DE10054906A1 - Probenträger für MALDI-Massenspektrometrie - Google Patents

Abstract

Aufgabe war es, einen möglichst aufwandgering herstellbaren und für MALDI-Massenspektrometrie geeigneten Probenträger zu schaffen, der bei Probenaufgabe selbst auf kleinsten Probenflächen eine exakte Lokalisation und ohne Gefahr des Übergreifens auf benachbarte Probenflächen ermöglicht. Besondere Positionierungshilfen sollen für diese exakte Probenlokalisation nicht erforderlich sein. Die exakte Lokalisation soll auch bei Probenaufgabe im Miniaturvolumenbereich ermöglicht werden. DOLLAR A Erfindungsgemäß besteht der Probenträger aus einer Vielzahl von durch Zwischenräume (4) einzelblockartig voneinander abgegrenzten Probenaufnahmeflächen (2), welche jeweils erhaben und ohne in der Probenabgabeebene (5) Formschluss zueinander aufweisen, auf der Oberfläche eines Grundkörpers (1) ausgebildet sind. DOLLAR A Der Probenträger findet überall dort Verwendung, wo große Anzahlen von Proben nach ihrer präzisen Masse im Massenbereich von wenigen hundert Da bis zu mehreren hundert kDA durch MALDI-MS untersucht werden sollen.

Description

Die Erfindung betrifft einen Probenträger für Matrix Assisted Laserdesorption Ionisation- Massenspektrometrie (MALDI MS) und findet überall dort Verwendung, wo große Anzahlen von Proben nach ihrer präzisen Masse im Massenbereich von wenigen hundert Da bis zu mehreren hundert kDa durch MALDI-MS untersucht werden sollen. Einsatz­ gebiete ergeben sich insbesondere bei Massenanalysen, die zum Beispiel in den Bereichen High-through-put-screening (HTS) von Substanzbibliotheken oder Naturstoffen, der Proteom-Analyse, der Untersuchung von Glykosylierungsmustern, der Strukturidentifizie­ rung von biologischen Substanzen und anderen Anwendungsgebieten notwendig sind und deren Probenvorbereitungsschritte mit der etablieren Multiwellplattentechnologie (Mikro­ titrationsplatten, Mikroplatten, micro plates) und der dazugehörigen Liquidhandlingtechnik durchgeführt werden können.

Die Matrix-unterstützte Laserdesorptionsmassenspektrometrie (MALDI), obwohl erst 1988 durch Caras und Hillenkamp in die Analytik eingeführt, hat sich heute als unverzichtbares Arbeitsmittel auf nahezu allen Gebieten der Analytik durchgesetzt. Der Vorteil der Technik liegt darin, dass sich die Massen biologisch relevanter Moleküle in dem großen Massenbereich von wenigen hundert bis zu einigen hundert kDa, ohne unübersichtliche Fragmentierung und relativ robust gegenüber Salzen und Detergenzien in der Probe sehr präzise bestimmen lassen. Die sich stark entwickelnde Massenanalytik im Bereich des HTS und Ultra-high-through-put-screening (UHTS) fordert einen sehr hohen Probendurchsatz. Dieser wird sich prognostisch noch stark vergrößern. Solche große Probemahlen sind nur durch Miniaturisierung und Parallelisierung der Analysensätze zu bewältigen. Es ist daher naheliegend, die großen analytischen Möglichkeiten, die der MALDI-Technik innewohnen zu potenzieren, indem die Technik die Entwicklungen der hochparallelisierten miniaturi­ sierten Analytik, wie sie beispielsweise durch die Multiwellplattentechnik repräsentiert wird, anzupassen. Die Multiwellplattenanalytik mit ihrem traditionellen 8 × 12 Rastermaß, entwickelt sich gegenwärtig in Richtung der Vervielfachung der Anzahl von Proben, die auf derselben Fläche für die Analyse untergebracht werden können. Eine sehr hohe Probenzahl, die auf gleicher Fläche untersucht wird, liegt bei 9600 Proben und wird von DuPont (White Station, NJ) angeboten. Versuche, die MALDI-Analysetechnik an die Bedingungen der Multiwellanalysenplatten-Technologie anzupassen, sind in der DE 196 28 178 C1 der US 5,770,860 und in der DE 197 12 195 Al beschrieben. In der von Franzen, J. beschriebenen Lösung wird der MALDI-Probenträger den Abmessungen der Multiwellanalysenplatte angepasst, mit Matrix beschichtet und mit an sich bekannten Multipipettoren mit der Analyselösung beaufschlagt. Durch mehrfaches Pipettieren mit versetzten Raster kann eine hohe Probendichte erreicht werden. Nachteilig erscheint hierbei die notwendige Vergrößerung der Probenfläche, die Probleme bei der Feldhomogenität des Beschleunigungsfeldes erwarten lassen. In der DE 197 12 195 A1 wird eine Lösung beschrieben, die von beliebig formatierten MALDI-Probenträgern ausgeht und eine Beladung dieser Probenträger mit einem Adapter vorsieht, der passfähig zum herkömmlichen Multiwellanalysenformat ist. In der DE 196 18 032 A1 wird ein vorpräparierter Probenträger beschrieben, der die zu analysierende Substanz vor chemischen Veränderungen schützt und durch die Gestaltung der Schutzschicht die Desorption verbessert. US 5 498 545 beschreibt eine Möglichkeit zur automatischen Zuführung der Probenträger in das Massenspektrometer.

Das letztendlich notwendige Absetzen von kleinen und kleinsten Volumina im Mikroliter- und Submikroliterbereich auf den gegenwärtig in der Praxis eingesetzten Metallproben­ trägern (beispielsweise beim Voyager DE RP der Firma PE Biosystems) mit einer hohen Probendichte bereitet in der Praxis Probleme durch die nur schwer zu realisierende präzise Lokalisation der abgegebenen Tropfen auf einer definierten Metallfläche. So kommt es nicht selten vor, dass sich die abgegebenen Probenvolumina an sehr unterschiedlichen Positionen innerhalb der Probenaufnahmefläche befinden. Darüber hinaus können die Analysenergebnisse durch Übergreifen der abgegebenen Volumina auf Nachbarpositionen verfälscht werden, was sich insbesondere beim automatisierten Auftragen negativ auswirkt und zum Verlust des Analyseergebnisses führt. Um einem Übergreifen der Probenvolu­ mina auf Nachbarpositionen entgegenzuwirken, ist es bekannt, die Probenaufnahmeflächen jeweils als Vertiefungen in die Probenträgerplatte einzubringen (Probenplatten für das Gerät Voyager DE RP der Firma PE Biosystems). Die Fertigung einer solchen Probenträgerplatte erfordert allerdings gegenüber einer planen Analysenplatte einen erhöhten Aufwand. Darüber hinaus ist in den Vertiefungen eine exakte Probenlokalisation nicht gewährleistet, da sich beispielsweise die Proben, speziell im Miniaturvolumen­ bereich, durch Adhäsion etc. an den Rändern und nicht zentrisch zur Probenaufnahme­ fläche lokalisieren. Durch Pressen oder Gießen hergestellte Vertiefungen weisen zudem noch Kantenabrundungen des Bodens auf, welche den vorgenannten Effekt noch unterstützen.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, einen möglichst aufwandgering herstellbaren und für MALDI-Massenspektrometrie geeigneten Probenträger zu schaffen, der bei Probenaufgabe selbst auf kleinsten Probenflächen eine exakte Lokalisation und ohne Gefahr des Übergreifens auf benachbarte Probenflächen ermöglicht.

Besondere Positionierungshilfen sollen für diese exakte Probenlokalisation nicht erforder­ lich sein. Die exakte Lokalisation soll auch bei Probenaufgabe im Mikroliter- und Submikroliterbereich ermöglicht werden.

Erfindungsgemäß besteht der Probenträger aus einer Vielzahl von durch Zwischenräume einzelblockartig, in einer Ebene liegenden, voneinander abgegrenzten Probenaufnahme­ flächen. Diese Probenaufnahmeflächen sind jeweils erhaben und ohne zueinander einen Formschluss in der Probenabgabeebene zu besitzen auf dem Probenträger ausgebildet. Die abgegebenen Probenvolumina unterhalb eines zulässigen Maximalvolumens werden, weitgehend unabhängig von ihrer Volumenmenge, durch Adhäsionskräfte auf diesen erhabenen und voneinander abgegrenzten Arealen insbesondere bei kleinen Proben­ aufnahmeflächen mit präziser Lokalisierung zuverlässig gehalten. Bei guter Benetzbarkeit der Oberflächen kommt es zu einer selbsttätigen Zentrierung der abgegebenen Proben­ flüssigkeit und einer damit verbundenen sehr exakten Probenlokalisation auf Blockarealen. Unterhalb eines Maximalvolumens erfolgt auch kein Überlaufen und kein Übergreifen zu benachbarten Probenarealen mit den in der Angabe zum Stand der Technik genannten Nachteilen.

Der Probenträger, dessen Herstellung, speziell im Vergleich zu Probenträgerplatten mit Vertiefungen als Probenaufnahmegefäße, relativ aufwandgering ist, wird in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch einen x-y-Koordinatentisch, zur Probenabgabe bewegt. Besondere Feinpositionierungshilfen zur extrem lageexakten Steuerung, insbeson­ dere um die Proben mit höchster Positionsgenauigkeit jeweils über dem Zentrum der Probenaufnahmeflächen abzugeben, sind nicht erforderlich.

Hergestellt werden können die einzelblockartig getrennten Probenaufnahmeflächen beispielsweise, indem die Zwischenräume durch mechanische Trennverfahren, wie Säge­ schnitte, Gravuren etc., durch Ätzverfahren oder auch durch Materialabtrag mittels Laser­ bearbeitungsverfahren in das Rohmaterial für die Probenträgerplatte eingebracht werden, so dass nach dieser Bearbeitung der besagte Grundkörper entsteht, auf der die Proben­ aufnahmeflächen jeweils einzelblockartig und erhaben ausgebildet sind. Dieses Fertigungs­ verfahren besitzt gegenüber Press- oder Gießtechnologien den Vorteil sehr scharfkantiger Abgrenzungen der Probenaufnahmeflächen, wodurch ein hoher Abgrenzungseffekt erreicht wird. Auch andere Herstellungsverfahren wären denkbar, beispielsweise ein nachträgliches Aufbringen von Einzelblöcken als Probenaufnahmeareale auf einen bereits vorgefertigten Grundkörper.

Mit dem erfindungsgemäßen Probenträger kann durch mehrfache Rasterverschiebung und die gleichzeitige Abgabe von kleinsten Volumina über einen Multipipettor mit dem n × 8 × 12 Raster oder über einen Multipipettor mit einem Adapter, wie beispielsweise in der DE 197 12 195 A1 beschrieben, für unterschiedliche Probenträgermaße eine hohe Proben­ dichte erreicht werden. Beispielsweise können, mit einem nach DE 197 12 195 A1 adaptierten üblichen 96-fach Multipipettor (beispielsweise der Firma Cybio AG), sowohl aus Multiwellanalysenplatten mit 96 Probenplätzen als auch mit 384 Probenplätzen die jeweiligen Proben sicher auf den vorgeschlagenen Probenträger übertragen werden. Die gleichzeitige parallele Abgabe ist eine Voraussetzung für einen Kristallisationsprozess unter standardisierten Bedingungen und eine schnelle Probenbeschickung, welche Modifi­ kationen der Probe bei längerer Lagerung unter Raumtemperatur, beispielsweise durch den Luftsauerstoff, vermindert.

Besondere Vorteile ergeben sich im Bereich bestehender MALDI-MS-Systeme, wie dem Voyager DE RP (PE Biosystems), da hiermit die aufwendige oder auch unmögliche Änderung der Gerätetechnik zur Verwendung der in DE 197 12 195 A1 vorgeschlagenen Probenträger im Multiwellanalysenplattenformat entfällt und dennoch die Anbindung an das parallele liquid handling im Format n × 8 × 12 günstig erreicht wird.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungs­ beispiels näher erläutert werden.

Es zeigen:

Fig. 1: schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Probenträgers in zwei Ansichten und einem Probenaufgaberaster von 8 × 12;

Fig. 2: Prinzipdarstellung einer rasterversetzten Probenaufgabe auf eine in zwei Ansichten abgebildete Probenträgerplatte im Probenaufgaberaster von 16 × 24.

In Fig. 1 ist in Seitenansicht und Draufsicht ein aus Edelstahl gefertigter Probenträger zur Aufnahme von Proben dargestellt, die mit Methoden der MALDI-Massenspektrometrie untersucht werden sollen. Der Probenträger besteht aus einer Grundkörper 1, aus welchem insgesamt 96 Probenaufnahmeflächen 2 im 8 × 12-Raster an sich bekannter Multiwell­ analysenplatten heraus gearbeitet sind. Die an diese Probenaufnahmeflächen 2 abgegebenen Probenvolumina sind jeweils durch hell dargestellte Tropfen 3 auf den Probenaufnahme­ flächen 2 symbolisiert.

Horizontale und vertikale Zwischenräume 4 grenzen die Probenaufnahmeflächen 2 jeweils gegeneinander ab, so dass diese einzelblockartig und ohne Formschluss in einer durch Strich-Punkt-Linie angedeuteten Probenabgabeebene 5 über dem Grundkörper 1 hervor­ stehen. Hergestellt wurde der Probenträger, indem bei einem massiven Probenträger- Rohling aus besagtem Edelstahl die Freiräume um die zu verkörpernden einzelblockartigen Probenaufnahmeflächen 2 herum mechanisch abgetragen wurden.

In diesem Ausführungsbeispiel wurden die Zwischenräume 4 als scharfkantige Gräben durch Sägeschnitte erzeugt und die Kanten im Randbereich des Probenträgers durch Fräsen ebenfalls auf die Tiefe der Sägeschlitze abgetragen. Die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Eine anschließend auf diese abgesenkten Außenkanten eingebrachte Buch­ stabenmarkierung 6 sowie eine Ziffernmarkierung 7 dienen zur Orientierung der Proben­ aufnahmeflächen 2 für das genannte Probenabgaberaster. Die Oberfläche der im mechani­ schen Abtragsverfahren entstanden Einzelblöcke zur Aufnahme der durch die Tropfen 3 dargestellten Probenflüssigkeit wurde poliert.

Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Probenträgerplatte werden die Tropfen 3 der Probenlösung, die insbesondere durch eine aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellten Multipipettor aufgetragen werden, infolge der im Bereich der Probenabgabe­ ebene 5 scharfkantigen Abgrenzungen der Zwischenräume 4 durch Adhäsionseffekt auf den Probenaufnahmeflächen 2 gehalten und auf diesen jeweils exakt lokalisiert.

Fig. 2 zeigt in zwei Ansichten einen ebenfalls aus Edelstahl und technologisch entsprechend dem ersten Ausführungsbeispiel hergestellten Probenträger für MALDI- Proben im Raster 16 × 24. Der Probenträger ist auf einer Halterung 8 angeordnet, die mit aus Übersichtgründen nicht in der Zeichnung dargestellten an sich bekannten Mitteln für einen Bewegungsantrieb in horizontaler x- und y-Bewegungsrichtung (Richtungspfeile 9 und 10) in Verbindung steht. Derartige Mittel können beispielsweise in einem schrittmotorgesteuer­ ten x-y-Koordinatentisch bestehen, der zur Probenabgabe auch eine Bewegung in vertikaler z-Richtung (Richtungspfeil 11) auszuführen vermag.

Durch die koordinierte Ausführung der Bewegungen in x-, y- und z-Richtung (Richtungs­ pfeile 9, 10 und 11) wird der Grundkörper 1 mit den einzelnen Probenaufnahmeflächen 2 unter Aufgabespitzen 12 eines nicht näher dargestellten Multipipettors in einem Proben­ aufgaberaster 8 × 12 geführt. In einer Ausschnittsvergrößerung A der Fig. 2 wird die Reihenfolge der Probenaufgabe (erste Probenaufgabe a, zweite Probenaufgabe b, dritte Probenaufgabe c und vierte Probenaufgabe d) durch eine der Aufgabespitzen 12 auf vier benachbarte und voneinander abgegrenzte Probenaufnahmeflächen 2 symbolisiert. Auf diese Art wird die gesamte Probenträgerplatte im Raster 16 × 24 durch aufeinanderfolgende und rasterverschobene vierfache Probenaufgabe der Multipipette im Raster 8 × 12 mit den Proben (Tropfen 3) versehen.

Claims (13)

1. Probenträger für MALDI-Massenspektrometrie, mit einer zweidimensional angeord­ neten Anzahl von Probenaufnahmeflächen, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenauf­ nahmeflächen (2) in einer gemeinsamen oberen Ebene liegen und durch Zwischen­ räume (4), deren Grundflächen sich in einer unteren tiefer liegenden Ebene eines Grundkörpers (1) befinden, getrennt sind.

2. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser eine kleinere Grundfläche als eine an sich bekannte Multiwellanalysenplatte aufweist.

3. Probenträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenmaße der Grundkörper (1) den Abmessungen kommerzieller MALDI-MS-PT angepasst sind, das Raster der Probenaufnahmeflächen (2) jedoch dem n × 8 × 12-Raster an sich bekannter Multiwellanalysenplatten entspricht.

4. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser einteilig ausgeführt ist und aus Metall, Keramik, Glas, Kunststoff, oder Kristall, beispielsweise Silizium, besteht.

5. Probenträger nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass dieser mehrteilig und aus einer Kombination der Materialien gemäß Anspruch 3 ausgeführt ist.

6. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufnahme­ flächen (2) mit Metall, insbesondere Gold, beschichtet sind.

7. Probenträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper (1) in seinem primär nicht zur Analytik benutzten Randbereich Markierungen. (6, 7) zur Raster­ orientierung der Probenaufnahmeflächen (2) aufweist.

8. Probenträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser auf einer Halterung (9) angeordnet ist.

9. Probenträger gemäß Ansprüchen 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung (9) mit an sich bekannten Mitteln, beispielsweise einem motorisch angetriebenen x-y-Koordinatentisch und/oder manuell bewegbaren Stellelementen, zur Positionierung des Probenträgers für die Probenaufgabe in Verbindung steht.

10. Verfahren zur Herstellung des Probenträgers gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Zwischenräume (4) durch mechanische Trennverfahren, wie Säge­ schnitte oder Gravuren, erzeugt werden.

11. Verfahren zur Herstellung des Probenträgers gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Zwischenräume (4) durch Lasermaterialbearbeitung erzeugt werden.

12. Verfahren zur Herstellung des Probenträgers gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Zwischenräume (4) durch chemische Ätzverfahren erzeugt werden.

13. Verfahren zur Herstellung des Probenträgers gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die einzelblockartigen Probenaufnahmeflächen (2) in Zwischenräumen (4) zueinander auf den vorgefertigten Grundkörper (1) aufgebracht werden.