DE69631556T2

DE69631556T2 - Biomolekülenanalyse mittels Flugzeitmassenspektrometrie

Info

Publication number: DE69631556T2
Application number: DE69631556T
Authority: DE
Inventors: Marvin L. Houston Vestal
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 2009-09-17
Anticipated expiration: 2016-05-18
Also published as: DE957508T1; JPH11505949A; DE827629T1; EP0827629A1; DE69618949D1; US5627369A; JP3580553B2; US20040079878A1; EP0957508A3; US6541765B1; US5760393A; WO1996036987A1; EP0957508A2; DE69618949T2; EP0827629B1; DE69631556D1; US5625184A; EP0957508B1

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Massenspektrometrie. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Betrieb eines Massenspektrometers.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Massenspektrometrie ist eine Analysenmethode zur genauen Bestimmung von Molekulargewichten, zur Identifikation chemischer Strukturen, zur Bestimmung der Zusammensetzung von Gemischen und zur qualitativen Elementaranalyse. Beim Betrieb erzeugt ein Massenspektrometer Ionen von zu untersuchenden Molekülproben, trennt die Ionen gemäß ihrem Verhältnis Masse zu Ladung und misst die relative Menge eines jeden Ions.
Flugzeit-(TOF-)Massenspektrometer trennen Ionen gemäß ihrem Verhältnis Masse zu Ladung durch Messung der Zeit, welche erzeugte Ionen brauchen, um zu einem Detektor zu gelangen. TOF-Massenspektrometer sind vorteilhaft, weil sie verhältnismäßig einfache, kostengünstige Instrumente mit einem tatsächlich unbegrenzten Bereich des Verhältnisses Masse zu Ladung sind. TOF-Massenspektrometer haben möglicherweise eine höhere Empfindlichkeit als Abtastinstrumente, weil sie alle bei jedem Ionisationsfall erzeugte Ionen aufzeichnen können. TOF-Massenspektrometer sind besonders zur Messung des Verhältnisses Masse zu Ladung großer organischer Moleküle brauchbar sind, wenn herkömmlichen Magnetfeld-Massenspektrometern Empfindlichkeit fehlt. Die Technologie von TOF-Massenspektrometern gemäß dem Stand der Technik ist beispielsweise in den U.S.-Patenten Nrn. 5.045.694 und 5.160.840 gezeigt.
TOF-Massenspektrometer umfassen eine Ionisationsquelle zur Erzeugung von Ionen eines unter Untersuchung befindlichen Probematerials. Die Ionisationsquelle enthält eine oder mehrere Elektroden oder elektrostatische Linsen zur Beschleunigung und richtigen Ausrichtung des Ionenbündels. Im einfachsten Fall sind die Elektroden Gitter. Ein Detektor ist in einem zuvor festgelegten Abstand von dem Endgitter für den Nachweis für Ionen als Funktion der Zeit angeordnet. In der Regel ist zwischen dem Endgitter und dem Detektor ein Abtriftbereich vorhanden. Der Abtriftbereich ermöglicht, dass die Ionen einen zuvor festgelegten Abstand im freien Flug durchlaufen, bevor sie auf den Detektor aufprallen.
Die Flugzeit eines durch ein gegebenes elektrisches Potential beschleunigten Ions ist proportional zu seinem Verhältnis Masse zu Ladung. Deshalb ist die Flugzeit eines Ions eine Funktion seines Verhältnisses Masse zu Ladung und sie ist annähernd der Quadratwurzel des Verhältnisses Masse zu Ladung proportional. Unter der Annahme der Anwesenheit von lediglich einzeln geladenen Ionen erreicht die leichteste Gruppe von Ionen den Detektor zuerst, gefolgt von Gruppen mit zunehmend schwererer Masse. In der Praxis erreichen jedoch Ionen gleicher Masse und Ladung den Detektor zur genau der gleichen Zeit. Dies tritt in erster Linie aufgrund der anfänglichen zeitlichen, räumlichen und kinetischen Energieverteilungen von erzeugten Ionen auf. Diese anfänglichen Verteilungen führen zu einer Verbreiterung der Massenspektrumpeaks. Die verbreiterten Spektrapeaks begrenzen die Auflösungskraft von TOF-Spektrometern.
Die anfängliche zeitliche Verteilung ergibt sich aus der Ungewissheit der Zeit der Ionenbildung. Die Zeit der Ionenbildung kann gewisser gemacht werden, indem man gepulste Ionisierungsverfahren, wie z. B. Plasmadesorption und Laserdesorption, anwendet. Diese Verfahren erzeugen Ionen während eines sehr kurzen Zeitraums.
Eine anfängliche räumliche Verteilung ergibt sich aus Ionen, welche nicht in einer gut definierten Ebene senkrecht zur Flugachse erzeugt sind. Desorptionsverfahren wie Plasmadesorption oder Laserdesorption von Ionen führen zu den geringsten anfänglichen räumlichen Verteilungen, weil Ionen ihren Ursprung auf sehr gut definierten Bereichen auf der Probenoberfläche haben, und die anfängliche räumliche Ungewissheit der Ionenbildung vernachlässigbar ist. Die anfängliche Energieverteilung ist die Folge der Ungewissheit der Energie der Ionen während der Bildung. Die verschiedensten Verfahren wurden zur Verbesserung der Massenauflösung durch Ausgleich der anfänglich kinetischen Energieverteilung der Ionen angewandt. Bei zwei weit verbreitet benutzten Methoden wird ein Ionenreflektor (auch Ionenspiegel oder Reflektron genannt) und eine gepulste Ionenextraktion.
Gepulste Ionisierung wie Plasmadesorptionsionisierung (PD-Ionisierung) und Laserdesorptionsionisierung (LD-Ionisierung) erzeugen Ionen mit einer minimalen Ungewissheit hinsichtlich Raum und Zeit, jedoch verhältnismäßig breiten anfänglichen Energieverteilungen. Herkömmliche LD benutzt typischerweise ausreichend kurze Impulse (häufig weniger als 10 Nanosekunden), um die zeitliche Ungewissheit auf ein Minimum herabzusetzen. Jedoch können in manchen Fällen sich Ionenerzeugungen eine gewisse Zeit fortsetzen, nachdem der Laserimpuls endet, was ein Verlust der Auflösung infolge temporaler Ungewissheit bewirkt. Auch ist der die Ionen erzeugende Laserimpuls in manchen Fällen viel länger als die erwünschte Breite der Massenspektrumpeaks (beispielsweise einige IR-Laser).
Die längere Impulslänge kann die Massenauflösung ernsthaft begrenzen. Die Leistung von LD kann durch Zugabe eines kleinen organischen Matrixmoleküls zum Probematerial, das bei der Wellenlänge des Lasers hoch absorbierend ist, wesentlich verbessert werden. Die Matrix erleichtert die Desorption und Ionisierung der Probe. Die Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisiation (MALDI) ist besonders bei biologischen Anwendungen vorteilhaft, da sie die Desorption und Ionisierung großer Biomoleküle oberhalb von 100.000 Da Molekülmasse erleichtert, wobei diese intakt gehalten werden.
Bei der MALDI werden üblicherweise Proben auf einer glatten Metalloberfläche abgeschieden und in die Gasphase als Ergebnis eines gepulsten Laserbündels, das die Oberfläche der Probe beaufschlagt, desorbiert. Deshalb werden Ionen in einem kurzen Zeitintervall gebildet, entsprechend annähernd der Dauer des Laserimpulses, und in einem sehr engen räumlichen Bereich, entsprechend demjenigen Teil der Feststoffmatrix und Probe, welcher genügend Energie von dem Laser absorbiert, um verdampft zu werden. Dies wäre eine nahezu ideale Quelle für Ionen zur Flugzeit-(TOF)Massenspektrometrie, wenn die anfänglichen Ionengeschwindigkeiten auch gering waren. Leider ist dies nicht der Fall. Ein schnelles Abschmelzen der Matrix durch den Laser führt zu einem Ultraschallstrahl von Matrixmolekülen mit einem Gehalt an Matrix- und Probeionen. In Abwesenheit eines elektrischen Feldes erreichen sämtliche molekularen und ionischen Gattungen im Strahl nahezu gleichförmige Geschwindigkeitsverteilungen als Ergebnis häufiger Kollisionen, welche innerhalb des Strahls auftreten.
Das Ionenausstoßverfahren bei MALDI wurde durch verschiedene Forschungsgruppen studiert. R. C. Beavis. B. T. Chait, Chem. Phys. Let., 181, 1991, 479. J. Zhou, W. Ens, K. B. Standing, A. Verentchikov, Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 1992, 671–678. In der Abwesenheit eines elektrischen Feldes sind die anfänglichen Geschwindigkeitsverteilungen für durch MALDI erzeugte Peptid- und Proteinionen nahezu unabhängig von der Masse des Analyten und der Laserintensität. Die mittlere Geschwindigkeit beträgt etwa 550 m/Sek., mit der meisten Geschwindigkeitsverteilung zwischen 200 und 1.200 m/Sek. Die Geschwindigkeitsverteilung für Matrixionen ist im wesentlichen mit derjenigen für die Peptide und Proteine in Nähe der Schwellen-Bestrahlungsdichte identisch, verschiebt sich jedoch bei höherer Bestrahlungsdichte dramatisch nach höheren Geschwindigkeiten. Die Ionengesamtdichte erhöht sich mit ansteigender Laserbestrahlungsdichte schnell und liegt im Bereich von etwa 104 Ionen pro Schuss in Nähe der Schwelle bis zu mehr als 108 bei höherer Bestrahlungsdichte. In Gegenwart eines elektrischen Feldes zeigen die Ionen einen Energiedefizit infolge Kollisionen zwischen Ionen und Neutralleitern. Dieser Energiedefizit erhöht sich mit der Laserintensität und der elektrischen Feldstärke und ist für Analytionen höherer Masse größer als für Matrixionen.
Die Beobachtung, dass die anfängliche Geschwindigkeitsverteilung der durch MALDI erzeugten Ionen von der Masse nahezu unabhängig ist, impliziert, dass die Breite der anfänglichen kinetischen Energieverteilung annähernd der Quadratwurzel der Masse sowie dem Energiedefizit, der aufgrund von Kollisionen mit neutralen Teilchen im Beschleunigungsfeld eintritt, proportional ist. Infolge dessen fällt die Massenauflösung bei hoher Masse bei einer herkömmlichen MALDI mit wachsendem Verhältnis Masse zu Ladung der Ionen ab. Die Anwendung eines hohen Beschleunigungspotentials (25–30 kV) erhöht die Auflösung bei hoher Masse direkt proportional zur Erhöhung des Beschleunigungspotentials.
Die nachteilige Wirkung der anfänglichen kinetischen Energieverteilung kann durch gepulste Ionenextraktion teilweise ausgeschlossen werden. Eine gepulste oder verzögerte Ionenextraktion ist ein Verfahren, durch das eine Zeitverzögerung zwischen der Bildung der Ionen und der Anwendung des beschleunigenden Feldes eingeführt wird. Während der Zeitverzögerung bewegen sich die Ionen gemäß ihren anfänglichen Gechwindigkeiten zu neuen Stellungen. Durch geeignete Auswahl der Verzögerungszeit und elektrischen Felder im Beschleunigungsbereich kann die Flugzeit der Ionen so eingestellt werden, dass die Flugzeit unabhängig von der anfänglichen Geschwindigkeit der ersten Ordnung übergeben wird.
Beträchtliche Verbesserungen der Massenauflösung wurden unter Verwendung einer gepulsten Ionenextraktion in einer MALDI-Ionenquelle erreicht. Forscher berichteten über eine verbesserte Auflösung sowie eine schnelle Fragmentierung kleiner Proteine in J. J. Lenon und R. S. Browon, Proceedings of the 24nd ASMS Conference an Mass Spektrometry and Allied Topics, May 29-June 3, 1994 Chicago IL, S. 501. Auch berichteten Forscher über eine signifikante Erhöhung der Auflösung beim Messen kleinerer synthetischer Polymerer mit einem kompakten MALDI-Instrument mit gepulster Ionenextraktion: Breuker u. a. 13th International Mass Spectrometry Conference, August 29-September 3, 1994, Budapest, Ungarn. Ferner berichteten Forscher über eine beträchtlich verbesserte Massenauflösung bei kleinen Proteinen mit einer gepulsten Ionenextraktions-MALDI-Quelle vgl. Reilly u. a. Rapid Commun., Mass Spectrometry, 8, 194, 865–868; S. M. Colby, T. B. King, J. P. Reilly, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 1994, 865–868.
Ionenreflektoren (auch Ionenspiegel und Reflektronen genannt), werden auch zum Ausgleich der Wirkungen der anfänglichen kinetischen Energieverteilung verwendet. Ein Ionenreflektor wird am Ende des Bereich des freien Flugs angeordnet. Ein Ionenreflektor besteht aus einem oder mehreren homogenen, verzögernden elektrostatischen Feldern. Da die Ionen den Reflektor bezüglich der elektrostatischen Felder durchdringen, werden sie verlangsamt, bis die Geschwindigkeitskomponente in der Richtung des Feldes Null wird. Sodann kehren die Ionen die Richtung um und werden zurück durch den Reflektor beschleunigt. Die Ionen treten aus dem Reflektor mit Energien aus, die mit der Eintrittsenergie identisch sind, jedoch mit Geschwindigkeiten in der entgegengesetzten Richtung. Ionen mit größeren Energien durchdringen den Reflektor tiefer und verbleiben deshalb im Ionenreflektor während einer längeren Zeit. In einem richtig entworfenen Reflektor werden die Potentiale ausgewählt, um die Flugbahnen der Ionen so zu modifizieren, dass Ionen gleicher Masse und Ladung am Detektor zur gleichen Zeit, ungeachtet ihrer anfänglichen Energie, ankommen.
Die Leistung eines Massenspektrometers ist lediglich partiell durch die Massenauflösung bestimmt. Andere wichtige Beiträge sind die Massengenauigkeit, Empfindlichkeit, das Verhältnis von Signal zum Rauschen und der dynamische Bereich. Die jeweilige Wichtigkeit der verschiedenen Faktoren, welche die Gesamtleistung bestimmen, hängt von der Art der Probe und dem Zweck der Analyse ab, jedoch müssen mehrere Parameter spezifiziert und gleichzeitig optimiert werden, um eine befriedigende Leistung für eine besondere Anwendung zu erhalten.
Leider ist bei den Verfahren gemäß dem Stand der Technik die Leistung von TOF-Massenspektrometern zur Analyse vieler wichtiger Verbindungsklassen unzureichend. Diese Unzulänglichkeiten sind besonders bei MALDI offensichtlich. Es gibt mehrere Mechanismen, welche die Leistung der TOF-Massenspektrometrie zusätzlich zum Verlust der mit anfänglichen kinetischen Energieverteilung verbundenen Massenauflösung begrenzen können. Ein Überschuss an erzeugten Matrixionen kann die Sättigung des Detektors verursachen. Infolge einer langen Wiedereinstellungszeit vieler Detektoren hemmen eine Sättigung ernsthaft die richtige Reproduktion des Zeitprofils des eintretenden Ionenstroms, welcher das TOF-Spektrum wesentlich ausmacht.
Es wurde beobachtet, dass Fragmentierungsverfahren bei MALDI-TOF mit drei unterschiedlichen Zeitskalen verlaufen: E. Nodhoff u. a., J. Mass Spectrom., 30 1995, 99–112. Extrem schnelle Fragmentierung kann im wesentlichen während der Zeit des Ionisationsfalls stattfinden. Dieses Verfahren wird als prompte Fragmentierung bezeichnet, und die Fragmentionen geben ein Korrelationsionensignal bei einer kontinuierlichen Ionenextraktions-MALDI-TOF-Messung, d. h., Fragmentionen verhalten sich genau so als ob sie in der Probe vorlägen. Die Fragmentierung kann auch bei einer etwas geringeren Rate während der Beschleunigungsstufe stattfinden (typischerweise mit einer charakteristischen Zeit von weniger als 1 μSek.). Diese Art von Fragmentierung wird als schnelle Fragmentierung bezeichnet. Kollisionen hoher Energie (mehr energetische als thermische Kollisionen) zwischen Ionen und neutralen Teilchen können auch zur schnellen Fragmentierung beitragen. Diese Kollisionen sind besonders in der frühen Stufe der Ionenbeschleunigung häufig, wenn das abgeschmolzene Material eine dichte Federwolke (plume) bildet. Fragment-Ionen aus den schnellen Fragmentierungsverfahren tragen im Gegensatz zu prompten Fragmenten zum nicht-wechselseitigen Rauschen (chemischem Rauschen) bei, da sie im Gegensatz zu den ursprünglichen Probeionen, die auf eine gut definierte kinetische Energie beschleunigt werden, auf einen breiten Bereich kinetischer Energien beschleunigt werden.
Die Fragmentierung von Probeionen kann auch im Bereich des freien Flugs auftreten, der auf einer längeren Zeitskala, die mit der Flugzeit der Ionen vergleichbar ist, auftritt. Dies kann je nach der besonderen Art der Daten, die für den Flugzeit-Massenspektrometer erforderlich ist, erwünscht sein oder auch nicht. In der Regel erniedrigt die Fragmentierung die Intensität des Signals infolge intakter molekularer Ionen. Bei der Gemischanalyse können diese Fragment-Ionen ein signifikantes chemisches Rauschen erzeugen, welches die Erkennung der Signale von Interesse stört. Auch vermindert eine Fragmentierung innerhalb eines Reflektors weiter die Intensität des Signals von Interesse und erhöht ferner das störende Hintergrundsignal.
Wenn diese Fragmentierung in einem Abtriftbereich auftritt, mit Ausnahme der sehr geringen relativen Geschwindigkeit der sich abtrennenden Fragmente, bewegen sich das Ion und neutrale Fragment mit nahezu der gleichen Geschwindigkeit wie die intakten Ionen weiter und kommen am Ende des feldfreien Bereichs zur im wesentlichen gleichen Zeit an, ob eine Fragmentierung stattfand oder auch nicht. Deshalb werden in einem einfachen TOF-Analysator ohne Reflektor weder die Auflösung noch die Empfindlichkeit ernsthaft durch Fragmentierung nach Beschleunigung ernsthaft verringert.
Andererseits ist in einem reflektierenden Analysator die Situation völlig verschieden. Fragment-Ionen haben im wesentlichen die gleiche Geschwindigkeit wie intakte Ionen jedoch haben sie die Masse des neutralen Fragments verloren und besitzen proportional geringere Energie. Infolgedessen dringen die Fragmentionen in einem kürzeren Abstand in das reflektierende Feld ein und kommen früher am Detektor an als die entsprechende intakten Ionen. Durch geeignete Einstellung der Spiegelpotentiale können diese Fragmentionen fokussiert werden, um ein Nachquellenabfall-(PSD-)Spektrum hoher Qualität zu bilden, das zur Bestimmung der molekularen Struktur benutzt werden kann.
Infolgedessen ist es ein Hauptziel vorliegender Erfindung, die Massenauflösung in der Flugzeit-Massenspektrometrie zu verbessern.
Die US-A-5 032 722 beschreibt ein MS-MS Flugzeitmassenspektrometer, wobei ein Raumfokus der Ionenquelle durch Korrektur zweiter Ordnung definiert ist. Wenn die geometrischen und elektrischen Werte der Ionenquelle entsprechend gewählt sind, kann der Raumfokus derart herausgebildet sein, dass er eine sehr gute primäre Massenauflösung gestattet, wenn entsprechende sekundäre Wechselwirkungsverfahren verwendet werden. Die sekundäre Wechselwirkung am Raumfokus kann (a) durch einen fokussierten, gepulsten Laserstrahl oder andere gepulste Wechselwirkungsverfahren, die fokussiert werden können, (b) durch ein Drahtgitter, das aus sehr feinen „Linienkämmen”, die ineinander eingreifen, an die Spannungspulse angelegt werden können, (c) durch eine Kombination von a) und/oder b) mit einem elektrostatisch hohen primären feldlosen Driftweg bewirkt werden. Das MS-MS Flugzeitmassenspektrometer wird mit einem Reflektor betrieben, das eine bewegliche Reflektorendplatte mit einem einstellbaren Potential, das primär Ionen aus dem Spektrum ohne jeden Verlust in der Massenauflösung entfernen kann. Wenn die Reflektorfelder in entsprechender Weise abgeglichen werden und ein Beobachtungsfenster in dem Flugzeitspektrum entsprechend ausgewählt wird, kann ein sekundäres Massenspektrum gemessen werden, das am Raumfokus erzeugt wurde.
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen beansprucht.
Ein beispielhaftes Massenspektrometer, das zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, weist einen Probehalter, ein Mittel zum Ionisieren einer Probe, die auf dem Halter angeordnet ist, um Probenionen zu erzeugen, und ein erstes Element auf, das vom Probenhalter beabstandet angeordnet ist. Das Massenspektrometer kann eine Driftröhre und einen Detektor aufweisen. Der Ionisator ist ein Laser, der einen Energiepuls erzeugt, um die Probe, die auf dem Halter angeordnet ist, zu bestrahlen und dadurch zu ionisieren. Das erste Element kann ein Gitter oder eine elektrostatische Linse ein. Eine Stromquelle ist elektrisch an das erste Element und den Halter angeschlossen. Die Quelle erzeugt ein veränderliches Potential sowohl am ersten Element als auch am Halter, wobei die Potentiale des ersten Elements und des Halters unabhängig voneinander veränderbar sind. Das Potential an dem ersten Element zusammen mit dem Potential an dem Halter definiert ein elektrisches Feld zwischen dem Halter und dem ersten Element. Das Massenspektrometer kann auch eine Schaltung zum Vergleichen der Spannung zwischen dem Halter und dem ersten Element aufweisen.
Das Massenspektrometer kann ein zweites Element zur Erzeugung eines elektrischen Feldes aufweisen, das beabstandet vom ersten Element angeordnet ist, um Probenionen zu beschleunigen. Das zweite Element ist an ein elektrisches Potential anschließbar, das von dem Potential am Halter und am ersten Element unabhängig ist. Das zweite Element kann geerdet sein oder kann mit der Stromversorgung verbunden sein. Das zweite Element kann ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Das Potential an dem zweiten Element zusammen mit dem Potential an dem ersten Element definiert ein elektrisches Feld zwischen den ersten und zweiten Elementen. Das Massenspektrometer kann auch einen Ionenreflektor aufweisen, der vom ersten Element beabstandet angeordnet ist, wobei hierdurch die Energieverteilung der Ionen nach der Beschleunigung kompensiert wird.
Der Massenspektrometer kann eine Energiequelle, einen Schalter für eine ziemlich hohe Spannung, der eine erste Eingabe hoher Spannung, eine zweite Eingabe hoher Spannung, eine Abgabe hoher Spannung, die mit der ersten oder zweiten Eingabe verbindbar ist, sowie eine Auslösungseingabe für den Schalterbetrieb umfassen. Die Abgabe wird von der ersten Eingabe zur zweiten Eingabe für eine zuvor festgelegte Zeit umgeschaltet, wenn ein Auslösungssignal an die Auslösungseingabe angelegt wird. Die erste und zweite Hochspannungs-Eingabe sind elektrisch an eine mindestens 1 kV Stromversorgung angeschlossen, und der Schalter hat eine Einschalt-Anstiegzeit von weniger als 1 μSek.
Der Massenspektrometer kann einen Verzögerungsgenerator umfassen, der auf den Laser-Abgabeimpuls der Energie anspricht, mit einer im Betrieb an die Auslösungseingabe des Schalters angeschlossenen Abgabe, die ein Auslösungssignal erzeugt, um den Hochspannungsschalter in Übereinstimmung mit dem Energieimpuls zu betreiben. Der Laser kann eine Zeitregulierung mittels eines Fotodetektors auslösen, der auf den Laserimpuls anspricht, oder der Laser selbst kann eine Schaltung umfassen, welche ein elektrisches, mit dem Energieimpuls synchronisiertes Signal erzeugt (z. B. ein Pockels-Zellentreiber). Alternativ kann der Verzögerungsgenerator sowohl den Energieimpuls als auch die Auslösungseingabe auslösen.
Der Massenspektrometer muss einen Ionendetektor zum Detektieren von Ionen aufweisen, die durch den Ionisator erzeugt werden. Der Massenspektrometer kann auch einen Führungsdraht zur Begrenzung der Querschnittsfläche des Ionenstrahlenbündels umfassen, so dass ein kleinflächiger Detektor benutzt werden kann. Der Massenspektrometer kann eine Computerschnittstelle und einen Computer zur Steuerung der Energiequellen und des Verzögerungsgenerators sowie einen Computeralgorithmus zur Berechnung der optimalen Potentiale und Zeitverzögerung für eine besondere Anwendung umfassen.
Die beanspruchte vorliegende Erfindung ist auch für ein Verfahren der Bestimmung des Verhältnisses Masse zu Ladung von Molekülen in einer Probe durch Flugzeit-Massenspektrometrie kennzeichnend. Das Verfahren umfasst das Anlegen eines ersten Potentials an einen Probehalter. Ein zweites Potential wird an ein von dem Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt. Das Potential am ersten Element ist unabhängig vom Potential am Probehalter einstellbar.
Eine Probe, die in Nähe des Halters angeordnet ist, wird zur Erzeugung von Probeionen ionisiert. Das Verfahren gemäss der Erfindung kann das Ionisieren der Probe mit einem Laser oder einer Lichtquelle unter Erzeugung eines Energieimpulses umfassen. Zumindest eines des ersten oder zweiten Potentials wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach Eintritt der Ionisation verändert, um zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zu beschreiben, das die Ionen für eine Flugzeitmessung extrahiert. Die optimale Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Feldes (das Extraktionsfeld) hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, einschließlich vom Abstand zwischen der Probenoberfläche und dem ersten Element, der Größenordnung des zweiten elektrischen Feldes, des Verhältnisses von Masse zu Ladung der Probeionen, für die eine optimale Auflösung erforderlich ist, und der kinetischen Anfangsenergie des Ions. Das Verfahren kann auch einen Computer-Algorithmus zur Berechnung der Optimalwerte der Zeitverzögerung und elektrischen Felder sowie die Anwendung eines Computers und einer Computer-Schaltstelle zur automatischen Einstellung der Abgaben der Energiequellen und des Verzögerungsgenerators umfassen.
Das Verfahren umfasst auch die Veränderung des Potentials am ersten Element unabhängig vom Potential an dem Probehalter. Das Potential am ersten Element kann unabhängig vom Potential am Probehalter verändert werden, um ein elektrisches Bremsfeld zur räumlichen Trennung von Ionen durch das Verhältnis Masse zu Ladung vor der Ionenextraktion einzurichten. Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein zweites vom ersten Element beabstandetes Element umfassen, das, zusammen mit dem Potential am ersten Element, ein elektrisches Feld zwischen dem ersten und dem zweiten Element zur Beschleunigung der Ionen umschreibt. Das Verfahren kann auch das Analysieren einer Probe umfassen, welche mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Verbindung von biologischem Interesse umfasst, welche aus DNA, Polynukleotiden und deren synthetische Varianten besteht, oder mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Verbindung von biologischem Interesse, welche aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlenhydraten und Glycoproteinen besteht. Die Probe kann eine Matrixsubstanz umfassen, die bei der Wellenlänge des Laserimpulses absorbiert, um die Desorption und Ionisierung von einem oder mehreren Molekülen zu erleichtern.
Die Anwendung dieses Verfahrens verbessert die Auflösung von Flugzeit-Massenspektrometern durch Herabsetzung der Wirkung der anfänglichen zeitlichen und energetischen Verteilungen bei der Flugzeit der Probeionen. Das Verfahren umfasst auch die Stufe der Erregung eines vom ersten Element oder dem zweiten Element beabstandeten Ionenreflektors. Die Anwendung des Reflektors führt zu einer höheren Korrektur der Reihenfolge für die Energiestreuung in dem Ionenstrahl, und wenn er in dieses Verfahren einbezogen ist, stellt er eine noch höhere Massenauflösung bereit.
Vorliegende Erfindung ermöglicht, wie beansprucht, auch ein Verfahren zur Verbesserung der Auflösung bei der Laserdesorptions/ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie durch Verringerung der Anzahl von Kollisionen hoher Energie während der Ionenextraktion. An einem Probehalter, der ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfasst, wird ein Potential angelegt. Ein Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt. Eine in Nähe des Halters angeordnete Probe wird mit einem Laser ionisiert, der einen Energieimpuls unter Bildung einer Ionenwolke erzeugt. Zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation wird entweder am Probenhalter oder ersten Element ein zweites Potential angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter oder ersten Element zwischen der Probe und dem ersten Element ein zweites elektrisches Feld umschreibt. Das zweite elektrische Feld extrahiert die Ionen nach der zuvor festgelegten Zeit. Die zuvor festgelegte Zeit ist lang genug, um zu ermöglichen, dass die Wolke von Ionen und neutralen Teilchen sich ausreichend ausdehnt, um die Anzahl von Kollisionen hoher Energie wesentlich zu verringern, wenn das Extraktionsfeld aktiviert ist. Die zuvor festgelegte Zeit kann größer als die Zeit sein, welche die mittlere freie Bahn der Ionen in der Federwolke (plume) braucht, um größer als die Größe des Beschleunigungsbereichs zu werden.
Das Verfahren kann auch die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das zusammen mit dem Potential am ersten Element zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Beschleunigung der Ionen umschreibt.
Parameter, wie z. B. die Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisierungsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Feldes werden so ausgewählt, dass die Verzögerungszeit lang genug ist, um zu ermöglichen, dass die Federwolke von in Reaktion auf das Anlegen des Laserimpulses gebildeten neutralen Teilchen und Ionen ausreichend in das Vakuum expandieren, so dass weitere Kollisionen zwischen Ionen und neutralen Teilchen unwahrscheinlich sind. Es werden auch Parameter ausgewählt, um zu gewährleisten, dass Probeionen einer ausgewählten Masse mit optimaler Massenauflösung festgestellt werden. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerschaltstelle und eines Computeralgorithmus bestimmt werden.
Vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zur Verminderung des Matrixionensignals in einer Matrix-unterstützten Laserdesorptions-/ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie. Dieses Verfahren umfasst die Einbeziehung eines Matrixmoleküls in eine Probe. Ein erstes Potential wird an den Probehalter angelegt. Ein Potential wird an das von dem Probehalter beabstandete erste Element angelegt, um ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zu schaffen. Eine in Nachbarschaft zum Halter angeordnete Probe wird mit einem Laser, der einen Energieimpuls erzeugt, bestrahlt. Die Matrix absorbiert die Energie und erleichtert die Desorption und Ionisation der Probe und der Matrix. Das erste elektrische Feld ist bremsend und beschleunigt somit die Ionen zur Probenoberfläche.
Ein zweites Potential wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach dem Energieimpuls an den Probehalter angelegt, das ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zur Beschleunigung von Ionen weg von der Probenoberfläche erzeugt. Das erste elektrische Feld wird ausgewählt, um die von der Probe erzeugten Ionen zu bremsen. Dieses Feld verlangsamt und richtet die Ionen zurück zur Probenoberfläche.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Beschleunigung der Ionen erzeugt. Parameter wie die Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und die zeitliche Verzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so ausgewählt, dass Matrixionen mit einer Masse, die geringer als eine ausgewählte Masse ist, unterdrückt werden, während Probeionen mit einer Masse, die größer als eine ausgewählte Masse ist, mit optimaler Massenauflösung nachgewiesen werden. Die Parameter können manuell oder mit Hilfe eines Computers, einer Computerschnittstelle und einem Computeralgorithmus bestimmt werden.
Vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zum Verringern des chemischen Hintergrundrauschens in der Matrix-unterstützten Laserdesorptions-/ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie dadurch, dass es Zeit für den Abschluss schneller Fragmentierungsverfahren vor der Ionenextraktion erlaubt. In eine, ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfassende Probe wird eine Matrixsubstanz eingearbeitet, so dass die Matrixsubstanz eine intakte Desorption und Ionisierung des einen oder der mehreren Moleküle erleichtert. An den Probehalter wird ein Potential angelegt. Ein Potential wird an das vom Probehalter beabstandete erste Element angelegt, welches zusammen mit dem Potential des Probehalters ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt.
Eine in Nähe des Halters angeordnete Probe wird mit einem Laser ionisiert, welcher einen Energieimpuls erzeugt, der durch das Matrixmolekül absorbiert wird. An den Probehalter wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation ein zweites Potential angelegt, das zusammen mit dem Potential des ersten Elements ein zweites elektrisches Feld zwischen der Probe und dem ersten Element umschreibt, um die Ionen zu extrahieren. Die zuvor festgelegte Zeit ist lang genug, um im wesentlichen den Abschluss sämtlicher schnellen Fragmentationsverfahren zu ermöglichen.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein zweites, vom ersten Element beabstandetes Element umfassen, welches zusammen mit dem Potential des ersten Elements zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Beschleunigung der Ionen umschreibt.
Parameter wie Größe und Richtung des ersten und des zweiten elektrischen Felds, und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so gewählt, dass die Zeitverzögerung lang genug ist, um den Abschluss schneller Fragmentationsverfahren zu ermöglichen. Auch werden die Parameter so gewählt, dass die ausgewählte Masse mit optimaler Massenauflösung nachgewiesen wird. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, eines Computerinterface oder eines Computeralgorithmus bestimmt werden.
Vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zur Verbesserung der Auflösung in einer Langimpuls-Laserdesorption-/ionisations-Flugzeit-Masenspektrometrie. Ein erstes Potential wird an einen Probehalter angelegt. Ein zweites Potential wird ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element eingelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt. Eine in Nähe des Halters angeordnete Probe wird mit einem Laser mit langer Impulslänge ionisiert. Die Zeitdauer des Energieimpulses kann größer als 50 ns sein.
Das Potential am ersten Element bezüglich des Probehalters kann zur Messung positiver Ionen positiver, und zur Messung negativer Ionen negativer sein, um die räumliche Streuung und Geschwindigkeitsstreuung von Ionen vor der Ionenextraktion zu verringern. Zumindest eines der ersten oder zweiten Potentiale wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation variiert, um zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein zweites unterschiedliches elektrisches Feld zu umschreiben, welches Ionen für eine Flugzeit-Messung extrahiert. Die zuvor festgelegte Zeit kann größer als die Dauer des Laserimpulses sein.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an das vom ersten Element beabstandete zweite Element umfassen, das zusammen mit dem Potential des ersten Elements zwischen dem ersten und dem zweiten Element ein elektrisches Feld zur Ionenbeschleunigung umschreibt.
Vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zum Erzeugen von die Sequenz definierenden Fragment-Ionen von Biomolekülen unter Verwendung einer Matrixunterstützten Laserdesorptions-/ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst die Einarbeitung eines Matrixmoleküls in eine Probe, die ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfasst, um die Desorption, Ionisation und Anregung des Moleküls zu erleichtern. An die Probe wird ein Potential angelegt. Ein Potential wird an ein von der Probe beabstandetes erstes Element angelegt, welches zusammen mit dem Potential der Probe zwischen der Probe und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt.
Die Moleküle werden mit einem Laser, welcher einen Energieimpuls erzeugt, der der Absorptionsenergie der Matrix im wesentlichen entspricht, ionisiert. An die Probe wird bei einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation ein zweites Potential angelegt, das zusammen mit dem Potential am ersten Element ein zweites elektrisches Feld zwischen der Probe und dem ersten Element umschreibt. Das zweite elektrische Feld extrahiert die Ionen nach der zuvor festgelegten Zeit. Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, welches zusammen mit dem Potential am ersten Element ein elektrisches Feld zwischen dem ersten und zweiten Element zur Ionenbeschleunigung beschreibt.
Parameter wie Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so gewählt, dass die Zeitverzögerung lang genug ist, um den Abschluss des schnellen Fragmentationsverfahrens zu ermöglichen. Diese Parameter werden auch gewählt, um die ausgewählte Masse mit optimaler Massenauflösung nachzuweisen. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerinterface und eines Computeralgorithmus bestimmt werden.
Das Verfahren kann die Stufe des Nachweises des Verhältnisses Masse zu Ladung der speziellen erzeugten Sequenzfragmente und die Stufe der Identifizierung einer Sequenz mindestens einer Art von Biomolekül in der Probe umfassen, wobei das Biomolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetischen Varianten besteht, oder zumindest einer Verbindung von biologischem Interesse, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlenhydraten, Glycokonjugaten und Glycoproteinen besteht.
Das Verfahren kann auch die Stufe der Ausbeuteerhöhung von durch Erhöhung des Energietransfers zum Biomolekül während der Ionisation erzeugten Fragmenten umfassen. Der Energietransfer kann erhöht werden, indem man eine Laserwellenlänge auswählt, bei der das Biomolekül absorbiert. Die Ausbeute an Fragment-Ionen kann erhöht werden, indem man in die Matrix ein Additiv einarbeitet. Das Additiv kann bei der Wellenlänge des Lasers absorbieren oder auch nicht, jedoch ist es als Matrix selbst nicht wirksam. Das Additiv kann den Energietransfer von der Matrix zur Probe erleichtern.
Die Matrix kann ausgewählt werden, um die Fragmentierung von Biomolekülen spezifisch zu fördern. Das Biomolekül kann ein Oligonucleotid sein, und die Matrix kann mindestens eine der Verbindungen 2,5-Dihydroxybenzoesäure und Picolinsäure sein. Das Biomolekül kann auch ein Polynucleotid sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorhergehenden und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der beanspruchten Erfindung werden aus folgender eingehenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und den Beispielen, welche nicht notwendigerweise Ausführungsformen sind, offensichtlich, wie in den anliegenden Abbildungen veranschaulicht. Die Abbildungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu, vielmehr liegt die Betonung auf der Veranschaulichung der Prinzipien vorliegender Erfindung. Die Spektrometer, wie gezeigt, sind für die Ausführung der beanspruchten Erfindung einsetzbar.
1 ist ein schematisches Diagramm eines Flugzeit-Massenspektrometers mit einer gepulsten zweistufigen Ionenbeschleunigungs-Laserdesorption/ionisation gemäß dem Stand der Technik.
2 ist ein schematisches Diagramm eines Flugzeit-Massenspektrometers mit einer Laserdesorption/ionisation.
3 ist eine Ausführungsform eines Flugzeit-Massenspektrometers mit Laserdesorption/ionisierung.
4a bis b veranschaulicht Verbesserungen der Massenauflösung in Oligonucleotiden mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. 4a ist ein Spektrum einer DNA-22 mer-Probe, aufgezeichnet von einem herkömmlichen MALDI-TOF-Massenspektrometer.
4b ist ein Spektrum einer DNA-22 mer-Probe, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer.
5 ist ein schematisches Diagramm eines Flugzeit-Massenspektrometers mit einer Laser/desorption, welches einen einstufigen Ionenreflektor umfasst, und veranschaulicht bestimmte Merkmale vorliegender Erfindung.
6a bis b veranschaulicht eine Auflösung von mehr als 7.000 Massenauflösung für eine RNA-12 mer-Probe bei m/z 3839 und etwa 5.500 Massenauflösung für eine RNA-16 mer-Probe bei m/z 5154, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer des in 5 gezeigten Typs.
7a bis c veranschaulicht eine Verminderung und Ausscheidung des Matrixsignals mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer.
8a bis c veranschaulicht eine induzierte Fragmentierung zur strukturellen Charakterisierung von Olignucleotiden in der MALDI-TOF-Massenspektrometrie, einschließlich die Nomenklatur der Fragment-Ionentypen.
9a bis c veranschaulicht die Fähigkeit, mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer sehr komplizierte Oligonucleotidgemische zu analysieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1 ist ein schematisches Diagramm eines gepulsten Flugzeit-Massenspektrometers mit einer zweistufigen Ionenbeschleunigungs-Laserdesorption/ionisation. Eine Hochspannungs-Stromversorgung 11 erzeugt an einem Ausgang 13 eine variable Hochspannung. Eine zweite Hochspannungs-Stromversorgung 10 erzeugt an einem Ausgang 12 eine variable Hochspannung, der auf den Ausgang 13 der Hochspannungs-Stromversorgung 11 bezogen ist. Die Stromversorgungsausgänge 12 und 13 sind elektrisch an die Eingänge 14 und 15 eines Impulsgenerators 16 gekoppelt. Eine Steuerschaltung 18 zur Erzeugung eines Auslösesignals zur Steuerung des Ausgangs des Impulsgenerators 16 ist elektrisch oder optisch an den Auslöseeingang 20 des Impulsgenerators 16 angeschlossen. Der Impulsgenerator 16 durchläuft den Hochspannungsausgang der Stromversorgung 11 zu einem Impulsgenerator-Ausgang 22, wenn die Auslöseeingabe inaktiv ist. Der Impulsgenerator erzeugt einen Hochspannungsimpuls, dessen Amplitude durch die Hochspannungsabgabe der Hochspannungs-Stromversorgung 10 am Impulsgenerator-Ausgang 22 für eine zuvor festgelegte Zeit, wenn die Auslöseeingabe aktiv ist. Der Impulsgenerator-Ausgang 22 ist elektrisch an einen Halter 24 angekoppelt. Eine zu untersuchende Probe 26 wird auf eine glatte Oberfläche 28 des Halters 24 gelegt. Der Halter 24 ist ein elektrisch leitfähiger Körper, auf dem typischerweise die Probe 26 liegt. Ein Laser 30 zur Bestrahlung der Probe 26 mit einem Energieimpuls und einem auf die Probe 26 gerichteten Ausgang 32 ist angebracht. Als Ergebnis eines gepulsten Laserstrahls, der auf der Oberfläche der Probe 26 auftrifft, werden Moleküle in der Probe 26 ionisiert und in die Gasphase desorbiert. Ein bei der Wellenlänge des Lasers 30 hoch absorbierendes Matrixmaterial kann der Probe zugesetzt werden, um die Desorption und Ionisation der Probe 26 zu erleichtern. Andere Mittel, die bewirken, dass das Probematerial ionisiert wird, wie z. B. Plasmadesorption, Teilchenbombar sw., können auch angewendet werden. Der Ausgang der Stromversorgung 13 ist auch an ein erstes, vom Halter 24 beabstandetes Element 35 gekoppelt. Das erste Element 34 kann ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Das Potential am Halter 24 und am ersten Element 34 umschreibt ein elektrisches Feld zwischen dem Halter 24 und dem ersten Element 34. Ein zweites, vom ersten Element 34 beabstandetes Element 36 ist elektrisch an ein Potential, welches geerdet sein kann, angeschlossen. Das zweite Element kann auch ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Ein vom zweiten Element 36 beabstandeter Detektor 38 erfasst das ionisierte Probenmaterial als Funktion der Zeit.
Im Betrieb ist der Auslöseeingang 20 vor und während der Zeit inaktiv, in der der Laser 30 die Probe 26 mit einem Energiepuls bestrahlt. Das Potential am Halter 24 und am ersten Element 34 ist jeweils dem Stromversorgungspotential gleich. Zu einer zuvor festgelegten Zeit nach dem Laserimpuls wird die Auslöseeingabe 20 aktiv, und der Impulsgenerator 16 erzeugt einen Hochspannungsimpuls mit einer zuvor festgelegten Amplitude am Halter. Während des Impulses überschreitet das Potential am Halter 24 das Potential am ersten Element 34 in entweder positiver oder negativer Richtung, in Abhängigkeit davon, ob positive oder negative Ionen zu untersuchen sind. Das elektrische Feld zwischen dem Halter 24 und dem ersten Element 34 wird von Null verschieden, und die Ionen werden in Richtung des zweiten Elements 36 und Detektors 38 beschleunigt.
Somit werden mit dem gepulsten Ionen-LD-TOF-Massenspektrometer gemäß dem Stand der Technik Probe-Ionen in einem Bereich erzeugt, indem das gleiche Potential sowohl an den Halter 24 als auch das erste Element 34 vor der Ionenextraktion angelegt ist. Ionen werden aus dem feldfreien Bereich unter Anwendung eines Impulses einer zuvor festgelegten Amplitude bei einer vorbestimmten Zeitverzögerung nach der anfänglichen Ionenbildung extrahiert. Anfängliche kinetische Energieeffekte können durch geeignete Wahl der zuvor festgelegten Impulsampitude und Zeitverzögerung verringert werden.
2 ist ein schematisches Diagramm einer Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometers. Eine erste Hochspannungs-Stromversorgung 50 erzeugt eine erste variable Hochspannung an einem ersten Ausgang 52. Eine zweite Hochspannungs-Stromversorgung 54 erzeugt an einen zweiten Ausgang 56 eine zweite variable Hochspannung. Die erste und die zweite Stromversorgung können unabhängig sein; sie können manuell gesteuert sein oder programmierbare Stromversorgungen oder eine einzige programmierbare Stromversorgung mit Multiabgabe sein.
Der erste und zweite Stromversorgungsausgang ist elektrisch an einen ersten Eingang 58 und zweiten Eingang 60 eines schnellen Hochspannungsschalters 62 angeschlossen. Ein Ausgang 64 des Schalters ist zwischen den Eingängen des ersten Schalters 58 und zweiten Schalters 60 anschließbar. Eine Steuerschaltung 66 zum Erzeugen eines Steuersignals zum Schalterbetrieb ist elektrisch an einen Auslöseeingang 68 des Schalters angeschlossen. Der Ausgang des Schalters 64 ist elektrisch an einen Halter 70 angekoppelt.
Der Halter 70 ist ein elektrisch leitfähiger Körper auf dem die Probe liegt. Eine zu untersuchende Probe 72 ist auf einer glatten Oberfläche 74 des Halters 70 angeordnet. Eine (nicht gezeigte) Isolierschicht kann zwischen der Probe und dem Halter angeordnet werden. Bei einer alternativen Ausführungsform liegt die Probe bezüglich eines durch den Halter erzeugten elektrischen Feldes orthogonal.
Ein Laser 76 zum Bestrahlen der Probe 27 mit einem Energieimpuls ist mit einem zur Probe 72 gerichteten Abgabe 78 angeordnet. Die Probe 72 wird als Ergebnis eines gepulsten Laserstrahls 80, welcher auf die Oberfläche der Probe 72 auftrifft, in die Gasphase ionisiert und desorbiert. Ein bei der Wellenlänge des Lasers 76 hoch absorbierendes Matrixmaterial kann der Probe 72 zugegeben werden, um die Desorption und Ionisation der Probe 72 zu erleichtern. Es können auch andere Mittel, welche bewirken, dass das Probematerial ionisiert und desorbiert wird, wie z. B. Plasmadesorption, Teilchenbombardement usw., angewendet werden.
Eine dritte Stromversorgung 82 ist mit einem ersten, vom Halter 70 beabstandeten Element 84 elektrisch verbunden und erzeugt eine dritte Hochspannung. Das erste Element 84 kann ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Das Potential am Halter 70 und am ersten Element 84 umschreibt ein elektrisches Feld zwischen dem Halter 70 und dem ersten Element 84. Ein vom ersten Element 84 beabstandetes zweites Element 86 ist mit einem Potential verbunden, das geerdet sein kann. Das zweite Element 86 kann auch ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Ein vom zweiten Element 88 beabstandeter Detektor 88 erfasst ionisiertes Probematerial als Funktion der Zeit.
Im Betrieb ist die Auslöseeingabe 68 vor und während der Zeit, wenn der Laser 76 die Probe 72 mit einem Energieimpuls bestrahlt, inaktiv. Das Potential am Halter 70 ist der durch die erste Hochspannungs-Stromversorgung 50 erzeugten ersten Hochspannung gleich. Das Potential am ersten Element ist der durch die dritte Hochspannungs-Stromversorgung 82 erzeugten dritten Hochspannung gleich. Wenn die erste Hochspannung von der dritten Hochspannung abweicht, besteht ein von Null abweichendes statistisches elektrisches Feld zwischen dem Halter 70 und dem ersten Element 84.
Zu einer zuvor festgelegten Zeit nach dem Laserimpuls bewirkt die Steuerschaltung 66, dass die Auslöseeingabe 68 aktiv wird. Der Schalter 62 unterbricht schnell die erste Hochspannungs-Stromversorgung 50 vom Halter 70 und schließt schnell die zweite Hochspannungs-Stromversorgung 54 für eine zuvor festgelegte Zeit am Halter 70 an. Das Potential am Halter 70 verändert sich von der ersten Hochspannung zur zweiten Hochspannung. Die zweite Hochspannung übertrifft die erste und dritte Hochspannung entweder in einer positiven oder negativen Richtung, in Abhängigkeit davon, ob positive oder negative Ionen untersucht werden. Aufgrund des höheren Potentials am Halter 70 entsteht ein elektrisches Feld zwischen dem Halter 70 und dem ersten Element 84, welches die Ionen extrahiert und in Richtung des zweiten Elements 86 und des Detektors 88 beschleunigt. Somit kann bei einem Flugzeit-Massenspektrometer mit Laserdesorptions/ionisation ein von Null abweichendes, nicht-periodisches elektrisches Feld im Bereich zwischen dem Halter 70 und dem ersten Element 84 vor der Ionenextraktion vorliegen, das variiert werden kann. Der beanspruchte erfindungsgemäße Massenspektrometer ermöglicht infolgedessen die Kontrolle über das durch vor und während der Ionenextraktion erzeugte Ionen aufgebauten elektrischen Feldes.
3 zeigt einen Flugzeit-Massenspektrometer mit Laserdesorption. Dieses Beispiel benutzt drei unabhängige Stromversorgungen und einen schnellen Hochspannungsschalter, zur unabhängigen Steuerung des Potentials an einem Probehalter und einem ersten Element vor und während der Ionenextraktion.
Eine erste Stromversorgung 100 ist an eine erste Eingabe 102 eines schnellen Hochspannungsschalters 104 elektrisch angeschlossen. Der Schalter kann ein von der Firma Behlke hergestellter Schalter HtS 300-02 und von Eurotec Inc., Morganville, NJ, USA, mit einer Einschaltverzögerung von annähernd 150 ns, einer Anlaufzeit von annähernd 20 ns und einer Einschaltzeit von annähernd 10 Mikrosekunden sein. Eine zweite Stromversorgung 106 ist mit einem zweiten Eingang 108 des Schalters 104 elektrisch verbunden. Ein Ausgang 110 des Schalters 104 ist entweder am ersten Eingang 102 oder am zweiten Eingang 108 anschließbar, jedoch ist er normalerweise in Abwesenheit eines Auslösesignals mit dem ersten Eingang 102 verbunden. Eine Auslöseabgabe 112 bewirkt, dass der Schalter 104 die erste Stromversorgung 100 vom Schalterausgang 110 unterbricht und die zweite Stromversorgung 106 mit dem Schalterausgang 110 während einer zuvor festgelegten Zeit verbindet. Der Ausgang des Schalters 110 ist an den Probehalter 114 elektrisch angeschlossen. Eine zu untersuchende Probe 116 wird auf eine glatte Metalloberfläche 118 des Halters so gelegt, dass sie an den Halter 114 elektrisch angekoppelt ist. Ein bei der Wellenlänge eines zur Ionisation verwendeten Lasers 120 hoch absorbierendes Matrixmaterial kann der Probe 116 zugegeben werden, um die Desorption und Ionisation der Probe 116 zu erleichtern.
Ein Laser 120 zur Bestrahlung der Probe mit einem Energieimpuls ist mit einem auf die Probe 116 gerichteten Ausgang 122 angeordnet. Der Laserimpuls wird durch einen Fotodetektor 124 zur Erzeugung eines synchron mit dem Energieimpuls zeitlich abgestimmten elektrischen Signals erfasst. Ein Verzögerungsgenerator 126 hat einen Eingang 128, der auf das synchron abgestimmte Signal reagiert, und einen mit der Auslöseeingabe des Schalters 112 elektrisch verbundenen Ausgang 130. Der Verzögerungsgenerator 120 erzeugt ein, um eine bezüglich des synchron abgestimmten Signals zuvor festgelegte Zeit verzögertes Auslösesignal. Somit unterbricht der Schalter 104 in Übereinstimmung mit dem Energieimpuls die erste Stromversorgung 100 vom Schalterausgang 110 und verbindet die zweite Stromversorgung 106 mit dem Schalterausgang 110 eine zuvor festgelegte Zeit lang.
Eine dritte Stromversorgung 130, welche eine dritte Hochspannung erzeugt, ist an einem ersten, vom Halter 114 beabstandeten Element 132 elektrisch angeschlossen. Das erste Element 132 kann ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Das Potential am Halter 114 und am ersten Element 132 umschreibt zwischen dem Halter 114 und dem ersten Element 132 ein elektrisches Feld. Ein zweites, vom ersten Element beabstandetes Element 134 ist mit einem Potential, das geerdet sein kann, verbunden. Das zweite Element kann auch ein Gitter oder eine elektrostatische Linse sein. Ein vom zweiten Element 134 beabstandeter Detektor 136, wie z. B. ein Kanalplattendetektor, erkennt das ionisierte Probematerial als Funktion der Zeit. Es wird darauf hingewiesen, dass es das relative Potential und nicht ein spezielles Potential des Halters 114 bezüglich des ersten und zweiten Elements ist, was für den Betrieb des Massenspektrometers wichtig ist.
Eine Vergleichsschaltung 138 misst und vergleicht die Spannung an der ersten Stromversorgung 100 und der dritten Stromversorgung 130 und gibt den Unterschied zwischen der ersten und dritten Spannung an. Die Differenzspannung stellt die elektrische Feldstärke zwischen dem Halter 114 und dem ersten Element 132 vor der Ionenextraktion dar. Im Betrieb wird der Halter 114, bevor der Laser 120 die Probe 116 bestrahlt, an die erste Hochspannungs-Stromversorgung 100 durch den Schalter elektrisch angeschlossen, und die dritte Hochspannungs-Stromversorgung 130 ist am ersten Element 132 elektrisch angeschlossen. Somit ist, bevor eine Ionisation eintritt, ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Halter 114 und dem ersten Element 132 vorhanden. Dieses elektrische Feld wird durch die Vergleichsschaltung 138 angezeigt und ist durch Veränderung der ersten und dritten Hochspannung einstellbar.
Zur Bewirkung der Messung des Verhältnisses Masse zu Ladung bestrahlt der Laser 120 die Probe 116 mit einem Energieimpuls. Der Laser 120 erzeugt eine elektrisches Signal, das synchron auf den Energieimpuls abgestimmt ist. Der Verzögerungsgenerator 126 reagiert auf das Signal. Zu einer zuvor festgelegten Zeit nach dem Signal erzeugt der Verzögerungsgenerator 126 ein Auslösesignal. Der schnelle Hochspannungsschalter 104 reagiert auf das Auslösesignal und bewirkt, dass der Schalter 104 die erste Stromversorgung 100 unterbricht und die zweite Stromversorgung 106 schnell mit dem Schalterausgang 110 für eine zuvor festgelegte Zeit verbindet. Während dieser festgelegten Zeit verändert sich das Potential am Halter 114 oder dem ersten Element 132 in seiner Größe, unter Bildung eines elektrischen Feldes, welches bewirkt, dass die Ionen in Richtung des zweiten Elements 134 und des Detektors 136 beschleunigt werden.
Vorliegende Erfindung, wie beansprucht, ist auch für ein Verfahren der Bestimmung des Verhältnisses Masse zu Ladung von Molekülen in einer Probe bezeichnend, bei dem ein Flugzeit-Massenspektrometer mit Laserdesorption/ionisation angewandt wird. Das Verfahren umfasst das Anlegen eines ersten Potentials an einem Probehalter, auf dem in Nähe des Probenhalters eine Probe angeordnet ist, die ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfasst. An das vom Probehalter beabstandete erste Element wird ein zweites Potential angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt. Das Potential am ersten Element ist vom Potential am Probehalter unabhängig variabel. Die Probe wird unter Erzeugung von Probeionen ionisiert. Das Verfahren umfasst das Ionisieren der Probe mit einem einen Energieimpuls erzeugenden Laser. Mindestens eines der ersten oder zweiten Potentiale wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach Eintritt der Ionisation variiert, um ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zu umschreiben, das die Ionen für eine Flugzeitmessung extrahiert.
Die optimale Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Feldes hängt von einer Anzahl von Parametern ab, einschließlich dem Abstand zwischen der Probeoberfläche und dem ersten Element, der Größe des zweiten elektrischen Feldes, dem Verhältnis Masse zu Ladung des Probeions, für das eine optimale Auflösung erforderlich ist, und der anfänglichen kinetischen Energie des Ions. Wenn das erste elektrische Feld im Vergleich zum zweiten gering ist, ist die Zeitverzögerung, welche die Veränderung der gesamten Flugzeit mit der Anfangsgeschwindigkeit auf ein Minimun herabsetzt, annähernd gegeben durch Δ = 144,5 da(mVa)½[1/w + (Vo/Va)/½] (1)worin die Zeit in Nanosekunden, der Abstand d_a zwischen der Probe und dem ersten Element in Millimeter, die Masse m in Daltons, die Potentialdifferenz V_a in Volt, und die anfängliche kinetische Energie der Ionen der Masse, m, V_o in Elektronenvolt angegeben sind. Der dimensionslose Parameter w hängt von der Geometrie des TOF-Analysators ab. Die geometrischen Parameter des TOF-Analysators müssen so ausgewählt werden, dass w größer als eine Einheit ist. In dem Fall, wo der Flugzeit-Analysator lediglich aus der Probenplatte, einem ersten Element, einem feldfreien Driftraum und einem Detektor besteht, ist der Wert von w gegeben durch w = d/da – 1 (2)worin d die Länge des feldfreien Bereichs zwischen dem ersten Element und dem Detektor ist.
Dieses Verfahren verbessert die Auflösung von Flugzeit-Massenspektrometern durch Verringerung der Wirkung der anfänglichen zeitlichen Verteilung und Energieverteilung bei der Flugzeit der Probeionen. Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an das vom ersten Element beabstandete zweite Element umfassen, welches, zusammen mit dem Potential am ersten Element, zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Beschleunigung der Ionen umschreibt. In diesem Fall ist die Zeitverschiebung auch durch die obige Gleichung (1) gegeben, jedoch ist der geometrische Parameter w durch die Gleichung W = (χ/1 + χ)3/2{d/2da) – (do/da)(1 + x)] + χ(do/da) – 1 (3) gegeben,
worin χ = V_a/V, wobei V die Potentialdifferenz zwischen dem ersten und zweiten Element, und d₀ der Abstand zwischen dem ersten und zweiten Element sind. Für die Fälle, bei denen die anfängliche zeitliche Verteilung von Probeionen relativ breit ist, beispielsweise als Ergebnis der Anwendung eines verhältnismäßig langen Laserimpulses, ist es notwendig, dass die Zeitverzögerung länger als die gesamte Ionisationszeit ist. Bei einer gegebenen Masse kann dies erreicht werden, indem man den Wert von V_a vermindert. Somit können für gegebene anfängliche Zeit- und Energieverteilungen für ein Ion eines speziellen Verhältnisses Masse zu Ladung und für eine gegebene Geometrie des TOF-Analysators die Größe des zweiten elektrischen Felds und die Zeitdifferenz zwischen dem Anlegen des Laserimpulses an die Probe und dem Anlegen des zweiten elektrischen Feldes für eine optimale Massenauflösung bestimmt werden.
Das erste elektrische Feld ist verzögernd und beschleunigt somit Ionen in Richtung der Probenoberfläche. Die Größe dieses Feldes kann frei gewählt werden. Ein annähernd optimaler Wert für das erste elektrische Feld E₁ ist gegeben durch E1 = 5mvo/Δt (4)worin m die kleinste Masse von Interesse in Daltons, vo die am meisten wahrscheinliche anfängliche Geschwindigkeit in m/Sek., und Δt die Verzögerungszeit in Nanosekunden zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten Felds bedeuten. Bei dieser Größe des ersten, in Verzögerungsrichtung angelegten elektrischen Felds werden zur Zeit des Anlegens des zweiten elektrischen Felds Ionen der ausgewählten Masse mit einer Geschwindigkeit, welche der Hälfte der am wahrscheinlichsten Geschwindigkeit gleich ist, abgestoppt, und Ionen mit einer Geschwindigkeit von weniger als einem Viertel der wahrscheinlichsten Geschwindigkeit werden zur Probenoberfläche zurückgeführt und neutralisiert. Bei MALDI hat lediglich eine sehr kleine Fraktion der Ionen Geschwindigkeiten von weniger als einem Viertel der wahrscheinlichsten Geschwindigkeit, weshalb die Ionen der ausgewählten und höheren Massen extrahiert und mit hoher Wirksamkeit erkannt werden. Andererseits werden Ionen geringerer Masse ganz oder teilweise unterdrückt. Insbesondere werden Ionen mit Massen von weniger als etwa einem Viertel der ausgewählten Masse fast vollständig unterdrückt, da sie zur Probe zurückkehren und vor Anlegen des zweiten elektrischen Feldes neutralisiert werden. Das Verfahren kann auch einen Computeralgorithmus zur Berechnung der Optimalwerte für die elektrischen Felder und die Zeitverzögerung umfassen, und die Anwendung eines Computers und einer Computerschaltstelle zur automatischen Einstellung der Abgaben der Stromquellen und des Verzögerungsgenerators einschließen.
Das Verfahren kann das Messen einer Probe umfassen, welche mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Verbindung von biologischem Interesse, welche aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetische Varianten besteht, oder ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlehydraten, Glycokonkugaten und Glycoproteinen besteht, umfassen. Die Probe kann eine bei der Wellenlänge des Laserimpulses absorbierende Matrixsubstanz umfassen, um die Desorption und Ionisation eines oder mehrere Moleküle zu erleichtern.
Die am meisten signifikante Leistungsverbesserung wurde bei hoch polaren Biopolymeren wie Oligo- und Polynucleotiden beobachtet. Diese verbesserte Auflösung ist für die massenspektrometrische Bewertung von DNA-Sequenzierungsleitern (ladders) wesentlich.
4a bis b veranschaulicht Verbesserungen der Massenauflösungen bei Oligonucleotiden mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. 4a ist ein Spektrum einer 22 mer DNA-Probe, aufgezeichnet von einer herkömmlichen MALDI. Es wurde eine Massenauflösung von 281 erhalten. 4b ist ein Spektrum der gleichen 22 meren DNA-Probe, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer, der Merkmale vorliegender Erfindung, wie beansprucht, veranschaulicht. Die Massenauflösung in 4b entspricht dem Isotopen-Grenzwert. Für ein kleines Protein der gleichen Molekülmasse 500 oder 600 ist die Massenauflösung mit einer herkömmlichen MALDI-Massenspektrometrie Routine. Somit gibt es siginifikante Verbesserungen der Auflösung in der MALDI-TOF-Massenspektrometrie von DNA und Kohlehydraten durch Einbeziehung der Prinzipien vorliegender Erfindung, wie beansprucht.
Ein Vorteil des MALDI-TOF-Massenspektrometers ist die Fähigkeit, die ursprüngliche kinetische Energiestreuung auf eine höhere Ordnung durch Verwendung eines Ionenreflektors mit dem Massenspektrometer und richtige Auswahl der Betriebsparameter zu korrigieren.
5 ist ein schematisches Diagramm eines Flugzeit-Massenspektrometers mit einer Laser/Desorption, der einen einstufigen Ionenreflektor 150 umfasst. Dieses Beispiel umfasst eine zweifache Ionenquelle 152 mit einem Halter 154 und einem ersten Element 156 sowie zweiten Element 158. Stromversorgungen (nicht gezeigt) sind mit dem Halter 154 und dem ersten Element 156 und zweiten Element 158 derart verbunden, dass das elektrische Feld zwischen dem ersten Element 156 und dem Halter 1574 vor der im Text zu 2 beschriebenen Ionenextraktion variabel ist. Dieses Beispiel umfasst auch einen Laser 159 zum Ionisieren und Desorbieren von Probeionen. In Nähe des Halters 154 ist eine Probe 160 angeordnet. Die Probe 160 kann ein Matrixmolekül, das bei der Wellenlänge des Lasers 158 hoch absorbierend ist, umfassen; die Matrix erleichtert die Desorption und Ionisation der Probe 160.
Der Ionenreflektor 150 ist am Ende eines feldfreien Driftbereichs 162 angeordnet und wird zum Ausgleich der Wirkungen der anfänglichen kinetischen Energieverteilung durch Modifizieren der Flugbahn der Ionen verwendet. Ein erster Detektor 164 wird zur Erkennung von mit dem Ionenreflektor 150 entaktivierten Ionen verwendet. Ein zweiter Detektor 166 wird zur Erkennung von mit dem Ionenreflektor 150 erregten Ionen benutzt.
Der Ionenreflektor 150 ist am Ende des feldfreien Driftbereichs 162 und vor dem ersten Detektor 164 angebracht. Der Ionenreflektor 150 besteht aus einer Reihe von Ringen 168 mit Vorspannungspotentialen, welche auf ein Niveau ansteigen, das etwas größer als die Beschleunigungsspannung ist. Beim Betrieb werden sie, wenn die Ionen den Reflektor 150 durchdringen, gebremst, bis ihre Geschwindigkeit in Richtung des Feldes 0 wird. Am Punkt der Geschwindigkeit 0 kehren die Ionen ihre Richtung um und werden durch den Reflektor 150 zurück beschleunigt. Die Ionen verlassen den Reflektor 150 mit Energien, die mit ihrer Eintrittsenergie identisch sind, jedoch mit Geschwindigkeiten in der entgegengesetzten Richtung. Ionen mit größeren Energien dringen tiefer in den Reflektor 150 ein und verbleiben infolgedessen eine länger Zeit im Reflektor. Die Potentiale werden ausgewählt, um die Flugbahnen der Ionen zu modifizieren, so dass Ionen gleicher Masse und Ladung zur gleichen Zeit den zweiten Detektor 166 erreichen.
6a bis b veranschaulichen Auflösungen einer Massenauflösung von nahezu 8.000 für eine RNA-12 mer-Probe und eine Massenauflösung von etwa 5.500 für eine RNA 16-mer-Probe, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer mit einem Reflektor. Die beobachtete Auflösung bei diesen Beispielen stellt eine Untergrenze dar, da die Digitalisierungsrate der Detektorelektronik nicht ausreicht, reelle Peakprofile in diesem Auflösungsbereich zu erkennen. Eine vergleichbare Leistung kann bei Peptiden und Proteinen erhalten werden. Infolgedessen verbessert vorliegende Erfindung, wie beansprucht, die Auflösung von allen Arten von Biopolymeren. Dies steht im Gegensatz zur herkömmlichen MALDI, wo die Auflösung und Empfindlichkeit bei Oligonucleotiden im Vergleich zu Peptiden und Proteinen beträchtlich herabgesetzt ist.
Ein anderer Vorteil eines MALDI-TOF-Massenspektrometers ist die Fähigkeit, die Anzahl von Kollisionen hoher Energie zu verringern. Unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Ionenextraktion, werden Ionen durch eine verhältnismäßig dichte Federwolke (plume) aus abgeschmolzenem Material unmittelbar nach Eintritt der Ionisation extrahiert. Kollisionen hoher Energie (höher als thermische Energien) führen während der Beschleunigungsphase zu schnellen Fragmentierungsprozessen, welche zu einem nicht-übereinstimmenden Ionensignal Anlass geben. Dieses nicht-übereinstimmende Ionensignal kann das Rauschen in den Massenspektren signifikant erhöhen. In einem Massenspektrometer können Parameter wie das elektrische Feld vor und während der Ionenextraktion sowie die Extraktionszeitverzögerung so ausgewählt werden, dass die Federwolke des abgeschmolzenen Materials sich genügend ausgedehnt hat, um die Anzahl von Kollisionen hoher Energie zu verringern.
Vorliegende Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zum Verbessern der Auflösung in der MALDI-TOF-Massenspektrometrie durch Verringern der Anzahl von Kollisionen hoher Energie während der Ionenextraktion. Ein Potential wird an den Probehalter, in dessen Nähe eine Probe angeordnet ist, angelegt. Die Probe umfasst eine oder mehrere Arten zu analysierender Moleküle. Ein Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter ein erstes elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt. Die Probe wird mit einem Laser ionisiert, welcher einen Energieimpuls zum Abschmelzen einer Wolke von Ionen und neutralen Teilchen erzeugt.
Entweder am Probehalter oder am ersten Element wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation ein zweites Potential angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter oder ersten Element ein zweites elektrisches Feld zwischen der Probe und dem ersten Element umschreibt. Das zweite elektrische Feld extrahiert die Ionen nach der zuvor festgelegten Zeit. Die vorbestimmte Zeit ist lang genug, um zu ermöglichen, dass die Wolke von Ionen und neutralen Teilchen sich genug ausdehnt, um das Hinzufügen von Kollisionsenergie zu den Ionen während der Ionenextraktion im wesentlichen auszuschalten. Die zuvor festgelegte Zeit kann größer als die Zeit sein, in der die mittlere freie Bahn der Ionen in der Wolke den Abstand zwischen dem Halter und dem ersten Element überschreitet.
Das Verfahren kann auch die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das zusammen mit dem Potential am ersten Element ein elektrisches Feld zwischen dem ersten und zweiten Element zur Ionenbeschleunigung umschreibt.
Parameter wie Größe und Richtung des ersten und des zweiten elektrischen Felds und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Feldes werden so gewählt, dass die Verzögerungszeit lange genug ist, um zu ermöglichen, dass die Federwolke von neutralen Teilchen und Ionen, welche in Reaktion auf das Anlegen des Laserimpulses erzeugt wird, ausreichend in das Vakuum expandiert, so dass weitere Kollisionen zwischen Ionen und neutralen Teilchen unwahrscheinlich sind. Parameter werden auch gewählt, um zu gewährleisten, dass Probeionen einer ausgewählten Masse mit optimaler Massenauflösung erkannt werden. Die Parameter können von Hand oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerschnittstelle und eines Computeralgorithmus bestimmt werden. Das Verfahren kann auch das Analysieren zumindest einer Verbindung vom biologischem Interesse, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetischen Varianten besteht, oder mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlenhydraten, Glycokonjugaten und Glycoproteinen besteht. Die Probe kann eine Matrixsubstanz, welche bei der Wellenlänge des Laserimpulses absorbiert, umfassen, um die Desorption und Ionisation der biologischen Moleküle zu erleichtern.
Vorliegende Erfindung, wie beansprucht, ermöglicht auch ein Verfahren zur Herabsetzung der Intensität des Matrixsignals bei der Matrix-unterstützten Flugzeit-Massenspektrometrie mit Laserdesorption/ionisation. Das Verfahren umfasst das Einbeziehen eines Matrixmoleküls in eine Probe. Ein erstes Potential wird an dem Probehalter angelegt. Ein Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, um zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld zu schaffen, welches die Probe vor dem Extraktionsimpuls umgekehrt vorspannt. Eine umgekehrte Vorspannung wird erreicht, indem man das Potential des ersten Elements bezüglich des Potentials des Probehalters positiver für das Messen positiver Ionen und negativer für das Messen negativer Ionen macht.
Eine in Nähe des Halters angeordnete Probe wird mit einem Laser bestrahlt, der einen Energieimpuls erzeugt. Die Matrix absorbiert die Energie und erleichtert die Desorption und Ionisation der Probe und der Matrix. Das erste elektrische Feld wird ausgewählt, um die von der Probe erzeugten Ionen zu bremsen. Dieses Feld verlangsamt die Ionen und richtet sie zurück zur Probenoberfläche mit einer nahezu gleichmäßigen Anfangsgeschwindigkeit. Die leichteste Matrix mit dem niedersten Verhältnis Masse zu Ladung wird zuerst zur Rückkehr veranlasst und am Probehalter naturalisiert, während die schwere Ionen von Biomolekülen für die Massenanalyse extrahiert werden können.
Ein zweites Potential wird an den Probehalter zu einer vorbestimmten Zeit nach dem Energieimpuls angelegt, welches ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zur Beschleunigung der Ionen weg von der Probenoberfläche schafft. Die Zeit zwischen dem Laserimpuls und dem Anlegen des zweiten Potentials wird so gewählt, dass im wesentlichen alle Matrixionen zur Probeoberfläche rückgeführt werden, wo sie neutralisiert werden. Infolgedessen werden Matrixionen unterdrückt, während die Probeionen extrahiert werden.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das ein elektrisches Feld zwischen dem ersten und zweiten Element zur Ionenbeschleunigung schafft. Parameter wie Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so gewählt, dass Matrixionen mit einer Masse, die geringer als die zuerst ausgewählte Masse ist, unterdrückt werden, während Probeionen mit einer Masse, die größer alls die ausgewählte zweite Masse ist, mit einer optimalen Massenauflösung erkannt werden. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerschnittstelle und Computeralgorithmus bestimmt werden.
Das Verfahren kann das Analysieren einer Probe umfassen, die mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetische Varianten besteht, oder mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlehydraten, Glycoconjugaten und Glycoproteinen besteht.
Das Verfahren umfasst auch die Stufe der Erregung eines vom ersten Element beabstandeten Ionenreflektors. Die Anwendung des Reflektors führt zu einer höheren Ordnung der Korrektion für die Energiestreuung im Ionenstrahl, und wenn sie in dieses Verfahren einbezogen wird, führt sie zu einer höheren Massenauflösung.
7a bis c veranschaulicht eine Verringerung und Ausschaltung des Matrixsignals mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. 7a zeigt nahezu feldfreie Bedingungen, wo das elektrische Potential der Probe annähernd dem Potential am Gitter entspricht.
Probepeaks werden mit 2867 und 5734 markiert. Peaks unterhalb eines Verhältnisses Masse zu Ladung von 400 entsprechen Matrixionen. In 7b ist das Probenpotential bezüglich des ersten Gitters mit 25 V umgekehrt vorgespannt. Dies führt zu einer sichtbaren Herabsetzung der großen Anzahl der leichteren Matrixionen unter ein Verhältnis von Masse zu Ladung von 200. In 7c ist das Probenpotential bezüglich des ersten Gitters mit 50 V umgekehrt vorgespannt. Dies führt zu einem vollständigen Ausschluss des Matrixionensignals.
Ein anderer Vorteil eines MALDI-TOF-Massenspektrometers ist die Fähigkeit, die Wirkungen schneller Fragmentierung auf das Hintergrundrauschen und die Massenauflösung auszuschalten. Eine schnelle Fragmentierung ist als eine Fragmentierung, welche während der Beschleunigung unter den Bedingungen einer kontinuierlichen Ionenextraktion stattfindet, definiert. Die Zeitskala einer schnellen Fragmentierung ist typischerweise weniger als 1 μSekunden. Eine schnelle Fragmentierung führt zu Ionen schlecht definierter Energien und einem nicht-überstimmenden Rauschen (chemisches Rauschen).
Vorliegende Erfindung, wie beansprucht, ermöglicht auch ein Verfahren zur Herabsetzung des chemischen Hintergrundrauschens in einer Matrix-unterstützten Flugzeit-Massenspektrometrie mit Laserdesorption/ionisation, indem man Zeit zum Abschluss in wesentlichem aller schnellen Fragmentation vor der Ionenextraktion einräumt. Ein Matrixmolekül wird in eine, ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfassende Probe eingearbeitet, so dass die Matrixsubstanz eine intakte Desorption und Ionisation erleichtert. Ein Potential wird an dem Probehalter angelegt. Ein Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential des Probehalters ein erstes elektrisches Feld zwischen der Probe und dem ersten Element umschreibt.
Die Probe wird mit einem Laser ionisiert, welcher einen Energieimpuls erzeugt, wobei die Matrix bei der Wellenlänge des Lasers absorbiert. An dem Probehalter wird zu einer vorbestimmten Zeit nach der Ionisation ein zweites Potential angelegt, welches zusammen mit dem Potential am ersten Element ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt, um die Ionen zu extrahieren. Die vorbestimmte Zeit ist lang genug, um den Abschluss im wesentlichen der ganzen schnellen Fragmentationsprozesse zu ermöglichen.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das zusammen mit dem Potential am ersten Element zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Ionenbeschleunigung umschreibt.
Parameter wie die Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so gewählt, dass die Zeitverzögerung lang genug ist, um zu ermöglichen, dass im wesentlichen sämtliche schnelle Fragmentierungsprozesse vollständig sind. Die Parameter werden auch so gewählt, dass Ionen einer ausgewählten Masse mit einer optimalen Massenauflösung erkannt werden. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerschnittstelle und eines Computeralgorithmus bestimmt werden.
Das Verfahren kann das Analysieren einer Probe, die zumindest eine Verbindung von biologischem Interesse, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetischen Varianten besteht, oder mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlehydraten, Glycokonjugaten und Glycoproteinen besteht.
Ferner umfasst das Verfahren die Stufe der Erregung eines vom ersten Element beabstandeten Ionenreflektors. Die Anwendung des Reflektors führt zu einer höheren Ordnungskorrektur für die Energiestreuung im Ionenstrahl, und wenn sie in dieses Verfahren einbezogen wird, führt sie zu einer höheren Massenauflösung.
Ein anderer Vorteil eines MALDI-TOF-Massenspektrometers ist die Fähigkeit, ein übereinstimmendes Ionensignal für eine schnelle Fragmentierung zu erzeugen. Dies kann erreicht werden, indem man die Ionenextraktion verzögert, bis im wesentlichen alle schnelle Fragmentierungsprozesse vollständig sind. Es kann dann eine Beziehung zwischen dem Ionensignal und der chemischen Struktur oder Sequenz der Probe aufgestellt werden.
Ein anderer Vorteil eines MALDI-TOF-Massenspektrometers ist, dass die Ausbeute an Fragment-Ionen durch richtige Auswahl experimenteller Parameter erhöht werden kann, wie z. B. durch das umgekehrte vorgespannte elektrische Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element vor der Ionenextraktion, der Verzögerungszeit zwischen dem Laserenergieimpuls und der Ionenextraktion sowie die Laserenergiedichte. Dies kann erreicht werden, indem man entweder die Verweilzeit von Vorläuferionen in der Ionenquelle vor der Extraktion erhöht oder einen zusätzlichen Energietransfer zu den Probemolekülen, welche eine schnelle Fragmentierung eingehen, fördert. Die Verweilzeit von Vorläuferionen kann durch geeignete Einstellung des extrahierenden elektrischen Feldes ausgedehnt werden. Typischerweise erlaubt ein geringeres Extraktionsfeld eine längere optimale Extraktionsverzögerung und damit eine längere Verweilzeit. Der Energietransfer zur Probe kann unter Verwendung eines Lasers mit sehr hohen Energiedichten erhöht werden. Eine verzögerte Ionenextraktion ist einer übermäßigen Laserbestrahlung gegenüber toleranter als die herkömmliche MALDI. Eine richtige Auswahl des Matrixmaterials und möglicher Additive kann auch den Energietransfer zu den Probemolekülen beeinflussen.
Vorliegende Erfindung, wie beansprucht, ermöglicht ferner ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute von Sequenz-definierenden Fragment-Ionen von Biomolekülen, welche aus schnellen Fragmentierungsverfahren unter Verwendung einer Matrix-unterstützten Flugzeit-Massenspektrometrie mit Laserdesorption/ionisation stammen. Das Verfahren umfasst das Einarbeiten eines Matrixmoleküls in eine ein oder mehrere zu analysierende Moleküle umfassende Probe, um Desorption, Ionisation und Erregung des Moleküls zu erleichtern. An den Probehalter wird ein Potential angelegt. Ein Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt.
Die Moleküle werden mit einem Laser ionisiert und fragmentiert, der einen Energieimpuls erzeugt, welcher von der Matrix absorbiert wird. Ein zweites Potential wird an den Probehalter zu einer vorbestimmten Zeit nach der Ionisation angelegt, das zusammen mit dem Potential am ersten Element ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element umschreibt. Das zweite elektrische Feld extrahiert die Ionen nach der vorbestimmten Zeit. Die vorbestimmte Zeit ist lang genug, um den Abschluss im wesentlichen der ganzen schnellen Fragmentierung zu ermöglichen.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweiten Element umfassen, das zusammen mit dem Potential am ersten Element zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Ionenbeschleunigung umschreibt.
Parameter wie die Größe und Richtung des ersten und zweiten elektrischen Felds und die Zeitverzögerung zwischen dem Ionisationsimpuls und dem Anlegen des zweiten elektrischen Felds werden so gewählt, dass die Zeitverzögerung lang genug ist, um zu ermöglichen, dass im wesentlichen sämtliche schnelle Fragmentierungsprozesse vollständig sind. Die Parameter werden auch so gewählt, dass Ionen einer ausgewählten Masse mit einer optimalen Massenauflösung erkannt werden. Die Parameter können manuell oder unter Verwendung eines Computers, einer Computerschnittstelle und eines Computeralgorithmus bestimmt werden.
Das Verfahren kann die Stufe des Erkennens des Verhältnisses Masse zu Ladung der erzeugten sequenzspezifischen Fragmente und die Stufe der Identifizierung einer Sequenz mindestens eine Biomoleküls in der Probe umfassen, wobei das Biomolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetischen Varianten besteht, oder mindestens eines aus der Gruppe ausgewählten Biomoleküls, die aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlenhydraten und Glycoproteinen besteht.
Das Verfahren kann auch die Stufe der Erhöhung der Ausbeute von Fragmenten umfassen, welche durch Erhöhung des Energietransfers zum Biomolekül während der Ionisierung erzeugt werden. Der Energietransfer kann durch Auswahl einer Laserwellenlänge erhöht werden, welche annähernd der Wellenlänge gleich ist, bei der das Biomolekül absorbiert. Der Energietransfer kann auch erhöht werden, indem man in die Matrix ein Additiv einarbeitet.
Die Matrix kann ausgewählt werden, um die Fragmentierung von Biomolekülen spezifisch zu fördern. Das Biomolekül kann ein Oligonucleotid sein, und die Matrix kann mindestens eine der Verbindungen 2,5-Dihydroxybenzoesäure und Picolinsäure umfassen. Eine zweite Substanz kann zur Matrix gegeben werden, um die Fragmentierung zu fördern. Das Additiv kann bei der Wellenlänge des Laser absorbieren, ist jedoch nicht notwendigerweise als Matrix selbst wirksam. Alternativ kann das Additiv bei der Wellenlänge des Lasers nicht absorbieren, noch als Matrix selbst wirksam sein, kann jedoch den Energietransfer von der Matrix zur Probe und somit die Fragmentierung fördern.
Das Verfahren umfasst auch die Stufe der Erregung eines vom ersten Element beabstandeten Ionenreflektors. Die Anwendung des Reflektors führt zu einer höheren Ordnungskorrektur für die Energiestreuung im Ionenstrahl, und wenn sie in dieses Verfahren einbezogen wird, führt sie auch einer höheren Massenauflösung.
8a veranschaulicht eine 11 mer-DNA-Probe, welche hauptsächlich einfach und doppelt geladene intakte Ionen erzeugt, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF- Massenspektrometer, wobei das Ziel die Unterdrückung der Fragmentierung und der Erhalt einer hohen Auflösung und hohen Empfindlichkeit mit minimaler Fragmentierung ist.
8b veranschaulicht eine mit einem MALDI-Massenspektrometer aufgezeichnete 11 mer-DNA-Probe zur Erhöhung der Ausbeute an Fragment-Ionen. Die Probe wird mit einem umgekehrt vorgespannten elektrischen Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element vor der Ionenextraktion, das eine relativ lange Extraktionsverzögerung (500 ns) und eine verhältnismäßig hohe Laserenergiedichte ermöglicht. Die Fragmentierung wird ferner unter Verwendung einer Matrix aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure gefördert. Diese experimentellen Parameter führen zur Erzeugung sehr vieler Fragmentionen. Die Auslegung dieses Fragmentionenspektrums führt zur Sequenz des Oligonucleotids. Die Ionenserie „w" ist fast vollständig und definiert die Sequenz bis zu den beiden am meisten rechts stehenden Resten und stellt auch die Zusammensetzung (jedoch nicht die Sequenz) dieses Dinucleotidstücks bereit.
8c beschreibt die Nomenklatur der Fragment-Ionen.
Es gibt wichtige Anwendungen der MALDI-TOF-Massenspektrometrie, wo es vorteilhaft ist, Infrarotlaser zur Ionisation zu verwenden. Leider hat eine Anzahl von Infrarotlaser mit erwünschten Eigenschaften, wie z. B. CO₂-Laser, Impulsbreiten von mehr als 100 ns. Typischerweise ist bei der herkömmlichen MALDI-TOF-Massenspektrometrie die Anwendung derart langer Impulse unerwünscht, da die Massenspektrumpeaks infolge des längeren Ionenbildungsverfahrens übermäßig breit sind. Die Anwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrums mit verzögerter Extraktion kann jedoch die unerwünschten Wirkungen eines langen ionisierenden Laserimpulses ausschalten. In einer frühen Phase des Laserimpulses gebildete Ionen werden von der Probenoberfläche früher als diejenigen emitiert, welche in einer späten Phase des Laserimpulses gebildet werden. Während der Extraktion sind die in einer frühen Phase gebildeten Ionen weiter von der Probeoberfläche weg als die Ionen der späten Phase. Infolgedessen werden die Ionen der späten Phase auf eine leicht höhere Energie durch den Extraktionsimpuls beschleunigt. Unter optimalen Bedingungen holen die Ionen der späten Phase die Ionen der frühen Phase an der Stelle des Detektors ein.
Ein anderer Vorteil eines MALDI-TOF-Massenspektrometers ist die Fähigkeit, eine hohe Massenauflösung unter Verwendung eines Infrarotlasers mit langem Impuls zu erreichen. Ein langer Impuls ist als ein Impuls mit einer Länge definiert, die länger als die erwünschte Peakbreite eines Ionenpakets beim Erkennen ist. Mit gepulsten Ionenextraktionsinstrumenten sind erwünschte Peakbreiten typischerweise 5–500 ns. Die erwünschte Peakbreite schwankt mit dem Verhältnis Masse zu Ladung der Ionen. Sie beträgt beispielsweise 5 ns für ein mit isotopen aufgelöstes kleines Peptid und 100 ns für ein Protein mit dem Verhältnis Masse zu Ladung von 30.000. Vorliegende Erfindung, wie beansprucht, ermöglicht ferner ein Verfahren zum Verbessern der Auflösung in einer Flugzeit-Massenspektrometrie mit einer Langimpuls-Laserdesorption/ionisation. Ein erstes Potential wird an einen Probehalter angelegt. Ein zweites Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential des Probehalters zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt. Eine in Nähe des Probehalters angebrachte Probe wird unter Bildung von Ionen mit einem Infrarotlaser ionisiert, welcher einen Energieimpuls von langer Dauer erzeugt. Die Zeitdauer des Energieimpulses ist größer als 50 ns.
Das Potential am ersten Element bezüglich des Probehalters ist positiver zur Messung positiver Ionen und negativer zur Messung negativer Ionen, um Ionen durch ihre Masse vor Ionenextaktion räumlich zu trennen. Zumindest eines der ersten und zweiten Potentiale wird zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation variiert, um ein zweites unterschiedliches elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zu umschreiben, das die Ionen für einer Flugzeitmessung extrahiert. Die festgelegte Zeit kann größer als die Dauer des Laserimpulses sein.
Das Verfahren kann die Stufe des Anlegens eines Potentials an ein vom ersten Element beabstandetes zweites Element umfassen, das zusammen mit dem Potential des ersten Elements zwischen dem ersten und zweiten Element ein elektrisches Feld zur Beschleunigung der Ionen umschreibt.
Die Probe kann eine Matrixsubstanz, welche bei der Wellenlänge des Laserimpulses absorbiert, umfassen, um die Desorption und Ionisation der Probemoleküle zu erleichtern. Die Probe kann auch mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DNA, RNA, Polynucleotiden und deren synthetischen Varianten besteht, oder mindestens eine Verbindung von biologischem Interesse umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Peptiden, Proteinen, PNA, Kohlenhydraten, Glycokonjugaten und Glycoproteinen besteht.
9a bis c veranschaulicht die Fähigkeit, sehr komplizierte Oligonucleotidgemische mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer, das Merkmale dieser Erfindung zeigt, zu analysieren. 9a ist ein Massenspektrum einer 60 mer-DNA-Probe mit einem Gehalt an sequenzspezifischen Verunreinigungen, aufgezeichnet mit einem herkömmlichen MALDI-TOF-Massenspektrometer. Die Sequenz ist nicht lesbar.
9b ist ein Massenspektrum einer 60 mer-DNA-Probe mit einem Gehalt an sequenzspezifischen Verunreinigungen, aufgezeichnet mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. Mehr als die Hälfte seiner Sequenz kann aus dem Spektrum abgelesen werden. 9c stellt einen auseinander gezogenen Teil des in 9b dargestellten Massenspektrums dar. Der durch 9c angezeigte Leistungsgrad ist ausreichend, um DNA-Sequenzierungsleitern (ladders) in einer einzigen Glasampulle zu analysieren. Infolgedessen kann man unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers, das die Prinzipien vorliegender Erfindung, wie beansprucht, zeigt, ein einzelnes Sanger-Gemisch mit all seinen vorliegenden vier Reihen analysieren. Die Fähigkeit, DNA mit Verunreinigungen zu sequenzieren, ist für die Möglichkeit, DNA-Sequenzierungsgemische zu profilieren, wesentlich.
Vorliegende Erfindung ermöglicht, wie beansprucht, auch ein Verfahren zum Sequenzierung von DNA durch Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst das Anlegen eines ersten Potentials an einen Probehalter, der ein Stück von DNA mit unbekannter Sequenz umfasst. Ein zweites Potential wird an ein vom Probehalter beabstandetes erstes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential am Probehalter zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt. Die Probe wird unter Bildung von Probeionen ionisiert. Zumindest eines der ersten und zweiten Potentiale wird zu einer vorbestimmten Zeit nach der Ionisation verändert, um ein zweites elektrisches Feld zwischen dem Probehalter und dem ersten Element zu umschreiben, welches Ionen für eine Flugzeitmessung extrahiert. Das gemessene Verhältnis Masse zu Ladung der erzeugten Ionen wird benutzt, um die Sequenz des DNA-Bruchstücks zu erhalten. Die DNA in der Probe wird gespalten, um Sätze von DNA-Fragmenten zu bilden, die jeweils einen gemeinsamen Ursprung haben und bei der speziellen Base längs der DNA-Sequenz enden. Die Probe kann unterschiedliche Sätze von DNA-Fragmenten, vermischt mit einer Matrixsubstanz, die bei einer Wellenlänge absorbiert, welche im wesentlichen der Quantenenergie des Laserimpulses entspricht, absorbiert, umfassen, was die Desorption und Ionisation der Probe erleichtert. Die Massendifferenz zwischen dem ermittelten Molekulargewicht eines Peaks von einem der Sätze der DNA-Fragmente kann im Vergleich zu einem Peak eines anderen der Sätze von DNA-Fragmenten bestimmt werden.
Vorliegende Erfindung ermöglicht, wie beansprucht, ferner ein Verfahren zur Verbesserung der Auflösung bei einem Flugzeit-Massenspektrometer mit Laserdesorption/ionisation für Nucleinsäuren durch Verringerung von Kollisionen hoher Energie und Ionenladungsaustausch während der Ionenextraktion. An einen Probehalter, der eine Nucleinsäure umfasst, wird ein Potential angelegt. Ein Potential wird an ein erstes von dem Probehalter beabstandetes Element angelegt, das zusammen mit dem Potential des Probehalters zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein erstes elektrisches Feld umschreibt. Eine Probe wird unter Bildung einer Ionenwolke mit einem Laser, der einen Energieimpuls erzeugt, ionisiert. Ein zweites Potential wird an den Probehalter zu einer zuvor festgelegten Zeit nach der Ionisation angelegt, das zusammen mit dem Potential am ersten Element zwischen dem Probehalter und dem ersten Element ein zweites elektrisches Feld umschreibt und die Ionen nach der festgelegten Zeit extrahiert. Ein Potential kann an ein zweites, vom ersten Element beabstandetes Element angelegt werden, das zusammen mit dem Potential am ersten Element ein elektrisches Feld zwischen dem ersten und zweiten Element zur Ionenbeschleunigung umschreibt.
Die vorbestimmte Zeit wird so gewählt, dass sie lang genug ist, um zu ermöglichen, dass die Ionenwolke sich genug ausdehnt, um im wesentlichen den Zuwachs an Kollisionsenergie und Ladungstransfer von den Ionen während der Ionenextraktion auszuschalten wird. Die vorbestimmte Zeit kann so ausgewählt werden, dass sie größer als die Zeit ist, in der die mittlere freie Ionenbahn in der Wolke dem Abstand zwischen dem Halter und dem ersten Element annähernd gleich ist. Die vorbestimmte Zeit kann auch so gewählt werden, dass sie länger als die Zeit ist, welche für den Abschluss einer im wesentlichen gesamten schnellen Fragmentierung gebraucht wird.
Die Probe kann eine bei der Wellenlänge des Laserimpulses absorbierende Matrixsubstanz umfassen, um die Desorption und Ionisation der Probe zu erleichtern.
Vorliegende Erfindung ermöglicht, wie beansprucht, auch ein Verfahren zum Erhalt genauer Molekulargewichte bei der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ein Hauptproblem der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist, dass es schwierig ist, genaue Molekulargewichte ohne Verwendung von inneren Standards, die aus bekannten Verbindungen bestehen, für eine Probe, die eine unbekannte Verbindung enthält, zu erhalten. Leider sprechen verschiedene Proben mit weit unterschiedlichen Empfindlichkeiten an, und oftmals sind verschiedene Versuche erforderlich, bevor eine Probe, welche die richtige Menge an innerem Standard enthält, hergestellt werden kann. Auch kann der innere Standard die Messung durch Bildung von Ionen der gleichen Massen wie diejenigen einer unbekannten Probe stören. Deshalb ist es für viele Anwendungen der MALDI-TOF-Massenspektrometrie wichtig, die gemessene Flugzeit in die Masse mit einer sehr hohen Genauigkeit ohne die Verwendung innerer Standards überführen zu können.
Im Prinzip ist es möglich, die Flugzeit eines Ions beliebiger Masse so genau wie die relevanten Parameter, wie z. B. Spannungen und Abstände, zu messen. Jedoch sind in der herkömmlichen MALDI-TOF-Massenspektrometrie genaue Berechnungen im allgemeinen nicht möglich, weil die Geschwindigkeit der Ionen nach Beschleunigung nicht genau bekannt ist. Diese Ungewissheit tritt aufgrund von Kollisionen zwischen Ionen und neutralen Teilchen in der Federwolke des von der Probenoberfläche desorbierten Materials auf. Der Energieverlust bei solchen Kollisionen schwankt mit Parametern wie der Laserintensität und Masse. Infolgedessen ist die Beziehung zwischen gemessener Flugzeit und Masse von einem Spektrum zum nächsten verschieden. Um genaue Massen zu erhalten, ist es notwendig, bekannte Verbindungen mit Massen einzubeziehen, welche denjenigen der unbekannten Probe ähnlich sind, um das Spektrum genau zu eichen und die Masse der unbekannten Probe zu bestimmen.
Gemäß der beanspruchten Erfindung werden die Ionen zu Beginn in einem Bereich erzeugt, in dem das elektrische Feld schwach bis null ist.
Das Anfangsfeld kann Ionen in die Richtung beschleunigen, die derjenigen entgegengesetzt ist, in der sie schließlich extrahiert und erkannt werden. Bei diesem Verfahren wird das Anlegen des Extraktionsfeldes verzögert, so dass die Federwolke derart ausgebreitet ist, dass ein signifikanter Energieverlust infolge Kollisionen unwahrscheinlich ist. Als Ergebnis kann die Geschwindigkeit eines beliebigen Ions bei einem beliebigen Punkt im Massenspektrometer genau berechnet werden, und die Beziehung zwischen Masse und Flugzeit ist genau bekannt, so dass eine innere Eichung von Spektren nicht erforderlich ist.
Durch folgende Gleichung ist bei einer pulsierten Ionenextraktion die Masse eines Ions bis auf einen sehr hohen Nährungsgrad durch folgende Gleichung gegeben: M1/2 = A1(t + A2)(1 – A3Δt + A4t + A5t2) (5)worin t die gemessene Flugzeit in Nanosekunden ist. A₁ ist die Proportionalitätskonstante, die sich auf die Masse zur Flugzeit bezieht, wenn die Anfangsgeschwindigkeit der Ionen Null ist. A₂ ist die Zeitverzögerung in Nanosekunden zwischen dem Laserimpuls und Start des Übergangs-A/D-Wandlers. A₃ ist gering, mit der Ausnahme, wenn verzögerte Ablenkungen (sweeps) benutzt werden. Die Zeitverzögerung Δt ist die Zeit zwischen dem Laserimpuls und der Anlegung des Zugfeldes (drawout field). Die anderen Ausdrücke sind Korrekturen, welche lediglich von der Anfangsgeschwindigkeit, der Spannung am ersten Element und der Geometrie des Instruments abhängen.
Die zuvor genannten Koeffizienten können als Instrumentparameter auf folgendem Weg beschrieben werden: A1 = Vs ½(1 – αGw)/[4.569De] (6)worin De = Dzg(y), (7) ist, V_s ist die Quellenspannung in Kilovolt, D ist der feldfreie Abstand in mm, G_w ist die Leitdraht-Einstellung (% der Quellenspannung), α ist eine empirisch zu ermittelnde Konstante, g(y) = 1 + 2y½[da/D + (d0/D)(1/{y½ + 1})], (8) z = 1 + (2dm/D)(Vs/Vm){[1 + (Vm/V8]1/2-} (9)d_a ist die Länge des ersten Ionenbeschleunigungsbereichs in mm, d₀ ist die Länge des zweiten Beschleunigungsbereichs in mm, d_m ist die Länge des Beschleunigungsbereichs vor dem Elektronenvervielfacher in mm, V_m ist die vor dem Elektronenvervielfacher angelegte Spannung in Kilovolt y = Vs/(Vs – Vg) = 100/(100 – GR) (10)
G_R ist die Gittereinstellung in Prozent der Quellenspannung. Die Führungsdrahtkorrektur hängt von der am meisten wahrscheinlichen Flugbahn von Ionen um den Draht ab. Der Maximalwert von δ ist 0,005, was den durch das Driftrohr bei genau dem Leitungsdrahtpotential durchlaufenden Ionen entspricht. Es wird darauf hingewiesen, dass der tatsächliche Wert von δ etwas weniger ist als dieser, je nach Ausrichtung des Lasers.
Die Ausdrücke der höheren Ordnungskorrektur sind durch A3 = vowy ½/2 De (11), A4 = voday/2De 2 (12) A5 = vo 2dawy3/2/8De 3 (13)worin v_o die Anfangsgeschwindigkeit in mm/Nanosekunden ist und w durch w = y3/2[D/2da – (d0/da)(1 + x)] + x(do/da) – 1 (14)gegeben ist,
worin x = (Vs – Vg)/Vg = (100 – GR)/GR (15)ist.
Diese Werte gelten nur genau bei einem Betrieb mit dem ersten Feld bei 0 vor Anwendung des Zugimpulses (drawout pulse).
Bei Benutzung eines Ionenreflektors wird der wirksame Driftabstand De = Dzg(y) + 4dR/R (16)worin d_R die Länge des Spiegels in mm, und R das Verhältnis der Spiegelspannung zur Quellenspannung bedeuten. Unter Normalbetrieb des Reflektors wird die Menge w w = x(do/da) – 1 (17)
Mit diesen Veränderungen sind die Eichungsgleichungen genau die gleichen wie diejenigen, welche für den linearen Analysator verwendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass y und w in der Regel für den Reflektor viel kleiner sind, weshalb die Korrekturausdrücke ebenfalls kleiner sind.
Äquivalente
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf eine spezielle bevorzugte Ausführungsform und Beispiele, die nicht notwendigerweise Ausführungsformen sind, darstellt und beschrieben wurde, sollte vom Fachmann verstanden werden, dass verschiedene Veränderungen in Form und Einzelheiten vorgenommen werden können, ohne dass man vom Erfindungsumfang, der durch nachfolgende Patentansprüche definiert wird, abweicht.

Claims

Verfahren zur Verbesserung der Massenauflösung bei Flugzeit-Massenspektrometern durch Kompensation der Verteilung der Anfangsgeschwindigkeiten der Ionen zumindest zweiter Ordnung, wobei man a) ein erstes Potential an einen Probenhalter (154) anlegt; b) ein zweites Potential an ein erstes Element (156) anlegt, das vom Probenhalter beabstandet ist, und das, zusammen mit dem ersten Potential am Probenhalter, ein erstes, elektrisches Feld zwischen dem Probenhalter und dem ersten Element bestimmt; c) eine Probe (160), die in der Nähe des Probenhalters angeordnet ist, mit einem Puls Laserlicht (159) ionisiert, um Probeionen zu bilden; d) zumindest eines der ersten und zweiten Potentiale zu einem vorbestimmten Zeitpunkt im Anschluss an die Schritte a) bis c) variiert, um ein zweites, elektrisches Feld zwischen dem Probenhalter und dem ersten Element zu bestimmen, das verschieden ist vom ersten, elektrischen Feld, wodurch die Ionen zu einer Flugzeitmessung extrahiert werden; und e) ein Ionenreflektor (150), der zu dem ersten Element (156) beabstandet ist, energetisch aktiviert, wobei f) das erste und das zweite, elektrische Feld und der vorbestimmte Zeitpunkt so gewählt werden, dass die Flugzeit extrahierter Ionen mit gleichem Verhältnis von Masse zu Ladung vom Reflektor (150) zu einem Detektor (166) im wesentlichen unabhängig ist von der ersten und zweiten Ordnung der Anfangsgeschwindigkeit.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auflösung bei einem bestimmten Verhältnis von Masse zu Ladung verbessert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auflösung über einen bestimmten Bereich des Verhältnisses von Masse zu Ladung verbessert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste, elektrische Feld aus Schritt b) im wesentlichen Null ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste, elektrische Feld aus Schritt b) ungleich Null ist und wirksam ist, um Ionen anhand ihrer Masse vor dem Ionenextrahieren räumlich zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor der Ionenextraktion das zweite Potential am ersten Element (156) in Bezug auf das erste Potential am Probenhalter (154) positiver ist, um positive Ionen zu messen, und negativer ist, um negative Ionen zu messen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man des Weiteren ein drittes Potential an ein zweites Element (158) anlegt, das sich zwischen dem ersten Element (156) und dem Reflektor (150) befindet, um zwischen dem ersten und dem zweiten Element ein drittes, elektrisches Feld zu erzeugen, um die Ionen zu beschleunigen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe (160) eine Matrixsubstanz aufweist, die Strahlung bei einer Wellenlänge absorbiert, die im Wesentlichen dem Laserlichtpuls entspricht, wobei die Matrix die Desorption und das Ionisieren der Moleküle erleichtert.