf Edelmetallen) bilden.

Um hydrophobe Oberflächen der Probenträger zu erhalten, kann die ganze Probenträger aus einem hydrophoben Material gefertigt werden, beispielsweise aus Teflon©. Es ist aber dann dafür zu sorgen, daß die Oberfläche (beispielsweise durch Einlagerung von Graphit) elektrisch leitend wird, da der MALDI-Prozeß für die gleichmäßige Beschleunigung der gebildeten Ionen einerseits ein homogenes elektrisches Feld und andererseits eine Ableitung von Ladungen braucht, deren Polarität zu der der gebildeten Ionen entgegengesetzt ist. Auch eine reine Gra­ phitoberfläche ist sehr hydrophob.

Es ist aus Gründen einfacher Herstellung durchaus zweckmäßig, bei Probenträgern aus Metall oder metallisiertem Kunststoff zu bleiben, jedoch die Oberfläche hydrophob zu machen. Das kann beipielsweise durch einen hauchdünnen, hydrophoben Lack geschehen, oder aber durch Aufideben einer dünnen, hydrophoben Folie, beispielsweise aus Teflon©. Noch zweckmäßiger ist es aber, die Metalloberfläche durch eine monomolekulare, chemische Veränderung hydro­ phob zu machen, da dann eine gewisse elektrische Leitfähigkeit, wenn auch hochohmig, erhal­ ten bleibt.

Eine solche Hydrophobisierung einer Metalloberfläche ist an sich bekannt. Dazu werden in der Regel längere Alkanketten (beispielsweise lineare C₁₈-Ketten) über eine Schwefelbrücke kova­ lent an die Atome der Metalloberfläche gebunden. Diese Bindung ist außerordentlich fest, sie kann mit normalen Mitteln nicht abgewaschen werden. Sie hält einer jahrelangen Bewetterung stand. Noch hydrophobere Oberflächen werden erhalten, wenn die Wasserstoffatome an den Enden der Alkanketten durch Fluoratome ersetzt werden. Es gibt jedoch viele andere, äquiva­ lente Methoden der Hydrophobisierung, zum Beispiel unter Verwendung von Silikonen, kera­ mischen Nanopulvern, Alkylchlorsilanen oder zinnorganischen Verbindungen. Es können hy­ drophobe Schichten auch durch Plasmabeschichtung erzeugt werden.

Die hydrophilen Ankerbereiche für die Probentröpfchen können auf vielerlei Weise erzeugt werden. Ein Beispiel ist das Abdecken der gewünschten Ankerbereiche vor der Hydrophobisie­ rung mit einem abwaschbaren oder hydrophilen Lack. Es kann beispielsweise der Decklack in Form kleiner Tröpfchen mit einer piezobetriebenen Tröpfchenpipette nach Art der Tinten­ strahl-Drucker aufgeschossen werden. Es ist damit eine außerordentlich gute Ortspräzion der Lackpunkte erreichbar. Nach der Hydrophobisierung können die Lackpunkte einfach abgewa­ schen werden, sofern sie nicht schon als solche genügend gute hydrophile Anker bilden. Die gewaschenen Ankerbereiche können auch mit besonderen Hydrophilisierungsmitteln besonders hydrophil gemacht werden.

Es können solche hydrophilen Lacktröpfchen aber auch nachträglich auf die hydrophobe Ober­ fläche aufgedruckt werden. Dazu eignen sich besonders amphiphile Substanzen, die auf der hydrophoben Oberfläche binden und eine hydrophile Oberfläche bilden.

Die hydrophilen Ankerbereiche können aber auch in sehr einfacher Weise durch Zerstörung der hydrophoben Schicht erzeugt werden. Das kann durch Aufdrucken (beipielsweise wieder nach Art der Tintenstrahl-Drucker) von chemisch verändernden oder enzymatisch abbauenden Sub­ stanzlösungen geschehen, durch Zerstören mit glühenden Brennspitzen, aber auch durch Abla­ tion von Oberflächenmaterial, beispielsweise durch Funkenerosion oder Laserbeschuß.

Die Probentröpfchen aus der Analytlösung werden normalerweise mit Pipetten auf die bereits aufgebrachten Polyglycerinflecken des Probenträgers aufgebracht. Für das gleichzeitige Auf­ bringen vieler Probentröpfchen aus Mikrotiterplatten werden Vielfachpipetten verwendet, die von Pipettenrobotern in Pipettenautomaten bewegt werden (siehe Fig. 3). Es ist daher gün­ stig, Probenträger in der Größe von Mikrotiterplatten zu verwenden und, wie oben schon er­ wähnt, das Raster der hydrophilen Ankerbereiche an das Raster der Mikrotiterplatten anzupas­ sen. Es ist weiterhin günstig, wenn die Probenträger auch die Form von Mikrotiterplatten ha­ ben, da sie dann von handelsüblichen Pipettenrobotern belegt werden können. Da auf dem Probenträger eine wesentlich höhere Probendichte erreicht werden kann, als es in Mikrotiter­ platten möglich ist, kann das Raster auf dem Probenträger viel feiner sein, als es dem Raster der Mikrotiterplatte entspricht. Es kann beispielsweise durch Teilung des Rasters der Mikroti­ terplatten erhalten werden. Es können dann auf einen Probenträger die Proben aus mehreren Mikrotiterplatten aufgebracht werden. Das Grundraster der Ur-Mikrotiterplatte besteht aus 96 kleinen Gefäßen im Raster von 9 Millimetern in einer Anordnung von 8 Reihen mal 12 Spalten. Die Mikrotiterplatten sind aber ohne Veränderung ihrer Größe weiterentwickelt worden, mo­ derne Ausführungsformen zeigen 384 oder sogar 1536 Mikrogefäße im Raster von 4,5 und 2,25 Millimetern.

Die Aufgabe der Analyttröpfchen auf die Polyglycerintröpfchen erfolgt zweckmäßigerweise, wenn sich die Spitzen der Vielfachpipette im Abstand von 200 bis 500 Mikrometer über dem Probenträger befinden. Es werden etwa 100 bis 500 Nanoliter der Probenlösung aus jeder Pipettenspitze der Vielfachpipette auf den Probenträger pipettiert. Selbst bei einer horizontalen Fehljustierung der Pipettenspitzen können die Tröpfchen ihren jeweils zugeordneten Polygly­ cerinfleck über dem hydrophilen Ankerbereich erreichen und sich dort festsetzen. Beim Abhe­ ben der Vielfachpipette werden die Tröpfchen auf dem Probenträger verbleiben, da sie dort ihren Anker gefunden haben.

Natürlich können die Tröpfchen auch manuell aufgebracht werden, wie es überhaupt viele Verwendungsmöglichkeiten für die hier dargestellte Verfahrensweise gibt, wie es jedem Fach­ mann auf diesem Gebiet nach diesen Ausführungen einleuchtend sein wird.

Es ist natürlich auch eine Vermischung der Analytlösung mit dem Polyglycerin im Probenge­ fäß, beispielsweise im Probengefäß der Mikrotiterplatten, mit nachfolgendem Überpipettieren auf den Probenträger möglich, diese Verfahrensweise wird hier aber als weniger günstig ange­ sehen.

Eine ganz andere Art der Anwendung flüssiger Matrixsubstanzen der erflndungsgemäßen Art betrifft die Analyse von Eiweißen oder Oligonukleotiden, die in Gelen ein- oder zweidimensio­ nal elektrophoretisch getrennt wurden. Die bekannte zweidimensionale Trennung der Biopo­ lymere nach ihrem isoelektrischen Punkt einerseits und nach ihrer elektrophoretischen Mobiltät im Gel andererseits wird häufig auf Polyacrylgelen, aber auch auf anderen Gelen ausgeführt. Die Biopolymere aus den Gelen werden nach ihrer Trennung regelmäßig durch sogenanntes Blotten (in der Regel elektrophoretisches Elektroblotten) auf dünne Blotmenbranen aus Nylon, Nitrozellulose, PVDF oder anderen porös-adsorptiven Materialien überführt, wo sie nach Trocknung lange lagerfähig werden. Die Analyse durch Färbemethoden (Western, Southern, Northern Blotting) kann allerdings nur die intensivsten Eiweiße, DNA oder RNA sichtbar ma­ chen, analytische Methoden mit höheren dynamischen Meßbereichen werden noch gesucht. Die erfindungsgemäßen Matrixflüssigkeiten erlauben nun eine massenspektrometrische MALDI-Analyse der lateralen Verteilungen der verschiedenartigen Biopolymere, beispielswei­ se direkt von den dünnen Blotmembranen herunter. Dazu muß die Matrixflüssigkeit zunächst auf die Blotmembranen aufgebracht werden, ohne Gelegenheit zu einer starken lateralen Dif­ fusion der Eiweiße zu geben. Das kann beispielsweise durch Elektrosprühen der Matrixflüssig­ keiten bei sehr hoher Temperatur (beispielsweise über 100°C) geschehen, da bei diesen Tempe­ raturen eine sehr niedrige Viskosität erreicht wird und sich die Flüssigkeiten wie Wasser ver­ sprühen lassen. Tröpfchen hoher Temperatur lösen einen Teil der adsorbierten Eiweiße von ihrer Adsorptionsunterlage ab. Ein sehr schnelle Abkühlung auf normale Umgebungstempera­ tur friert dann die laterale Verteilung der Eiweiße mit kaum gestörter Ortsauflösung ein. Auch eine Veränderung der Viskosität durch Wasserzugabe kann in diesem Sinne benutzt werden. Das Wasser kann durch Evakuierung wieder entfernt werden.

Die so präparierten Blotmembranen lassen sich direkt auf Trägerplatten spannen und durch entsprechende Scanverfahren unter jeweils punktförmiger MALDI-Ionisierung im Massenspek­ trometer untersuchen. Es können aber auch die Blotmembranen in direkten Kontakt mit Trä­ gerplatten gebracht werden, wobei nach vorsichtigem Abziehen der Blotmembran ein Teil der klebrigen Matrixflüssigkeit auf der Trägerplatte zurückbleibt und dort auf die enthaltenen Ei­ weiße hin massenspektrometrisch untersucht werden kann. Diese Übertragung kann durch ge­ schickte Ausnutzung von Temperaturdifferenzen sehr effektiv gemacht werden, ohne die late­ rale Auflösung der Eiweißverteilung zu stören. Es ist sogar möglich, durch ein sehr feines, hy­ drophil-hydrophobes Raster der Trägerplatte eine Trennung der Matrixflüssigkeit auf der Trä­ gerplatte in sehr feine Tröpfchen zu erzwingen und so eine weitere laterale Diffusion der Ei­ weiße vollständig zu verhindern.

Es soll hier betont werden, daß alle diese Arten der Analysen nur durch den extrem niedrigen Dampfdruck der erfindungsgemäßen Matrixflüssigkeiten ermöglicht werden. Die Verwendung von einfachem Glycerin, wie bisher benutzt, erlaubt diese Vorgehensweise nicht, da das Vaku­ um im Massenspektrometer zu stark beeinträchtigt wird und auch eine längere Analysenzeit für das Scannen vieler Proben oder größerer Flächen wegen des schnellen Austrocknens nicht zur Verfügung steht.

Claims (20)

1. Verfahren zur Ionisierung hochmolekularer Analytsubstanzen, die sich in flüssiger Matrix­ substanz auf einer Trägerplatte befinden, durch gepulste Laserdesorption (MALDI), dadurch gekennzeichnet, daß Matrixflüssigkeiten aus der Gruppe der mindestens dreiwertigen Alkohole mit min­ destens einer Etherbindung in der Kohlenstoffkette eingesetzt werden (Ether-Polyole).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Diglycerin, Triglycerin, höhere Polyglycerine oder Mischungen aus diesen als Matrixflüssigkeiten verwendet werden.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen der Matrixflüssigkeiten neben den Hydroxygruppen der Alkohole und dem Sauerstoff der etherischen Bindung weitere chemische Gruppen enthalten.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Infrarot-Pulslaser verwendet wird, der direkt die Moleküle der Matrixflüssigkeiten anregt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Erbium-YAG-Laser ver­ wendet wird, der die Streckschwingungen der Hydroxygruppen anregt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Laser be­ liebiger Wellenlänge verwendet wird, und daß in den Matrixflüssigkeiten stark absorbie­ rende Substanzen für das Licht mit der Wellenlänge des Lasers gelöst werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß übliche UV-Laser, beipielswei­ se Stickstofflaser mit 337 Nanometer Wellenlänge, verwendet werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Strah­ lungsabsorbentien übliche Matrixsubstanzen für UV-MALDI verwendet werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Trägerplatte mindestens 96 Proben aufgebracht sind.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Analytlösungen für jede Probe erst auf der Trägerplatte mit der Matrixflüssigkeit, die ge­ gebenenfalls Absorbentien enthält, gemischt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß erst die Tröpfchen der Ma­ trixflüssigkeit (gegebenenfalls mit Absorbentien) auf die Trägerplatte aufgestempelt wer­ den, worauf die Analytlösungen mit den verschiedenartigen Analytmolekülen auf die Ma­ trixtröpfchen aufgebracht werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß viele Tröpfchen der Matrix­ substanz gleichzeitig mit einem Vielfachstempel aufgestempelt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ana­ lytlösungen auf die Matrixtröpfchen aufpipettiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Vielfachpipette viele Probentröpfchen gleichzeitig auf die Matrixtröpfchen aufgetragen werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixsubstanz auf hydrophile Bereiche der Trägerplatte aufgebracht werden, die von hydrophoben Randgebieten umgeben sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix­ flüssigkeit, gegebenenfalls mit gelösten Absorbentien, für die Analyse von Biopolymeren direkt auf eine Biopolymere enthaltende Blotmembran aufgebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Matrixflüssigkeit ver­ sehene Blotmembran direkt auf einen Probenträger aufgespannt der MALDI-Analyse zu­ geführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Matrixflüssigkeit aus der Blotmenbran durch Kontakt mit einer Trägerplatte auf diese übertragen und dann einer MALDI-Analyse zugeführt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Matrixflüssigkeit gelöstes Wasser vor Einbringen in das Vakuum des Massenspektro­ meters unter vermindertem Druck und gegebenenfalls unter Erwärmung des Probenträ­ gers abgedampft wird.

20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdampfen des Wassers, eventuell unter vorheriger Erwärmung des Probenträgers, in der Probenschleuse ge­ schieht.