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Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Analyt-Ionen aus festen Proben auf Oberflächen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI).
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Die Erfindung verwendet Laserlichtpulse von deutlich unter einer Nanosekunde Dauer mit Spotdurchmessern unter zwanzig Mikrometern und vorzugsweise so geringer Energiedichte, dass nur Mengen von etwa einem Picogramm pro Laserlichtpuls und Laserspot desorbiert werden. Entgegen Angaben in der Literatur liefert diese Kombination von Desorptionsparametern bei Verwendung bestimmter Matrixsubstanzen einen unerwartet hohen Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle der Probe, allerdings auch nur eine geringe Anzahl von Analytionen pro Laserspot. Für die Verwendung in üblichen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern ist es daher günstig, in einem Laserlichtpuls viele Laserspots nebeneinander zu erzeugen. Für andere Arten von Massenspektrometern kann eine hohe Wiederholfrequenz der Laserlichtpulse von etwa 50 Kilohertz, die mit preiswerten Festkörperlasern hergestellt werden kann, mit einzelnen Spots einen konstanten Ionenstrom mit günstiger Ionenstromstärke liefern. Die Spots werden durch Bewegung der Probe oder durch Führung des Laserlichtstrahls so über die Probe geführt, das jedes Mal abgekühlte Stellen der Probe getroffen werden.
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Stand der Technik
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Eine bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle ist die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), die besonders durch M. Karas und K. Hillenkamp vor etwa zwanzig Jahren entwickelt wurde und für deren Grundlagen Koichi Tanaka im Jahre 2002 den Nobelpreis erhielt. MALDI ionisiert die Biomoleküle, die sich in hoher Verdünnung in einer Mischung mit Molekülen einer Matrixsubstanz in Proben auf Probenträgern befinden, durch den Beschuss mit Laserlichtpulsen. Das Verhältnis von Analytmolekülen zu Matrixmolekülen beträgt höchstens etwa eins zu zehntausend, wobei aber die Analytsubstanzen ein Gemisch bilden können, in dem zwischen den verschiedenen zu messenden Analytsubstanzen Konzentrationsverhältnisse herrschen können, die einige Größenordnungen überdecken.
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MALDI steht in Konkurrenz zur Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI), das in einer Flüssigkeit gelöste Analytmoleküle ionisiert und daher leicht mit Separationsverfahren wie Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese gekoppelt werden kann. MALDI besitzt jedoch viele Vorteile. Auf einem Probenträger können Hunderte von Proben aufgebracht werden. Dafür stehen Pipettierroboter zur Verfügung. Der Transport einer benachbarten Probe mit dem Probenträger in den Fokus eines UV-Pulslasers dauert nur Bruchteile von Sekunden, für die Analyse dieser Probe steht dann so viel Zeit wie immer nötig zur Verfügung, nur begrenzt durch einen vollständigen Verbrauch der Probe. Das unterscheidet MALDI sehr vorteilhaft von der Elektrosprüh-Ionisierung, die nur einen sehr langsamen Probenwechsel bietet, und, bei Kopplung mit der Chromatographie, eine Beschränkung der Analysenzeit auf die Dauer des chromatographischen Peaks erzwingt. MALDI ist beispielsweise ideal für die Identifizierung von tryptisch verdauten Proteinen, die durch 2D-Gelelektrophorese getrennt wurden, und deren getrennte Fraktionen zu getrennten MALDI-Proben verarbeitet wurden. Auch die MALDI-Untersuchung von Peptiden, die durch Flüssigkeitschromatographie getrennt und auf MALDI-Probenträger aufgebracht wurden, ist im Vormarsch („HPLC-MALDI”). Besonders interessant ist die Verwendung von MALDI in der bildgebenden Massenspektrometrie von histologischen Dünnschnitten, mit der die örtliche Verteilung einzelner Proteine, aber auch einzelner Pharmaka oder ihrer Metabolite gemessen werden kann.
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Für MALDI werden üblicherweise UV-Laser verwendet, die Laserlichtpulse von einigen Nanosekunden Länge liefern und deren Lichtstrahlen durch Linsen auf einen Fokusfleck von etwa 100 bis 200 Mikrometer Durchmesser abgebildet werden. Da der „Fokusfleck” auf der Probe durch absichtliche Einstellung nicht dem wahren Fokusdurchmesser des Laserlichtstrahls entspricht, spricht man hier besser von „Spot” und „Spotdurchmesser”. Die Ionen jedes einzelnen Laserlichtpulses werden in besonders dazu konstruierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometern axial in eine Flugzeitstrecke hinein beschleunigt und nach Durchlaufen der Flugstrecke einem Detektor zugeführt, der die massenabhängige Ankunftszeit der Ionen und ihre Menge misst und die digitalisierten Messwerte als Flugzeitspektrum speichert. Dabei werden Wiederholfrequenzen der Laserlichtpulse bis zu etwa 2 Kilohertz verwendet. Die Messwerte von einigen Hundert so aufeinander folgend gemessener Flugzeitspektren der Ionen aus den einzelnen Laserlichtpulsen werden zu einem Summenspektrum addiert, dieses wird einer Peak-Erkennung unterworfen, und die Liste mit den Flugzeit-Peaks wird über eine Kalibrierkurve in eine Liste der Massen und ihrer Intensitäten umgewandelt. Diese Liste wird als „Massenspektrum” verstanden.
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Es ist ein Nachteil dieses üblichen MALDI-Verfahrens, nur etwa ein Zehntausendstel der Analytmoleküle zu ionisieren. Aus einem Attomol einer Analytsubstanz, also aus etwa 600 000 Molekülen, werden somit nur etwa 60 Analyt-Ionen gewonnen. Der Rest wird nicht ionisiert, wobei ein unbekannt großer Teil der restlichen Moleküle in abgesprengten Brocken oder in geschmolzenen Spritzern der Matrixsubstanz enthalten sein mag und sich einer Ionisierung völlig entzieht, während andererseits ein ebenfalls unbekannt großer Teil der Analytmoleküle im Prozess der Laserdesorption einfach nicht ionisiert wird.
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Die matrixunterstützte Laserdesorption wird bisher überwiegend im Hochvakuum mit direktem axialen Einschuss der Ionen in die Flugstrecke eines besonders dazu konstruierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometers vorgenommen. Sie geht (mit wenigen Ausnahmen) von festen Probenpräparationen auf einem Probenträger aus. Die Proben bestehen im Wesentlichen aus kleinen Kriställchen der Matrixsubstanz, der in geringen Anteilen (maximal nur etwa ein hundertstel Prozent) Moleküle der Analytsubstanzen beigemischt sind, wobei die „Analytsubstanzen” selbst wiederum aus einer Mischung verschiedenartiger Analytsubstanzen bestehen können. Die Analytmoleküle sind einzeln in das Kristallgitter der Matrixkristalle eingebaut oder befinden sich in Kristallgrenzflächen. Die so präparierten Proben werden mit kurzen Pulsen von UV-Laserlicht bestrahlt. Die Dauer der Pulse beträgt üblicherweise etwa drei bis zehn Nanosekunden. Dabei entstehen Verdampfungswolken, die sowohl Ionen der Matrixsubstanz wie auch einige Analyt-Ionen enthalten. Die Analyt-Ionen sind zum Teil bereits in der festen Probe ionisiert enthalten, entstehen zu einem weiteren Teil direkt bei dem explosionsartigen Verdampfungsprozess im heißen Plasma, und werden zu einem dritten Teil in der sich ausdehnenden Wolke in Reaktionen mit den Matrixsubstanz-Ionen durch Protonenübertragung gebildet.
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In dem sehr detailreichen Review-Artikel „The Desorption Process in MALDI” von Klaus Dreisewerd (Chem. Rev. 2003, 103, 395–425) sind die Einflüsse vieler Parameter wie Spotdurchmesser, Laserlichtpulsdauer oder Energiedichte auf die Desorption und die Entstehung der Matrix-Ionen und der Analyt-Ionen referiert. Obwohl die Einflüsse vieler dieser Parameter nicht voneinander unabhängig sind, sind kaum jemals sorgfältig alle Parameter gegeneinander variiert worden. So wurde beispielsweise berichtet, dass die Laserlichtpulslänge zwischen 0,55 und 3,0 Nanosekunden keinen Einfluss auf die Ionenbildung habe, dabei wurde aber nicht der Spotdurchmesser variiert oder auch nur angegeben. Für variierende Spotdurchmesser wurde dagegen die Schwelle der Energiedichte für das erste Auftreten von Ionen untersucht, ohne aber das Profil der Energiedichte im Laserspot zu untersuchen, das nach unseren eigenen Untersuchungen von außerordentlich hoher Bedeutung ist. Diese Schwelle soll übrigens nach dieser Literaturstelle für kleiner werdende Spotdurchmesser sehr stark ansteigen: für Spotdurchmesser von etwa 10 Mikrometer soll man etwa die zehnfache Energiedichte (Fluenz) wie für Spotdurchmesser von 200 Mikrometern brauchen. Wir können das nicht bestätigen. Über den gegenseitigen Einfluss von Spotdurchmesser und Laserpulslänge ist in der Literatur anscheinend nichts bekannt.
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Die bisherigen Untersuchungen des MALDI-Prozesses waren aber durch Präparationsverfahren für die Proben beeinträchtigt, die nicht reproduzierbar waren. Es wurden im Allgemeinen einfach Tröpfchen auf die Probenträgerplatte aufgetragen und eingetrocknet. Diese Proben waren extrem inhomogen, man musste regelmäßig auf der Probe nach Stellen („hot spots”) suchen, die Analytmoleküle enthielten, um so eine Analyse dieser Substanzen vornehmen zu können. An ein quantitatives Arbeiten war nicht zu denken. Die meisten Untersuchungen des MALDI-Prozesses wurden mit diesen Proben vorgenommen, was viele Ungereimtheiten dieser Untersuchungen erklären mag.
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Inzwischen gibt es für einige nicht wasserlösliche Matrixsubstanzen Verfahren, beispielsweise für α–Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA), sehr reproduzierbar Dünnschichten herzustellen, die aus nur einer einzigen Schicht von dicht an dicht liegenden Kristallen mit nur etwa einem Mikrometer Durchmesser bestehen. Auf diese Dünnschicht von Matrixkristallen wird dann eine überwiegend wässerige Lösung von Analytmolekülen aufgebracht, wobei die Matrixkristalle die Analytmoleküle oberflächlich binden, ohne sich dabei aufzulösen. Das überschüssige Lösungsmittel kann dann nach einer halben oder ganzen Minute wieder abgesaugt werden, wodurch viele Verunreinigungen, wie beispielsweise Salze, entfernt werden. Es wird aber auch ein großer Anteil der Analytmoleküle entfernt, was bei quantitativen Untersuchungen zu berücksichtigen ist. Die oberflächlich adsorbierten Analytmoleküle können nachträglich auch in die Matrixkriställchen eingelagert werden, indem nach dem Trocknen ein organisches Lösungsmittel aufgebracht wird, das die Matrixkriställchen anlöst. Nach dem Verdampfen dieses Lösungsmittels hat man eine sehr homogene Probe, die an jeder Stelle die gleichen Ionenströme mit den gleichen analytischen Ergebnissen liefert. Inzwischen werden mit Dünnschichten von CHCA vorpräparierte Probenträgerplatten kommerziell hergestellt. Für die MALDI-Prozesse, die an diesen Dünnschichtproben ablaufen, wurden noch keine ausreichenden Untersuchungen veröffentlicht.
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Die früher nur im Hochvakuum verwendete Laserdesorption wird seit einigen Jahren auch an Atmosphärendruck benutzt, was die Probenzuführung einfacher macht, aber bisher nicht die Nachweisstärke erhöht hat. Dieses Verfahren wird mit der Abkürzung AP-MALDI bezeichnet (atmospheric pressure MALDI).
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Mit der Einführung von Festkörper-Lasern in die MALDI-Technik statt der bisher verwendeten Stickstoff-Laser musste man feststellen, dass das homogenere Strahlprofil dieser Festkörperlaser die Ionenausbeute verringerte. Es wurde daher ein Verfahren zur inhomogenen Profilierung entwickelt, die die Ionenausbeute sogar noch über die Ionenausbeute der Stickstoff-Laser hinaus erhöhte, Diese Technik ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (A. Haase et al.) beschrieben (Patent Application
GB 2 421 352 A ,
US 7,235,781 B2 ).
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Für andere Arten von Massenspektrometern, beispielsweise für Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonaler Einführung der Ionen („OTOF”), ist es günstiger, statt der gepulsten Ionenerzeugung einen kontinuierlichen Ionenstrahl zu verwenden. In der Patentpublikation
WO 99/38 185 A2 (A. N. Krutchinski et al.) wurde bereits über ein Verfahren berichtet, bei dem die Ionenwolken aus üblichen MALDI-Prozessen in Hochfrequenz-Ionenleitsystemen auseinander gezogen und in dieser Weise zu zumindest zeitweilig konstanten Ionenströmen umgewandelt wurden, um solche Massenspektrometer bedienen zu können, die eines konstanten Ionenstroms bedürfen.
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Wenn hier von „Masse der Ionen” oder auch nur einfach von „Masse” in Verbindung mit Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene Masse” m/z gemeint, also die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion trägt. Die ladungsbezogene Masse m/z wird auch oft etwas unschön als „Masse-zu-Ladungs-Verhältnis” bezeichnet.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die vordringliche Aufgabe der Erfindung, den Ionisierungsgrad für Analytmoleküle im MALDI-Prozess zu erhöhen. Dabei sollen die Ionen in einer Menge erzeugt werden, die für eine Spektrenaufnahme in dem dabei verwendeten Massenspektrometer möglichst optimal ist. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, für bestimmte Arten von Massenspektrometern die Ionen in Form eines kontinuierlichen Ionenstrahles an Analytionen zur Verfügung zu stellen, obwohl sie an sich in diskontinuierlichen Desorptionsprozessen hergestellt werden.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung beruht auf einer Kombination von solchen Parameterwerten des Desorptionsprozesses, die in der Literatur weder einzeln noch in Kombination als besonders günstig für den MALDI-Vorgang angesehen werden, aber einen bisher nicht gekannt hohen Ionisierungsgrad ergeben.
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Durch Verdampfung von Probenmaterial aus sehr kleinen Spotarealen der Probe von weniger als zwanzig Mikrometer Durchmesser, vorzugsweise weniger als zehn Mikrometer Durchmesser, und durch gleichzeitig angewandte sehr kurze Laserlichtpulsdauern von weniger als einer Nanosekunde, vorzugsweise weniger als 500 Picosekunden, werden zwar in jedem Laserspot nur relativ wenige Analyt-Ionen erzeugt, insgesamt steigt aber der Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle bei Verwendung bestimmter Matrixmaterialien auf Werte zwischen einem Zehntel und einem Prozent an. Das ist mehr als das zehnfache des bisher erreichten Ionisierungsgrades. Daraus ergibt sich eine zehn- bis zwanzigfach erhöhte, bisher für MALDI nicht bekannte Nachweisempfindlichkeit für die Analytmoleküle. Vorteilhaft ist die Einstellung einer so geringen Energiedichte, dass in jedem Laserlichtpuls nur etwa ein Picogramm oder weniger Probenmaterial verdampft wird.
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Für einen Einsatz in üblichen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern ist es günstig, dabei aus jedem Laserlichtpuls mehrere, beispielsweise 10 bis 20 Laserspots nebeneinander auf der Probe zu erzeugen, um in jedem Laserlichtpuls genügend Ionen für eine optimale Ausnutzung des Flugzeitspektrometers und seiner Messeinrichtung für Ionen bereitzustellen. Einrichtungen zur Erzeugung mehrerer Laserspots aus einem Laserlichtstrahl sind in der oben bereits zitierten Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (A. Haase et al.) beschrieben.
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Für andere Arten von Massenspektrometern, die besser mit einem konstant-kontinuierlichem Ionenstrahl arbeiten, beispielsweise für Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonaler Einführung der Ionen, kann durch eine außerordentlich hohe Wiederholrate der UV-Laserlichtpulse von über 20 Kilohertz, vorzugsweise höher als 50 Kilohertz, ein solch konstanter Ionenstrahl erreicht werden. Die schnell nacheinander erzeugten Desorptionswolken laufen im umgebenden Vakuum ineinander und bilden den kontinuierlichen Ionenstrom mit einer Ionenstromstärke, die für viele Massenspektrometer bereits bei nur einem Laserspot pro Laserlichtpuls optimal ist.
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Wird nur jeweils ein Laserspot pro Laserlichtpuls erzeugt, so beträgt die auf die Probe in jedem Laserlichtpuls übertragene Energie nur Bruchteile eines Mikrojoule; es kann dann ein Laser mit an sich recht kleiner Gesamtleistung und daher auch kleinen Abmessungen verwendet werden.
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Bei so hohen Wiederholraten für die Laserschüsse entsteht eine praktisch kontinuierliche Ionenquelle, auch wenn sich dabei einzelne Plasmawolken ausbilden. In einer Ausführungsform kann sich jede Plasmawolke auf etwa ein bis zwei Zentimeter Durchmesser relativ ungestört ausdehnen, bevor die Ionen durch die Saugwirkung eines Ionentrichters eingefangen werden. Dabei können die neutralen Gasmoleküle der Verdampfungswolke gut abgepumpt werden. Es kann aber auch die Desorption direkt in ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem hinein erfolgen. Günstig ist es, die freie Ausdehnung der Plasmawolken durch zugeführtes Umgebungsgas etwas zu dämpfen.
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Die Spots sollten von Laserschuss zu Laserschuss über die Probe wandern, um dem jeweils erzeugten Verdampfungskrater Zeit zum Abkühlen zu geben. Bei Erzeugung mehrerer Spots parallel ist in der zitierten Offenlegungsschrift dargelegt, wie eine solche Wanderung erzeugt werden kann. Bei Verwendung einzelner Spots können bewegte Spiegel verwendet werden, beispielsweise durch Piezo-Effekte oder Galvano-Effekte bewegte Spiegel, die auch zusammen mit einer Bewegung der Probenträgerplatte eingesetzt werden können.
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Beschreibung der Abbildungen
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zeigt ein Schema eines Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem Ioneneinschuss, das mit MALDI-Ionen nach dieser Erfindung gespeist wird. Ein UV-Pulslaser (1) mit 60 Kilohertz Wiederholfrequenz sendet fein fokussierte Laserlichtpulse (2) über einen beweglichen Spiegel (3) auf Proben, die sich auf einer beweglich angebrachten Probenplatte (4) befinden, und erzeugt dabei sich ausdehnende Plasmawolken (5), die die Analytionen enthalten. Diese können durch einen Ionentrichter (6) angesaugt und über Ionenleitsysteme (8) und (10) als feiner Strahl (12) einem Flugzeitmassenanalysator zugeführt werden, dessen Pulser (13) Abschnitte des Ionenstrahls über einen Reflektor (15) zu einem Ionendetektor (16) beschleunigt, der die massenabhängig nacheinander ankommenden Ionen in Form eines Zeitprofils misst.
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stellt ein Schema einer geringfügig anders aufgebauten Ionenquelle dar. Auf der Probenplatte (21) befinden sich Proben (22, 23), die vom UV-Pulslaser (24) mit schnell aufeinander folgenden Laserlichtpulsen (25) über einen beweglichen Spiegel (26) beschossen werden können. Die in den Plasmawolken enthaltenen Analytionen (27) werden vom Ionentrichter, der aus einzelnen Lochblenden (28) besteht, in die Ionenleitsysteme (29) und (31) weitergeleitet.
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Die gibt ein Flugzeitmassenspektrometer mit axialer Beschleunigung der aus der Probe (47) auf dem Probenträger (41) erzeugten Ionen durch die Beschleunigungsblenden (48) in die Flugstrecke (49) wieder. Der Laserlichtpuls aus dem Picosekunden-UV-Laser (43) wird in einer Teilerscheibe (44), beispielsweise aus einem Feld von Einzellinsen bestehend, geteilt; über Linse (45) und beweglichen Spiegel (46) wird eine Vielzahl von sehr kleinen Spots von jeweils unter 20 Mikrometer Durchmesser auf der Probe (47) bestrahlt.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Einigermaßen präzise Untersuchungen über die Ionenausbeute des MALDI-Prozesses sind in der Literatur kaum zu finden. Das wird verständlich, wenn man versteht, wie schwierig solche Untersuchungen durchzuführen sind: man muss dabei eine sehr genau zubereitete und eingewogene Probe bis zur völligen Erschöpfung der in der Regel inhomogenen Probe mit konstant gehaltenen MALDI-Parametern messen, die oft nicht sehr genau bekannten Ionentransmissionen in den einzelnen Teilbereichen des verwendeten Massenspektrometers abschätzen, die Detektorempfindlichkeit kalibrieren und aus den Messergebnissen die Ionenausbeute berechnen. Das ist für das bisherige Präparationsverfahren mit getrockneten Tröpfchen wegen der starken Inhomogenität der Probe kaum zufriedenstellend möglich.
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Untersucht man die Ionenausbeute des MALDI-Prozesses pro Analytmolekül an Dünnschichtpräparationen in Abhängigkeit von Spotdurchmesser, Laserschuss-Energie und Laserlichtpulslänge relativ zueinander, was wesentlich einfacher ist, so stellt man überraschend und entgegen den in der Literatur verbreiteten Angaben fest, dass die Ausbeute stark ansteigt, wenn man mit sehr kurzen Laserlichtpulsen von deutlich unter einer Nanosekunde arbeitet und in einem nur sehr kleinem Probenareal eine winzige Menge an Probenmaterial von unter einem Picogramm verdampft. Es werden dabei hohe Ausbeuten an Analyt-Ionen erreicht: es können durchaus etwa zehn- bis hundertfach mehr Analyt-Ionen aus der Probe gewonnen werden, als mit üblichen Bedingungen. Es sind allerdings die Absolutzahlen der Analyt-Ionen pro Laserschuss sehr niedrig; sie betragen für Analytsubstanzen höchster Konzentrationen in der Probe nur etwa einige Hundert Analyt-Ionen. In Mischungen vieler Analytsubstanzen in einer Probe, die jedoch alle analysiert werden sollen, sind für solche Analytsubstanzen, die sich in wesentlich niedrigerer Konzentrationen als die hauptsächlich vorhandenen Analytsubstanzen in der Probe befinden, nur in jedem zehnten oder hundertsten Laserlichtpuls ein Analyt-Ion zu finden.
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Diese höchst effiziente Art von MALDI ist aber ohne weitere Maßnahmen nicht optimal für die übliche MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie mit axialer Beschleunigung der Ionen, da diese für einen zufrieden stellenden Betrieb möglichst etwa 2000 bis 10 000 Analyt-Ionen pro Laserschuss braucht. Diese MALDI-Flugzeitmasenspektrometrie nimmt die Ionen eines jeden Laserschusses in einem eigenen Massenspektrum auf. Da auch noch Komponenten der Analytsubstanzen gemessen werden sollen, die nur ein Zehntausendstel der Konzentration der Hauptkomponente haben, müssten bei Anwendung der neuen Technik für dieses Ziel mit nur einem Spot pro Laserlichtpuls weit über Zehntausend Massenspektren addiert werden, was eine für massenspektrometrische Verhältnisse lange Zeit in Anspruch nimmt, selbst wenn man ein Massenspektrometer mit einer Messfrequenz für Massenspektren von zwei Kilohertz verwenden kann.
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Es ist daher eine erste günstige Ausführungsform eines Massenspektrometers unter Benutzung dieser Erfindung, aus dem Lichtstrahl eines kurzen UV-Laserlichtpulses von weit unter einer Nanosekunde Dauer nicht nur einen einzigen kleinen Laserspot, sondern mehrere Laserspots zu erzeugen, die jeweils Durchmesser unter zwanzig Mikrometer, vorzugsweise unter zehn Mikrometer, haben, und die so erzeugte größere Anzahl von Ionen axial in die Flugstrecke zu beschleunigen. Mit fünf bis zwanzig Laserspots werden so in jedem Laserlichtpuls einige Tausend Analyt-Ionen erzeugt, wie sie für die axiale MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie günstig sind. Die Erzeugung von mehreren Laserspots aus einem Laserlichtstrahl ist in der oben zitierten Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (A. Haase et al.) detailliert dargelegt.
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In ist ein solches Flugzeitmassenspektrometer schematisch gezeigt. Der Strahl des Laserlichtpulses aus dem UV-Laser (43) wird dabei in einer Teilerscheibe (44) vielfach geteilt. Die Teilerscheibe (44) kann beispielsweise aus einem Feld kleiner Einzellinsen bestehen, die eine Vielzahl von kleinen Fokuspunkten erzeugen, die dann wiederum von der Linse (45) und dem beweglichen Spiegel (46) auf die Probe (47) fokussiert werden. Dadurch wird erfindungsgemäß eine Vielzahl kleiner Spots auf der Probe erzeugt. Die Probe (47) befindet sich auf einer Probenträgerplatte (41), die durch eine Bewegungseinrichtung (42) bewegt werden kann, um die verschiedenen Proben auf der Probenträgerplatte in den Lichtstrahl zu bringen, aber auch, um die Spots zusätzlich zur Führung durch den beweglichen Spiegel (46) über die Probe von Laserlichtpuls zu Laserlichtpuls wandern zu lassen. Die Ionen werden durch die Beschleunigungsblenden (48) zur einem Ionenstrahl (49) geformt, der über den energiefokussierenden Reflektor (50) zum Detektor (51) fokussiert wird.
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Für ein Flugzeitmassenspektrometer dagegen, das mit orthogonalem Ioneneinschuss, einem konstanten Ionenstrom und einer üblichen Spektrenaufnahmefrequenz von 5000 bis 10 000 Massenspektren pro Sekunde arbeitet, sind die Verhältnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens selbst bei nur einem einzigen Spot pro Laserlichtpuls nahezu ideal, wenn eine genügend hohe Frequenz der Laserlichtpulse gewählt wird. Es ist also eine weitere günstige Ausführungsform, hierfür eine Laserpulsrate von mindestens zwanzig Kilohertz, vorzugsweise mindestens fünfzig Kilohertz einzusetzen. Es gibt kommerzielle UV-Laser, die bei etwa 350 Picosekunden Laserlichtpulsdauer mit etwa 60 Kilohertz arbeiten und wegen der geringen Laserleistung auch eine sehr kleine Baugröße haben. Es liefert dann die Ionenquelle bei 60 Kilohertz, also mit sechs bis zwölf Laserschüssen für ein Massenspektrum, etwa tausend bis fünftausend Analyt-Ionen für jeweils eine Spektrenaufnahme. Wegen der hohen Massenauflösung dieser Geräte liegen dann die intensivsten Ionensignale relativ dicht unter der Sättigungsschwelle für den Ionendetektor. Zur Zeit wird normalerweise mit einem Messtakt von zwei Gigahertz und einer Digitalisierungsbreite von acht Bit gearbeitet. In Aufnahmezeiten von einer Zehntelsekunde bis zu einer Sekunde können also durchaus etwa ein bis zehn Millionen Analyt-Ionen vermessen werden; daraus ergibt sich ein hoher dynamischer Messbereich für diese Art von Messungen.
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Sollten in Zukunft durch Weiterentwicklung der Elektronik wesentlich höhere Aufnahmeraten und breitere Digitalisierungen möglich werden, die eine höhere Sättigungsschwelle darstellen, beispielsweise acht Gigahertz mit 12 bit Breite, so kann man auch hier mit optischen Systemen für die Fokussierung der Laserlichtpulse arbeiten, die durch Aufspaltungen des Laserlichtstrahls mehr als nur einen Spot pro Laserlichtschuss liefern und damit die Erzeugungsrate für Ionen entsprechend der Anzahl von Spots vervielfachen.
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Ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonaler Ioneneinführung ist in Verbindung mit einer erfindungsgemäßen Ionenquelle schematisch in dargestellt. Ein UV-Pulslaser (1) mit 60 Kilohertz Wiederholfrequenz sendet fein fokussierte Laserlichtpulse (2) auf Proben, die sich auf einer beweglich angebrachten Probenplatte (4) befinden. Der Laserlichtstrahl wird über ein hier nicht gezeigtes Linsensystem auf einen Spotdurchmesser von weniger als zwanzig, vorzugsweise weniger als zehn Mikrometer auf der Probe fokussiert. Er wird dabei von einem beweglichen Spiegel (3) geführt, der es erlaubt, den Verdampfungsspot von Laserschuss zu Laserschuss auf eine andere Stelle der Probe zu lenken. Dabei werden Plasmawolken (5) erzeugt, die neben Untergrund-Ionen, die dem Matrixmaterial entstammen, insbesondere die Analyt-Ionen enthalten und sich fortlaufend in das umgebende Vakuum hinein ausdehnen.
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Die Ionen können durch einen Ionentrichter (6) angesaugt und über Linsensysteme (7, 9, 11) und Ionenleitsysteme (8, 10) als feiner Strahl (12) einem Flugzeitmassenanalysator zugeführt werden, dessen Pulser (13) Abschnitte des Ionenstrahls (12) über einen Reflektor (15) zu einem Ionendetektor (16) beschleunigt. Die massenabhängig nacheinander ankommenden Ionen in ergeben ein Zeitprofil des Ionenstroms, dessen Peaks die Ionenmassen und Ionenmengen widerspiegeln. Die Digitalisierung ergibt Wertefolgen, die jeweils ein Flugzeitspektrum darstellen. In diesen Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonaler Ioneneinführung werden durchaus etwa 5000 bis 10 000 Flugzeitspektren pro Sekunde aufgenommen. Aufeinanderfolgende Flugzeitspektren werden zu einem Summenspektrum addiert. Das Summenspektrum wird dann einem Rechenprogramm zur Peak-Erkennung unterworfen und die Flugzeiten der Peaks werden über eine Kalibrierkurve in ein Massenspektrum umgewandelt.
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Es ist aber die MALDI-Ionisierung wegen ihrer schnellen Abarbeitung von vielen Proben in kurzer Zeit und wegen ihrer Entkopplung von Separationsverfahren auch für andere Arten von Massenspektrometern nachgefragt, beispielsweise für Ionenzyklotronresonanz-Fourier-Transform-Massenspektrometer (ICR-FT-MS) oder für elektrostatische Ionenfallen. Obwohl diese Arten von Massenspektrometern getaktet arbeiten, ist auch für diese ein konstant fließender Ionenstrom günstig. Auch hier kann die erfindungsgemäße Art von MALDI mit kurzen Laserlichtpulsen sehr hoher Wiederholfrequenz und geringer Verdampfungsmenge gut eingesetzt werden.
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Es sind UV-Laser mit einer Wiederholfrequenz von 60 Kilohertz, einer Laserlichtpulsdauer von nur 350 Picosekunden und relativ geringer Leistung auf dem Markt, die für diese Anforderungen ideal geeignet sind, wenn nur ein einziger Spot pro Laserlichtpuls bestrahlt werden soll. Verglichen mit anderen, bisher für MALDI eingesetzten UV-Pulslasern haben sie nur geringe räumliche Abmessungen.
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Die Vorgänge in den Plasmawolken, die durch sehr kurze Laserlichtpulse erzeugt wurden, sind anscheinend von denen in bisher für MALDI erzeugten Laserplasmen sehr verschieden. So werden die Matrixmoleküle weit weniger stark zersetzt und weit weniger zu höchst komplexen Ionen mit verschiedensten Massen umgebaut. Es entsteht bedeutend weniger chemischer Untergrund aus solchen Ionen, die aus Matrixmolekülbruchstücken aufgebaut sind, als das bei klassischem MALDI der Fall ist. Die Ionen der unzersetzten Matrixsubstanzen und deren Dimere und Trimere sind weit klarer im Untergrund zu erkennen als bei klassischem MALDI. Der Untergrund, der sich bei klassischem MALDI stark störend bis zu einer Masse von etwa 1000 Dalton erstreckt, reicht bei Anwendung der kurzen Laserlichtpulse längst nicht so weit in den Massenbereich der Massenspektren hinein. Durch den niedrigeren Untergrund wird die Nachweisgrenze in günstiger Weise zu niedrigeren Konzentrationen verschoben.
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Die zeigt eine erfindungsgemäße Ionenquelle in etwas mehr Detail. Es ist hier die Strahlführung für die Laserlichtpulse (25) etwas anders als in : Der Laserlichtstrahl tritt hier durch zusätzliche Löcher in den Lochblenden (28) des Ionentrichters hindurch. Er trifft auf die Probe (23) auf der Probenträgerplatte (21), die insgesamt eine große Anzahl von Proben (22, 23) enthält. Die Probenträgerplatte kann aus einem beliebigen Material bestehen; es ist allerdings günstig, wenn die Probenträgerplatte elektrisch leitend ist oder ein metallischer Kern, eine metallische Hinterlegung oder eine metallische Oberfläche ein elektrisches Potential annehmen kann, das für eine Potentialdifferenz zwischen Probenträgerplatte (21) und Ionentrichter (28) dienen kann. Die Probenträgerplatte (21) muss außerdem so beschaffen sein, dass die Proben (22, 23) festgehalten werden und später ohne Absprengen größerer Probenbrocken desorbiert werden können. Vorteilhaft sind Proben auf der Basis von Dünnschichten des Matrix-Materials. Da eine Desorption durch Laserlicht vorgenommen wird, sollte die Oberfläche der Probenträgerplatte einigermaßen resistent gegen eine Abtragung durch die Laserlichtpulse sein. Die Probenträgerplatte (21) ist parallel zur Oberfläche, die die Proben (22, 23) aufnimmt, in zwei Richtungen verschiebbar, so dass alle Proben (22, 23) nacheinander in den Spot des Laserlichtstrahls (25) gebracht werden können. In befindet sich die besonders gekennzeichnete Probe (23) im Spot des Laserlichtstrahls (25).
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Die MALDI-Proben (22, 23) bestehen hier wie bei üblichem Vakuum-MALDI aus einer Auftragung von Matrixsubstanz mit einem geringen Anteil von nur etwa einem Hundertstel Prozent an Analytmolekülen. Die Verdünnung bewirkt, dass die Analytmoleküle nicht in Form von Dimeren oder Trimeren desorbiert werden; denn einmal gebildete Dimere und Trimere werden sich in der Gasphase nicht mehr trennen. Die Aufgabe der Matrixsubstanz besteht also darin, die Analytmoleküle in fein verteilter Form auf der Probenträgerplatte (21) festzuhalten, Laserlicht aus dem Laserlichtpuls (25) zu absorbieren, dadurch das Probenmaterial so zu desorbieren, dass die Analytmoleküle weitgehend unbeschädigt und einzeln entweder ionisiert oder neutral in die Gasform überführt werden, und einen möglichst großen Anteil der noch nicht ionisierten Analytmoleküle in der Plasmawolke durch Protonenübertragung von den Matrixsubstanz-Ionen auf die Analytmoleküle zu ionisieren.
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Im Spot des Laserstrahls (25) wird nun ein winziger Teil der Probe (23) mit vorzugsweise weniger als einem Picogramm Probenmaterial desorbiert, wobei der Laserstrahl (25) aus dem Laser (24) über den Spiegel (26) auf die Probe (23) gelenkt wird. Die zur Fokussierung des Laserlichtstrahls zu einem Spot notwendigen Linsen sind in nicht wiedergegeben. Als Laser (24) dient in dieser Ausführungsform vorzugsweise ein UV-Pulslaser, der kurze Laserlichtpulse von unter 0,5 Picosekunden Dauer liefert; Jeder Laserlichtpuls erzeugt jeweils eine eigenständige Desorptionswolke mit Analyt-Ionen (27), die jedoch wegen der schnellen Folge ineinander laufen und den konstanten Ionenstrom liefern. Der UV-Laser arbeitet vorzugsweise im Wellenlängenbereich von etwa 310 bis 360 Nanometer.
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Der Spiegel (26) soll sehr schnell um sehr kleine Winkel beweglich sein, um den Laserlichtspot von Laserschuss zu Laserschuss über die Probe zu bewegen. Dadurch kann der Verdampfungskrater nach jedem Laserschuss jeweils wieder durch Wärmeabgabe abkühlen. Die Bewegung kann beispielsweise durch Aufkleben des Spiegels auf einen Piezo-Kristall realisiert werden. Der Piezo-Kristall kann dabei flächig in seinen Eigenfrequenzen angeregt werden. Der Spiegel folgt dann den Schwingungen und versetzt die Spots mit hoher Geschwindigkeit. Zusätzlich kann auch die Bewegung der Probenträgerplatte zu einer Verteilung der Spots über die Probe beitragen. Die Verwendung eines Spiegels mit einem galvanometrischen Antrieb ist ebenfalls möglich.
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Der Ionentrichter (28) besteht aus einer Folge von Lochblenden, an denen abwechselnd die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen, so dass an der virtuellen Wand des trichterförmigen Innenraums ein Ionen abstoßendes Pseudopotential entsteht. Der Hochfrequenzspannung ist eine Folge von Gleichspannungen überlagert, die die Ionen in den Ionentrichter einsaugt und zum engeren Ende führt. Am Ende geht der Trichter in ein Ionenleitsystem aus Lochblenden (29) über. An den Lochblenden (29) liegen wiederum abwechselnd die beiden Phasen einer Hochfreqenzspannung, überlagert von einem Gleichspannungsgefälle. Ein Linsensystem (30) führt dann die Ionen in das Multipol-Stabsystem (31), das die Ionen zum Analysator leitet.
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Das Ionenleitsystem (31), das hier zur Aufnahme der Analyt-Ionen aus der erfindungsgemäßen Ionenquelle dient, ist hier nur als ein Beispiel für ein System dargestellt, das die Analyt-Ionen aufnehmen, gegebenenfalls weiterleiten oder auch für einige Zeit zwischenspeichern kann. Das Ionenleitsystem kann, wie in gezeigt, aus Polstäben bestehen, die mit einer Hochfrequenzspannung versorgt sind. Es kann, muss aber nicht, die Analyt-Ionen in den Analysatorteil des Massenspektrometers weiterleiten, wo sie nach Massen und Intensitäten analysiert werden. Statt eines Massenspektrometers kann auch jede andere geeignete Art von Spektrometer für die Analyse der Analyt-Ionen zum Einsatz kommen, beispielsweise ein Ionenmobilitätsspektrometer, oder ein optisches Spektrometer.
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Die Verdampfung der Probenmaterialien in den Spots kann aber auch direkt in die Achse eines Multipol-Stabsystems hinein erfolgen, wobei der Laserlichtpuls durch die Zwischenräume zwischen den Polstäben eingeschossen wird. Es hat sich in diesem Fall als günstig erwiesen, die Probe auf dem Probenträger durch eine Kapillare mit etwas Gas anzublasen, so dass vor der Probe ein leicht erhöhter Druck von etwa einem Hundertstel bis zu einem Zehntel Pascal herrscht. Dadurch steigt die Ausbeute an Analyt-Ionen nochmals an.
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Für die Präparation der Proben (22, 23) können, wie oben schon angemerkt, die klassischen Matrixsubstanzen und Aufbereitungsverfahren genutzt werden. Die Proben auf den Probenträgern haben im Allgemeinen Durchmesser, die zwischen 200 Mikrometern und zwei Millimeter liegen. Vorpräparierte Dünnschichten mit Matrixmaterial sind beispielsweise mit Durchmessern der Auftragungen von 800 Mikrometern erhältlich. Dünnschichten werden bevorzugt aus α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) hergestellt. Die Dünnschicht-Auftragungen befinden sich in Gebieten der Probenträgerplatte, die stark hydrophob sind. Die Proben können dann in gelöster Form mit Pipettierrobotern auf die Dünnschichten auf der Probenträgerplatte aufgebracht und dort eingetrocknet, oder besser nach kurzer Zeit wieder abgehoben werden. Werden keine Dünnschichten verwendet, sondern zum Beispiel 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), Sinapinsäure (SA) oder 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), so können besondere hydrophile Bereiche auf der Probenträgerplatte in hydrophober Umgebung die Probenkristallisation auf diese hydrophilen Bereiche beschränken. Es ist eine Vielzahl von Matrixsubstanzen bekannt, die jeweils auf bestimmte Gruppen von Analytsubstanzen abgestimmt sind und diese besonders gut ionisieren.
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Für die bildgebende Massenspektrometrie an histologischen Dünnschnitten können ebenfalls die dafür entwickelten Belegungsverfahren für Matrixmaterialien eingesetzt werden. Die bildgebende Massenspektrometrie wird zur Zeit meist mit axialen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern durchgeführt. Das erfindungsgemäße Kurzzeit-MALDI verspricht hier bessere Nachweisgrenzen bei gleicher Zeitdauer des Rasterverfahrens für die Spektrenaufnahme. Es sind aber auch Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss für diesen Zweck interessant, weil die Abrasterung der Proben um ein Vielfaches schneller zu werden verspricht als mit klassischer MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie.
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Die Ionenquellen der Erfindung können in Massenspektrometern verschiedener Art ihre Anwendung finden, aber auch in ganz anderen Arten von Spektrometern, beispielsweise in Ionenmobilitätsspektrometern. Besonders interessant ist beispielsweise eine Anwendung als höchstempfindliche Ionenquelle in einem Tandem-Massenspektrometer, das als erstes Trennsystem ein Quadrupolfilter und als Massenanalysator einen Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss (Q-OTOF) enthält. Diese Art von Massenanalysator hat höchste Empfindlichkeit, großen dynamischen Messbereich, und eine hervorragende Massengenauigkeit auch für Tochterionenspektren. Als Fragmentierungs-Einheit kann sowohl eine Stoßzelle wie auch eine beliebige andere Fragmentierungsstufe verwendet werden.
